Name: Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a cuantificar la síntesis de novo de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetamiento metabólico con ácido acético 14C y cromatografía en capa delgada. Este método permite analizar múltiples muestras simultáneamente.

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Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de Henne por su ayuda y asesoramiento conceptual para completar este estudio. W.M.H. cuenta con el apoyo de fondos de la Fundación Welch (I-1873), el NIH NIGMS (GM119768), el Fondo de Investigación Médica Ara Paresghian y el Programa de Becarios Dotados del Suroeste de UT. S.R ha sido apoyada por una subvención del programa T32 (5T32GM008297).

1. Crecimiento y etiquetado de células de levadura con ácido 14C-acético
<ol><li>Inocular un cultivo de levadura recogiendo una colonia de una placa y dispensándola en 20 ml de medios sintéticos completos (SC) que contienen 2% de dextrosa (consulte el Archivo complementario para la receta de medios SC). Incubar a 30 °C durante la noche con agitación a 200 rpm. NOTA: La condición de crecimiento, el volumen de la muestra y el tratamiento diferirán según los lípidos de interés. Antes de ejecutar experimentos completos, las condiciones óptimas de crecimiento y los volúmenes de cultivo deben determinarse empíricamente. Este protocolo discute el radiomarcado de cultivos de levadura cultivados en fase estacionaria, una fase de crecimiento cuando el crecimiento de biomembranas y células se ralentiza, y la síntesis de NL es muy activa.</li>
	<li>Mida el OD600 del cultivo nocturno utilizando un espectrofotómetro y diluya el cultivo de células de levadura a un OD600 final de 0.2 en 50 mL de medios SC frescos que contengan 2% de dextrosa. Cultive las células durante 24 h, o hasta que hayan alcanzado la fase estacionaria (que comúnmente se define por un revestimiento plano de la célula que duplica la medición de OD600).</li>
	<li>Antes de recopilar las celdas, haga el búfer de enfriamiento (consulte Archivo complementario para obtener más información). Haga dos alícuotas de 20 ml de tampón de enfriamiento para cada muestra (es decir, búfer de enfriamiento de 40 ml para cada muestra) y divida uniformemente en dos tubos cónicos de 50 ml). Almacene las alícuotas del búfer de enfriamiento a -80 °C para su uso futuro.</li>
	<li>Una vez que los cultivos han alcanzado la OD o fase de crecimiento deseada, recoger las células centrifugando a 4.100 x g durante 10 min. Mientras las muestras están en la centrífuga, prepare medios de radiomarcado agregando[1-14C] sal de sodio de ácido acético a los medios SC libres de dextrosa a una concentración final de 10 μCi/mL. PRECAUCIÓN: Se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado todo el tiempo cuando se trabaja con materiales radiactivos. Siempre siga las pautas locales para el almacenamiento, uso y eliminación adecuados de materiales radiactivos. NOTA: Tanto la concentración de ácido 14C-acético en el medio de etiquetado como el tiempo de incubación del radiomarcado deben ajustarse de acuerdo con el(los) metabolito(s) de interés. Aquí, se utiliza una incubación de pulsos de radiomarcado de 20 minutos, que es suficiente para etiquetar especies de NL con un rango de abundancia.</li>
	<li>Retire el sobrenadante de las células peletadas y lave el gránulo celular una vez con 20 ml de medios SC libres de dextrosa resuspiendo el pellet con una pipeta. Recoger las células de nuevo centrifugando a 4.100 x g durante 5 min.</li>
	<li>Resuspend las células en 1 ml de medios SC libres de dextrosa y transfiera las células a un tubo de microcentrífuga de 2 ml etiquetado. Recoger las células de nuevo centrifugando a 4.100 x g durante 2 min.</li>
	<li>Resuspend las células una vez más en 500 μL de medios SC libres de dextrosa. Preenfríe una centrífuga equipada para tubos cónicos de 50 ml a -10 °C o en el ajuste de temperatura más bajo.</li>
