TGF-β mediada por la transición endotelial a mesenquimal (EndMT) y la evaluación funcional de los efectores endMT utilizando la edición de genes CRISPR / Cas9

La transición endotelial a mesenquimal es un proceso celular en el cual las células endoteliales cambian su morfología del empedrado en a fibroblasto-como fenotipo. Y la citoquina TGF-beta, factor de crecimiento transformador beta, es un impulsor principal de esta transición. El análisis de los cambios en la morfología celular y los niveles de expresión de los marcadores endoteliales y mesenquimales nos permite evaluar la aparición de transición endotelial a mesenquimal.

Los datos emergentes vinculan el proceso de transición endotelial a mesenquimal con diversas enfermedades, como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la fibrosis. Y los datos sugieren que la intervención puede ser de beneficio terapéutico. Estimulando el proceso de transición endotelial a mesenquimal, que ocurre durante la embriogénesis y el desarrollo de órganos, es posible que posiblemente podamos regenerar tejidos derivados del mesenquimal como el cartílago, el hueso y el músculo.

Para detectar la proteína intracelular por tinción de inmunoflouriscencia, la permeabilización celular utilizando 0,1%Triton X-100 es necesaria para permitir que los anticuerpos pasen a través de las membranas celulares. Con esta demostración en video, los investigadores obtendrán una buena comprensión de cómo investigar el papel de citoquinas como TGF-beta en la transición endotelial a mesenquimal. En primer lugar, la semilla 1 x 10 ^ 5 reflejando las células endoteliales ms1 islote pancreático en DMEM complementado con 10% FBS y 100 unidades por mililitro de penicilina y estreptomicina en una placa de cultivo 0,1% recubierta de gelatina.

Después de la incubación durante la noche en la incubadora de cultivos celulares, lave las células con PBS antes de tratar con dos mililitros de 0.25%tripsina, 0.02%solución de EDTA durante dos minutos a 37 grados Celsius. Cuando las células han comenzado a desprenderse, apagar la reacción con cinco mililitros de medio de cultivo completo y transferir la suspensión celular resultante a un tubo de 15 mililitros para la centrifugación. Resuspend el pellet en cuatro mililitros de medio completo fresco para contar.

Y sembrar 1 X 10^3 celdas por centímetro cúbico en un nuevo contenedor de cultivo celular. Después de la cultura durante la noche, trate dos pozos con cinco inhibidores micromolares sb-beta de la cinasa del receptor SB-431542 y dos pozos con control solvente de DMSO. Y coloque las células en la incubadora de cultivos celulares durante 30 minutos.

Al final de la incubación, tratar dos pozos con control de vehículo y dos pozos con TGF-beta 2. Después de tres días, utilice un microscopio invertido para examinar la morfología celular de cada grupo de tratamiento celular bajo imágenes de campo brillante. Para evaluar cambios endMT-relacionados del marcador por la coloración inmunofluorescente, desprenda las células de un cultivo celular apropiado MS1, según lo demostrado.

Y sembrar las células a una concentración de 1,9 X 10^3 células en vasos de cubierta redonda de 12 milímetros recubiertos de gelatina al 0,1% colocados dentro de pozos individuales de una placa de 24 pozos. Después del cultivo nocturno, trate las células con un nanogramo mililitro de TGF-beta 2 durante tres días. Al final de la incubación, lave las células con PBS y fije los cultivos tratados con 300 microlitros de formaldehído al 4% por pozo durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Al final de la fijación, lavar las células tres veces con PBS antes de permeabilizar las células con 300 microlitros de 0,1%Triton X-100 y PBS por pozo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lave las células tres veces en PBS y bloquee las células con 3% de BSA en PBS. Después de 45 minutos a temperatura ambiente, etiquete las células con anticuerpos primarios PECAM-1 y SM22-alfa durante 45 minutos a temperatura ambiente, seguidos de tres lavados en PBS.

Después del último lavado, incube las células con los anticuerpos secundarios apropiados durante 45 minutos a temperatura ambiente y lave las células tres veces con PBS antes de montar las células con un medio de montaje complementado con DAPI y un resbalón de cubierta. Luego selle los bordes del resbalón de la cubierta con esmalte de uñas transparente e imagen de la expresión del marcador celular por microscopía confocal de fluorescencia utilizando los filtros apropiados de acuerdo con los protocolos de imagen estándar. Después de tres días de tratamiento con TGF-beta 2, las células endoteliales MS1 pierden su adoquinado-como estructura y se distinguen en mesenquimal-como las células spindle-shaped.

Esta diferenciación inducida por TGF-beta 2 se suprime cuando las células se exponen al inhibidor sb-431542 de la cinasa del receptor TGF-beta. La expresión de la proteína endotelial PECAM-1 se disminuye robustamente después de la estimulación TGF-beta 2, mientras que el factor mesenquimal SM-22 alfa es profundamente upregulated. Además, Snail es marcadamente upregulated por TGF-beta 2 exposición mientras que la expresión de no se ve afectada.

Como se observó, la edición del gen CRISPR-Cas9 se puede utilizar para facilitar la introducción de dos RNAs independientes de guía única de Snail en las células MS1 que expresan Cas9 para interrumpir la expresión de Snail. El knockout de Snail es suficiente para inhibir fibroblasto-como la morfología de la célula conducida por TGF-beta 2 en células MS1 y para bloquear la disminución mediada TGF-beta 2 PECAM-1 y el realce alfa SM-22. La evaluación de los cambios en la morfología celular y la expresión de marcadores endoteliales y mesenquimales por inmunofluorescencia se puede validar aún más midiendo la expresión de estos marcadores en pcr cuantitativa en el análisis de Western blot.

Esta técnica para detectar la transición endotelial a mesenquimal ha permitido a los investigadores investigar esta importancia emergente como un proceso fisiológico que ocurre en múltiples enfermedades.