Creación de quimeras del cerebro anterior aviar para evaluar el desarrollo facial
18 de febrero de 2021
Este artículo describe una técnica de trasplante de tejido que fue diseñada para probar las propiedades de señalización y patrones del prosencéfalo basal durante el desarrollo craneofacial.
Este método permite a los investigadores evaluar las interacciones tisulares entre el prosencéfalo basal y la cara. La principal ventaja de esta técnica es que aísla el prosencéfalo basal para la evaluación y evita la contaminación con células de la cresta neural, lo que confundiría el análisis. La parte difícil de esta técnica es la extracción del cerebro anterior del huésped y el reemplazo con el tejido del donante.
Demostrando el procedimiento estará Diane Hu, una científica investigadora del laboratorio del Dr. Ralph Marcucio. Para comenzar, prepare medios DMEM con rojo neutro, una pipeta de transferencia de vidrio y tungsteno afilado. Con una jeringa de 10 mililitros y una aguja de calibre 18, retire 0,5 mililitros de albúmina del extremo puntiagudo de la cáscara del huevo.
Haz un pequeño agujero en la parte superior de la concha usando la punta de las tijeras. Luego coloque un trozo de cinta sobre el agujero y corte una abertura circular para exponer el embrión. Mancha el embrión con rojo neutro.
Recolectar injertos de tejido del lado izquierdo del prosencéfalo basal de embriones en etapa siete u ocho. Use agujas curvas de tungsteno afiladas para incidir suavemente un pedazo del cerebro anterior. Para no incluir el endodermo subyacente, deslice la aguja debajo del cerebro anterior y paralela al eje del tubo neural.
Recoger el injerto del embrión donante utilizando la pipeta de transferencia de vidrio, y transferirlo a DMEM que contiene rojo neutro durante dos minutos para teñirlo. Luego coloque el injerto teñido en DMEM que no contenga rojo neutro hasta que esté listo para el injerto. Incubar huevos fertilizados de pollo Leghorn blanco a 37 grados centígrados en una cámara humidificada hasta la etapa siete a ocho de Hamburger-Hamilton.
Exponer los embriones como se demostró anteriormente. Usando agujas de tungsteno afiladas, prepare el sitio del injerto cortando y luego extrayendo una pieza de 0.3 por 0.2 milímetros de prosencéfalo basal para acomodar el injerto. Evite la interrupción excesiva del endodermo subyacente, que será evidente ya que los gránulos de yema comenzarán a filtrarse a través de cualquier desgarro que se haga.
Después de transferir el injerto al huésped, coloque el injerto para reemplazar el prosencéfalo basal extirpado del huésped. Coloque la cinta firmemente sobre el orificio y devuelva los embriones a la incubadora de 37 grados centígrados hasta que estén listos para el análisis. Inicialmente, las quimeras se crearon trasplantando tejidos de codorniz en embriones de pollo.
Usando el anticuerpo QCPN, las células de codorniz se visualizaron y distinguieron de los tejidos del huésped. El sistema de codorniz-polluelo confirmó que todo el injerto estaba compuesto solo de tejido neural y no estaba contaminado con otros tipos de células. El trasplante de tejido de codorniz en embriones de pato condujo a quimeras severamente deformadas debido a un cerebro de codorniz de desarrollo más rápido.
Por lo tanto, se realizó el trasplante de tejidos de pato en embriones de pollo. Las quimeras pato-polluelo resultantes sugieren que el cerebro participa en la regulación de la morfología. Se utilizó la hibridación C2 de montaña entera para evaluar la expresión del erizo sónico en quimeras.
Similar a la morfología, la expresión del erizo sónico en el lado del pato de la quimera parecía más parecida a la de un pato. La preparación del sitio host requiere práctica. Una gran cantidad de embriones no sobreviven, por lo que crear una gran cantidad de quimeras puede ayudar a garantizar muestras adecuadas para el análisis.
Este método permitió evaluar cómo las señales del cerebro dan forma al dominio de expresión del erizo sónico en la zona ectodérmica frontonasal.
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Descripción general
Este artículo describe una técnica de trasplante de tejido que permite a los investigadores evaluar las interacciones tisulares entre el prosencéfalo basal y la cara durante el desarrollo craneofacial. El método aísla el prosencéfalo basal para su evaluación, evitando la contaminación con células de la cresta neural.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Desarrollo craneofacial
- Técnicas de trasplante de tejidos
Antecedentes
- El cerebro basal desempeña un papel fundamental en el desarrollo craneofacial.