	<li>Comience el período de radiomarcado agregando rápidamente 500 μL de medios de radiomarcado a cada 500 μL de suspensión celular (concentración final de 14C-ácido acético = 5 μCi/mL). Incubar los tubos en una incubadora giratoria a 30 °C durante 20 min. 2 min antes del final del período de etiquetado, transferir una alícuota de 20 ml de tampón de enfriamiento para cada muestra del congelador de -80 °C a un cubo de hielo</li>
	<li>Una vez que el período de radioetiquetado haya terminado, use una pipeta para sumergir toda la muestra de 1 ml en 20 ml de tampón de enfriamiento en frío. Vórtice los tubos cónicos durante 5-10 s para asegurarse de que la muestra se haya mezclado completamente con el búfer de enfriamiento. Incubar las muestras en tampón de enfriamiento durante 2 min sobre hielo.</li>
	<li>Recoger el pellet celular girando en una centrífuga a 5.000 x g durante 3 min ajustado a -10 °C o en el ajuste de temperatura más bajo. Mientras los tubos de muestra están girando, transfiera otro conjunto de alícuota de tampón de enfriamiento del congelador de -80 °C a un cubo lleno de hielo (es decir, un tubo de 20 ml de tampón de enfriamiento por muestra).</li>
	<li>Retire el sobrenadante de tampón de enfriamiento de los gránulos de celda y reemplácelo con un tampón de enfriamiento fresco, frío y de 20 ml. Vórtice y agite las muestras hasta que el pellet haya sido desalojado del fondo del tubo cónico y resuspendido completamente en el tampón de enfriamiento. Centrifugar las muestras de nuevo a 5.000 x g durante 3 min a -10 °C para recoger las células.</li>
	<li>Una vez que las células estén peletadas, retire completamente todo el tampón de enfriamiento de las muestras vertiendo el sobrenadante y eliminando el exceso con una pipeta. Almacene los tubos a -80 °C para su posterior procesamiento.</li>
</ol>2. Aislamiento de lípidos totales de levadura
NOTA: El siguiente protocolo para el aislamiento de lípidos se basa en un método bien establecido y de uso frecuente que extrae eficientemente la mayoría de las especies de lípidos neutros17,18. PRECAUCIÓN: Cuando use solvente orgánico, siempre use el EPP apropiado y trabaje dentro de una campana de humos cuando sea posible. Durante la extracción de lípidos, evite el uso de plásticos que sean incompatibles con los disolventes orgánicos. Los tubos de polipropileno son adecuados para el siguiente protocolo.
<ol><li>Pesar 0,3 g de perlas de vidrio lavadas con ácido para cada muestra y almacenarlas en tubos de microcentrífuga de 2 ml sobre hielo. Retire los gránulos de célula del congelador de -80 °C y manténgalos en hielo. Agregue 350 μL de metanol y 700 μL de cloroformo a cada muestra, resuspenda y transfiérala a tubos de microcentrífuga que contengan perlas de vidrio prepesadas.</li>
	<li>Lise las células agitando tubos en un vórtice 3x durante 1 min, con incubaciones de 30 s en hielo entre agitaciones. Alternativamente, las células se pueden lisar usando un mini batidor de cuentas durante tres ciclos de 1 minuto. Guarde 25-30 μL de lisato de células enteras en un tubo separado para el conteo de centelleo. NOTA: El lisato guardado se utilizará para determinar la cantidad relativa de radioisótopos absorbidos por cada muestra durante el período de pulso, lo que influirá en la cantidad de cada muestra cargada en la placa TLC. Esto se analiza más a fondo en el paso 3.2.</li>
	<li>Vierta todo el contenido del tubo de microcentrífuga de 2 ml en un tubo de centrífuga de vidrio de 15 ml [Tubo A]. Lave los tubos de microcentrífuga de 2 ml agregando 1 ml de metanol y vórtice durante 10-15 s. Transfiera el lavado de metanol de 1 ml al tubo A y agregue 2 ml de cloroformo al tubo A seguido de 400 μL de agua para un volumen de muestra final de 4,45 ml.</li>
	<li>Muestras de vórtice durante 1 min seguidas de una centrifugación de 5 min a 1.000 x g. Después de la centrifugación, las fases acuosa (superior) y orgánica (inferior) deben separarse visualmente claramente con restos celulares que yacen en la interfaz.</li>
	<li>Usando una pipeta Pasteur de vidrio, recoja la fase orgánica del tubo A y muévase a un nuevo tubo centrífuga de vidrio de 15 ml (tubo B). Añadir 1 mL de 1M KCl al tubo B. Para el tubo A, agregue 1 ml de metanol y 2 ml de cloroformo, y 200 μL de agua MiliQ. Repita los pasos de vórtice y centrifugación en el tubo A.</li>
	<li>Una vez más, recoja la fase orgánica del tubo A y agréguela al tubo B. Deseche el tubo A en un recipiente apropiado. Tubo de vórtice B durante 1 min seguido de una centrifugación de 5 min a 1.000 x g.</li>
	<li>Retire la capa acuosa superior del tubo B y deséchela. Añadir 1 ml de KCl fresco de 1 M al tubo B y repetir el paso de vórtice/centrifugación. Una vez que las capas estén separadas, recoja cuidadosamente toda la capa orgánica inferior en un vial de vidrio de 4 ml etiquetado. NOTA: En este paso, los extractos de lípidos se pueden almacenar a -80 ° C, o el protocolo se puede continuar para la separación de lípidos TLC.</li>
</ol>3. Separación y cuantificación de NLs radioisótopos mediante cromatografía de capa delgada
<ol><li>Si los extractos de lípidos se colocaron a -80 ° C, lleve lentamente a temperatura ambiente incubando en hielo y posteriormente en una mesa de trabajo. Evapore completamente el disolvente de los extractos de lípidos mediante secado al vacío o utilizando una corriente suave de gas inerte (por ejemplo, argón o nitrógeno). Mientras tanto, precaliente un horno a 145 °C para calentar la placa TLC.</li>
	<li>Antes de que las muestras puedan cargarse en la placa TLC, determine las cantidades relativas de radioetiquetas tomadas por las células. Pipetear 10 μL de la célula entera lisar desde el paso 2.2 en un vial de centelleo de vidrio de 6 ml, agregar 6 ml de líquido de centelleo y colocar los viales en un estante. Utilice un contador de centelleo para medir el cpm o dpm de cada muestra utilizando la opción de recuento único de bastidor establecida en un tiempo de recuento de 1 minuto. Mida cada célula entera lisada por duplicado para obtener un promedio para cada muestra. Ajuste la cantidad de carga de acuerdo con un tipo salvaje o una muestra de referencia NOTA: La cantidad de cada muestra a cargar en la placa TLC se puede determinar utilizando la siguiente ecuación: (recuentos de muestras promedio) / (recuentos de referencia promedio) x volumen de carga deseado. Por ejemplo, si 20 μL de la muestra de referencia se va a cargar en la placa TLC, y tiene un recuento promedio de 1.000, entonces una muestra experimental con un recuento promedio de 2.000 tendrá 10 μL cargado en la placa TLC.</li>
	<li>Reconstituir los lípidos de la muestra en 40-50 μL de cloroformo:metanol 1:1 (v/v%) mediante vórtice durante 5 min. Preparar 101 ml del disolvente de fase móvil en un cilindro graduado de vidrio (consulte la sección resultados representativos para ver un ejemplo de la separación de las principales especies de NL por un disolvente 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexano:Éter de petróleo:Éter dietílico:Disolvente de ácido acético).</li>
	<li>Vierta el disolvente en una cámara TLC de vidrio que contenga una almohadilla de saturación TLC de 20 x 20 y una tapa hermética. Prepare una placa canalizada de gel de sílice de 20 x 20 G marcando suavemente una línea a 1,5 cm sobre la parte inferior de la placa con un lápiz. La línea designa el origen y dónde se cargarán los lípidos. Debajo de la línea, etiquete suavemente la muestra que se cargará en cada carril. Una vez que la placa TLC haya sido preparada, incuba la placa en un horno de 145 °C durante al menos 30 minutos para precalentar la placa y eliminar el exceso de humedad.</li>