- Comprender las interacciones tisulares es esencial para la biología del desarrollo.
- La contaminación por células de la cresta neural puede dificultar el análisis.
- Aislar el cerebro basal permite una evaluación más clara de sus propiedades de señalización.
Objetivo del estudio
- Evaluar las propiedades de señalización y patrón del cerebro anterior basal.
- Desarrollar un método confiable para el trasplante de tejidos.
- Mejorar la comprensión de los mecanismos del desarrollo craneofacial.
Métodos Utilizados
- Preparación del medio DMEM con rojo neutro.
- Uso de una pipeta de transferencia de vidrio y tungsteno afilado.
- Eliminación de albúmina del extremo puntiagudo del cascarón del huevo mediante una jeringa.
- Sustitución del prosencéfalo del huésped por tejido donante.
Resultados principales
- La técnica aísla eficazmente el prosencéfalo basal para su análisis.
- Demostración del procedimiento por un científico investigador.
- Evaluación exitosa de las interacciones del tejido sin contaminación.
- Conocimientos sobre el papel del prosencéfalo basal en el desarrollo craneofacial.
Conclusiones
- La técnica de trasplante es una herramienta valiosa para estudiar el desarrollo craneofacial.
- El aislamiento del prosencéfalo basal mejora la precisión de las evaluaciones del desarrollo.
- Este método puede aplicarse a investigaciones adicionales en neurociencia del desarrollo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite una evaluación precisa de la señalización tisular en el desarrollo craneofacial mediante el aislamiento del prosencéfalo basal de las contribuciones confusas de la cresta neural. Apoya la reducción mecanicista de riesgos en la validación de objetivos al aclarar cómo las señales derivadas del cerebro regulan las vías morfogenéticas como la zona ectodérmica frontonasal de Sonic hedgehog. El enfoque proporciona un sistema relevante para enfermedades que permite evaluar las vías del desarrollo con confianza predictiva en las primeras etapas del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas sobre las interacciones entre tejido cerebral y facial en el desarrollo de vertebrados.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante el aislamiento de las propiedades de señalización del prosencéfalo basal.
- Valor predictivo: Apoya la confianza predictiva al vincular la manipulación del prosencéfalo basal con cambios en los dominios de expresión de SHH.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas quiméricos validados para la evaluación cuantitativa de la expresión de morfógenos.
- Valor operativo: Estandariza el trasplante de tejidos para obtener lecturas de ensayos reproducibles en diferentes condiciones experimentales.
- Escalabilidad: Facilita la generación de múltiples quimeras para superar las bajas tasas de supervivencia y garantizar la solidez analítica.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los hallazgos mecanicistas en fase de descubrimiento con modelos preclínicos de patrones craneofaciales.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Clarifica los reguladores upstream de SHH, una vía clave en la modelización de trastornos congénitos.
- Sistema Relevante para la Enfermedad: Utiliza quimeras aviares para estudiar mecanismos conservados del desarrollo facial en vertebrados.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, donde los ensayos de interacción con tejidos informan sobre la confianza en el blanco antes de los esfuerzos de identificación de compuestos líderes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre centros de señalización en la morfogénesis craneofacial.
- Listo para el ensayo Genera sistemas biológicos estandarizados para el análisis cuantitativo de la expresión de SHH.
- Análisis: Permite la hibridación in situ en preparaciones completas para medir cambios en la expresión génica espacial como un indicador clave.
- Investigación traslacional Proporciona continuidad mecanicista desde el trasplante de tejido neural hasta los resultados del fenotipo facial.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para evaluar las contribuciones específicas de los tejidos a las vías de desarrollo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al aislar las señales del prosencéfalo basal en el desarrollo facial.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante técnicas estandarizadas de injerto y preparación del hospedador.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al clarificar los reguladores upstream de vías farmacológicas como SHH.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en datos validados de interacciones tisulares.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo microquirúrgico de tejidos y en la manipulación de embriones de aves.
- Depende de herramientas especializadas, incluyendo agujas de tungsteno afiladas y pipetas de transferencia de vidrio.
- Necesita protocolos estandarizados de incubación y estadiamiento para embriones donantes y receptores.
- Implica la optimización de la preparación del sitio de injerto para prevenir fugas de yema y asegurar la viabilidad del receptor.
- Está limitado por bajos índices de supervivencia embrionaria, lo que requiere un gran número de muestras para un análisis confiable.