	<li>Una vez que la placa se haya calentado lo suficiente y la almohadilla de saturación de TLC esté saturada de disolvente, retire la placa de TLC del horno e inmediatamente proceda a cargar la placa de TLC. Cargar la placa mientras está caliente garantiza una rápida evaporación del disolvente. Para cada especie lipídica de interés, cargue 5-20 μg de un estándar de lípidos purificados en un carril de la placa TLC para rastrear la separación y la distancia de migración esperada. Usando una pipeta, ubíque 5μL de muestra en el origen de cada carril ubicado a 1,5 cm por encima de la parte inferior de la placa TLC. Repita la carga de 5 puntos de μL hasta que se hayan cargado 20-40 μL de muestra en cada carril. NOTA: Se pueden agregar 5-20 μg de lípidos purificados sin etiquetar a cada carril de muestra como trazadores que se pueden teñir y visualizar después de la separación TLC de lípidos. La presencia de un estándar teñido permite un fácil seguimiento y escisión de bandas lipídicas radiomarcadas para el posterior conteo de centelleo. Los estándares purificados que se carguen en la placa serán determinados por la especie NL de interés. Consulte la sección Resultados representativos para ver ejemplos de separación de ácido oleico (FFA), 1,2 dioleoil-glicerol (DG), trioleína (TG), colesterol (Chol), colesteril-linoleato (SE) y escualeno en carriles adyacentes a los carriles de muestra.</li>
	<li>Una vez cargadas las muestras estándar y experimentales, coloque la placa en la cámara de desarrollo y espere hasta que el disolvente haya llegado a la parte superior de la placa (40-60 min). Una vez que la placa esté completamente desarrollada, retírela de la cámara y déjala secar en la campana extractora de humos durante 20 minutos.</li>
	<li>Después de secar la placa, cúbrala con una película de plástico y colóquela en un casete en desarrollo con una pantalla de autoradiografía. Deje que la placa se desarrolle con la pantalla durante 24-48 h.</li>
</ol>4. Visualización y cuantificación de lípidos separados por TLC
<ol><li>Retire la pantalla del cassette en desarrollo y colóquela dentro de un reproductor de imágenes de fósforo. Seleccione la opción Imagen de fósforo y desarrolle a 800-1000 V. NOTA: Las imágenes de fósforo dan una visión cualitativa de los lípidos radiomarcados en la placa TLC. Sin embargo, la cuantificación de los lípidos radiomarcados se logra mejor mediante el conteo de centelleo, que se describe posteriormente.</li>
	<li>Mezcle 100 ml de reactivo de p-anisaldehído (ver Archivo Suplementario)y deposite en una botella de spray de vidrio. Rocíe la placa TLC con reactivo de p-anisaldehído hasta que la sílice esté saturada. Hornea el plato en un horno de 145 °C durante 5 min, o hasta que hayan aparecido bandas.</li>
	<li>Para cuantificar especies de lípidos individuales utilizando el conteo de centelleo de radioetiquetas, use una cuchilla de afeitar para raspar el gel de sílice de la placa TLC de vidrio. Transfiera cada banda de gel de sílice correspondiente a una sola especie lipídica radiomarcada a un vial de centelleo de vidrio y agregue 6 ml de líquido de centelleo. Vórtice vigorosamente hasta que la banda de sílice se haya reducido a pedazos pequeños.<ol>
<li>Alternativamente, los lípidos se pueden extraer de la banda de gel de sílice utilizando el protocolo de extracción de lípidos en la sección 3. Si se extraen lípidos del gel de sílice, evapore el disolvente por completo como en el paso 3.1 y agregue 6 ml de líquido de centelleo a los lípidos secos. Coloque el estante que contiene los viales de centelleo en un contador de centelleo. Seleccione la opción Contar bastidor único y ajuste el tiempo de recuento a 2 minutos por vial. Los resultados del contador de centelleo se imprimirán y se pueden visualizar como un gráfico de barras.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos en la preparación de este manuscrito.

Aquí, se presenta un protocolo de radioetiquetado versátil para monitorear cuantitativamente la síntesis de especies de NL en levaduras. Este protocolo es muy modular, lo que permite que el procedimiento finalice en 3-6 días. Además, existe una gran cantidad de literatura sobre el uso de TLC para separar especies lipídicas y metabolitos, lo que debería permitir al usuario detectar varias especies lipídicas de interés con un simple cambio de los sistemas de solventes TLC16,<sup class="xr...

La acetil-CoA es el bloque de construcción fundamental de diversas biomoléculas, incluidos los lípidos neutros (ML), que sirven como una moneda biomolecular versátil para construir membranas, generar ATP y regular la señalización celular1,2. La disponibilidad de NLs para ser desviados a cualquiera de estas vías respectivas está, en parte, regulada por su almacenamiento. Las gotas lipídicas (LDE), orgánulos citoplasmáticos compuestos por núcleos hidrofóbicos de triglicéridos (TG) y ésteres de esteroles (SE), son los principales compartimentos de almacenamiento de la mayoría de las NEL celulares. Como tal, los LDE secuestran y regulan los NLs, que pueden ser degradados y posteriormente utilizados para procesos bioquímicos y metabólicos3,4. Se sabe que la mala regulación de las proteínas asociadas a NL y LD se correlaciona con la aparición de patologías que incluyen lipodistrofia y síndromes metabólicos5,6. Debido a esto, la investigación actual de LD se centra intensamente en cómo la síntesis de NL se regula espacialmente, temporalmente y a través de distintos tejidos de organismos multicelulares. Debido a las funciones celulares ubicuas para las NLs, muchas enzimas responsables de la síntesis y regulación de las NLs se conservan a lo largo de los eucariotas7. De hecho, incluso algunos procariotas almacenan NLs en LDs8. Por lo tanto, los organismos modelo genéticamente tratables como Saccharomyces cerevisiae (levadura en ciernes) han sido útiles para el estudio de la síntesis y regulación de NL.
La separación y cuantificación de NLs de extractos celulares se puede lograr de muchas maneras, incluyendo cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y cromatografía líquida de ultra rendimiento-espectrometría de masas (UPLC-MS)9,10,11. Quizás el método más simple para separar las NLs es a través de la cromatografía de capa delgada (TLC), que permite la cuantificación densitométrica posterior a partir de una curva estándar12,13. Aunque TLC proporciona solo una separación de NLs de grano de curso, sigue siendo una técnica poderosa porque es económica y permite la rápida separación de NLs de varias muestras simultáneamente. Dos de los desafíos más considerables que enfrenta el estudio de las NL a través de TLC son: 1) la amplia gama de abundancias celulares de las especies de NL y sus intermedios, y 2) el rango de hidrofilicidad / hidrofobicidad de los intermedios lipídicos dentro de las vías de síntesis de NL. En consecuencia, la cuantificación de las especies nl a través de TLC se restringe típicamente a las especies más abundantes; sin embargo, la introducción de una radioetiqueta de ácido acético 14C puede mejorar significativamente la detección de intermedios de baja abundancia dentro de las vías NL. El ácido acético se convierte rápidamente en acetil-CoA por la acetil-CoA sintetasa ACS214,que hace que el ácido 14C-acético sea un sustrato de radiomarcado adecuado enlevaduras 15. Además, la separación tanto de las NLs hidrofóbicas como de los intermedios hidrófilos de las NLs puede lograrse mediante el uso de múltiples sistemas de disolventes16. Aquí, se presenta un método para la separación de NLs utilizando el etiquetado metabólico de ácido C-acético 14en levadura. Los lípidos etiquetados durante el período de pulso se aíslan posteriormente mediante un protocolo de aislamiento lipídico total bien establecido17,seguido de la separación de las especies de NL por TLC. El desarrollo de placas TLC tanto por autoradiografía para visualizar lípidos etiquetados, como por un spray químico para visualizar lípidos totales, permite múltiples métodos de cuantificación. Las bandas lipídicas individuales también se pueden extraer fácilmente de la placa TLC utilizando una cuchilla de afeitar, y el conteo de centelleo se puede usar para cuantificar la cantidad de material radiomarcado dentro de la banda.

<table><tbody><tr><td>[1-C14] Actividad específica de la sal sódica del ácido acético: 45-60mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC084H001MC</td><td></td></tr><tr><td>18:1 1,2 dioleoil-sn-glicerol</td><td>Avanti</td><td>800811O</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto de 200 pruebas</td><td>Sigma</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de vidrio lavadas con ácido 425-600um</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Bombillas de ámbar para pipetas Pastuer</td><td>Fisher</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amonio >99%</td><td>Sigma</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 contador de centelleo</td><td>PerkinElmer</td><td>A481000</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo (grado HPLC)</td><td>Fisher</td><td>C607SK</td><td></td></tr><tr><td>Colesterol >99%</td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Colesteril-linoleato >98%</td><td>Sigma</td><td>C0289</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico concentrado</td><td>Sigma</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50mL tubos cónicos, polipropileno con tapón centrador</td><td>Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa, grado anhidro</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Éter dietílico grado anhidro</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Horno de secado</td><td>Fisher</td><td>11-475-155</td><td></td></tr><tr><td>EcoLume líquido de centelleo</td><td>Centrífuga VWR</td><td>IC88247001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R</td><td>Fisher</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>GE Criba de fósforo</td><td>de almacenamiento Sigma</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>GE Typhoon FLA9500 Generador de imágenes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial, grado ACS</td><td>Sigma</td><td></td> 695092 <td></td></tr><tr><td>vidrio Viales de centelleo de 6 ml Sigma</td><td></td><td>M1901</td><td></td></tr><tr><td>Tapas de tubos de centrífuga de vidrio</td><td>Fisher</td><td>14-595-36A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de vidrio</td><td>Fisher</td><td>14-595-35A</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de vidrio</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hexano, grado anhidro</td><td>Sigma</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>L-Adenina >99%</td><td>Sigma</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina >98%</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina >99%</td><td>Sigma</td><td>A1270000</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagina >98%</td><td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartato >98%</td><td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína >97%</td><td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico sal monosódica monohidrato >98%</td><td>Sigma</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina >99%</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-glicina >99%</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>L-histidina >99%</td><td>Sigma</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucina >98%</td><td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-leucina >98%</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-lisina >98%</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina, grado</td><td>HPLC Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanina, grado reactivo</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-prolina >99%</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-serina >99%</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-teronina, grado reactivo</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-triptófano >98%</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-tirosina >98%</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-uracilo >99%</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-valina >98%</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, grado ACS</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico >99%</td><td>Sigma</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>p-anisaldehído</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td></td></tr><tr><td>Éter de petróleo, grado ACS</td><td>Sigma</td><td>184519</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidilcolina, dipalmitoil >99%</td><td>Sigma</td><td>P1652</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>2231000713</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio, grado ACS</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de hidróxido de sodio, certificado ACS</td><td>Fisher</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Escualeno >98%</td><td>Sigma</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>Ácido succínico cristalino/certificado</td><td>Fisher</td><td>110-15-6</td><td></td></tr><tr><td>TLC almohadilla de saturación</td><td>Sigma</td><td>Z265225</td><td></td></tr><tr><td>TLC gel de sílice 60G placa canalizada de vidrio</td><td>Fisher</td><td>NC9825743</td><td>Sin indicadores fluorescentes</td></tr><tr><td>Película plástica</td><td>de transparencia Apollo</td><td>829903</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Trioleína >99%</td><td>Sigma</td><td>T7140</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Casete de exposición Whatman</td><td>Sigma</td><td>WHA29175523</td><td></td></tr><tr><td>Base de nitrógeno de levadura sin sulfato de amonio y aminoácidos</td><td>Sigma</td><td>Y1251</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de síntesis de lípidos neutros en saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Los lípidos neutros (NL) son una clase de biomoléculas hidrofóbicas y sin carga que desempeñan un papel clave en la homeostasis energética y lipídica. Las NL se sintetizan de novo a partir de acetil-CoA y están presentes principalmente en eucariotas en forma de triglicéridos (TG) y ésteres de esteroles (SE). Las enzimas responsables de la síntesis de NLs están altamente conservadas desde Saccharomyces cerevisiae (levadura) a los humanos, lo que hace de la levadura un organismo modelo útil para diseccionar la función y regulación de las enzimas del metabolismo NL. Si bien se sabe mucho sobre cómo el acetil-CoA se convierte en un conjunto diverso de especies de NL, todavía se están descubriendo mecanismos para regular las enzimas del metabolismo de NL y cómo la mala regulación puede contribuir a las patologías celulares. Numerosos métodos para el aislamiento y la caracterización de especies de NL se han desarrollado y utilizado durante décadas de investigación; sin embargo, no se ha discutido un protocolo cuantitativo y simple para la caracterización integral de las principales especies de NL. Aquí, se presenta un método simple y adaptable para cuantificar la síntesis de novo de las principales especies de NL en levaduras. Aplicamos 14etiquetas metabólicas de ácido C-acético junto con cromatografía de capa delgada para separar y cuantificar una amplia gama de NL fisiológicamente importantes. Además, este método se puede aplicar fácilmente para estudiar las tasas de reacción in vivo de las enzimas NL o la degradación de las especies nl a lo largo del tiempo.

En este protocolo, hemos demostrado que el etiquetado, la detección y la cuantificación de las especies de NL se pueden lograr mediante el etiquetado metabólico de ácido C-acético 14. Las principales especies de NL se pueden separar en un sistema solvente de 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Hexano:Éter de petróleo:Éter dietílico:Ácido acético (Figura 1A,B). Las imágenes de fósforo permiten la visualización de ácidos grasos libres (FFA), triacilglicerol (TG), diacilglicerol (...

Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido 14C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.

Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Esta técnica utiliza instrumentos que se encuentran comúnmente en la mayoría de los entornos de laboratorio y permite el análisis de varias muestras simultáneamente. Este método puede proporcionar información clave sobre cómo se regulan las enzimas del metabolismo de los lípidos en un contexto celular y en diferentes antecedentes genéticos. Inocular una colonia de una placa de cultivo de levadura en 20 mililitros de medios SC que contengan 2% de dextrosa e incubar a 30 grados Celsius durante la noche con agitación a 200 rpm.Al día siguiente, diluya el cultivo en 50 mililitros de medios frescos a un OD final de 0.2 y cultive durante 24 horas hasta que se alcance la fase estacionaria. Prepare dos alícuotas de 20 mililitros de tampón de enfriamiento para cada muestra y guárdelas a menos 80 grados centígrados. Simultáneamente, prepare medios de radiomarcado agregando sal de sodio de ácido acético a los medios SC libres de dextrosa a una concentración final de 10 microcurie por mililitro.Recoger las células centrifugando a 4, 100 x g durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y lave el pellet celular una vez con 20 mililitros de medios SC libres de dextrosa. Recoja las células de nuevo centrifugando a 4, 100 x g durante cinco minutos y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros etiquetado utilizando medios libres de diestro.Centrifugar las células durante otros dos minutos. Resuspend las células en 500 microlitros de medios SC libres de dextrosa y comenzar el período de radioetiquetado agregando rápidamente 500 microlitros de medios de radiomarcado a cada suspensión celular. Incubar los tubos en una incubadora giratoria a 30 grados centígrados durante 20 minutos.Mientras tanto, preenfríe la centrífuga equipada para tubos cónicos de 50 mililitros a menos 10 grados centígrados y descongele una alícuota de 20 mililitros de tampón de enfriamiento. Una vez que el período de radioetiquetado haya terminado, use una pipeta para sumergir toda la muestra de un mililitro en un tampón de enfriamiento descongelado en hielo. Recoja el pellet celular girando en una centrífuga preenfriada a 5, 000 x g durante tres minutos y agregue 20 mililitros de tampón de enfriamiento en frío fresco.Vórtice y agite las muestras para resuspendírlas completamente en el tampón de enfriamiento y centrifugar las muestras nuevamente para recolectar las células. Una vez que las células estén peletadas, retire completamente todo el tampón de enfriamiento de las muestras vertiendo el sobrenadante y eliminando el exceso con una pipeta. Guarde los tubos a menos 80 grados centígrados para su posterior procesamiento.Pesar 0,3 gramos de perlas de vidrio lavado con ácido para cada muestra y almacenarlas en dos tubos de microcentrífuga de mililitros sobre hielo. Retire los gránulos de la celda del congelador de menos 80 grados y colóquelos sobre hielo. Luego, agregue 350 microlitros de metanol y 700 microlitros de cloroformo a cada muestra y resuspenda las células.Transfiéralos a tubos de micro centrífuga que contengan perlas de vidrio prepesadas. Lise las células vórtice tres veces durante un minuto, con 30 segundos de incubación en hielo entre agitaciones. Vierta las células en un tubo centrífugo de vidrio de 15 mililitros y etiquete el tubo como tubo A.Lave el tubo de microcentrífuga con un mililitro de metanol, vórtice y vierta el metanol en el tubo A.Agregue dos mililitros de cloroformo seguidos de 400 microlitros de agua al tubo A para un volumen de muestra final de 4.45 mililitros.Vórtice las muestras durante un minuto seguido de una centrifugación de cinco minutos a 1000 x g para separar claramente las fases acuosa y orgánica con restos celulares que yacen en la interfaz. Usando una pipeta de pasto de vidrio, recoja la fase orgánica en un nuevo tubo de centrífuga de vidrio etiquetado como B y agregue un mililitro de cloruro de potasio molar. Agregue un mililitro de metanol y dos mililitros de cloroformo al tubo A y repita los pasos de vórtice y centrifugación.Vórtice y tubo centrífugo B para separar la fase acuosa y orgánica. Retire la capa acuosa superior y recoja toda la capa orgánica inferior en un vial de vidrio de cuatro mililitros. Evapore completamente el disolvente de los extractos de lípidos secándolo bajo gas inerte y precaliente un horno a 145 grados celsius para calentar la placa TLC.Determine las cantidades relativas de radioetiquetas tomadas por las células antes de cargarlas en la placa TLC. Reconstituir los lípidos de la muestra en 40 a 50 microlitros de cloroformo y metanol mezclados en una proporción de uno a uno mediante vórtice durante cinco minutos. Prepare 101 mililitros del disolvente de fase móvil en un cilindro graduado de vidrio.Luego, vierta el solvente en una cámara TLC de vidrio que contenga una almohadilla de saturación TLC de 20 por 20 y una tapa de ajuste hermética. Prepara una placa canalizada de gel de sílice 60G de 20 por 20 y marca una línea a 1,5 centímetros por encima de la parte inferior de la placa con un lápiz. Una vez que la placa se haya calentado lo suficiente y la almohadilla de saturación de TLC esté saturada de disolvente, retire la placa de TLC del horno y proceda inmediatamente a cargarla.Usando una pipeta, ubíque cinco microlitros de muestra en el origen de cada carril ubicado a 1,5 centímetros por encima de la parte inferior de la placa TLC y repita la carga hasta que se hayan cargado de 20 a 40 microlitros de muestra en cada carril. Una vez que se hayan cargado el estándar y las muestras, coloque la placa en la cámara de desarrollo y espere hasta que el disolvente haya llegado a la parte superior de la placa. Cuando la placa esté completamente desarrollada, retírela de la cámara y déjala secar en la campana extractora de humos durante 20 minutos.Después de secar la placa, cúbrala con una película de plástico y colóquela en un casete en desarrollo con una pantalla de autoradiografía. Retire la pantalla del casete en desarrollo y colóquela dentro de un reproductor de imágenes de fósforo. Rocíe la placa TLC con el reactivo de p-anisaldehído hasta que la sílice esté saturada, luego hornéelo en un horno de 145 grados durante cinco minutos o hasta que hayan aparecido bandas.Para cuantificar las especies lipídicas, raspe el gel de sílice que contiene especies de lípidos individuales y transfiéralos a viales de centelleo de vidrio. Agregue seis mililitros de líquido de centelleo y vórtice vigorosamente hasta que la banda de sílice se haya reducido a trozos pequeños. Coloque la rejilla con los viales de centelleo en un contador de centelleo y cuente ajustando el tiempo de recuento a dos minutos por vial.Las imágenes de fósforo permiten la visualización del autorradiograma de ácidos grasos libres de etiquetas, triacilglicerol, diacilglicerol, colesterol y escualano. Se demostró que las especies de lípidos purificados pueden separarse en este método y posteriormente visualizarse mediante la pulverización de la placa TLC con reactivo de p-anisaldehído. Las especies visualizadas incluyen todos los lípidos mencionados anteriormente, además de los ésteres estériles.Al aplicar un período de persecución de 10 minutos en medios sin radioetiquetas después del pulso, se observó que en el grupo principal de escualano desapareció y el colesterol total se elevó. Del mismo modo, la aparición de diacilglicerol en el período de persecución se correlacionó con una disminución en la señal de ácidos grasos libres. Antes de realizar el protocolo completo, es importante determinar si las células tomarán la radioetiqueta de ácido acético en la condición de crecimiento y los antecedentes genéticos de interés.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Se describe un nuevo método cuantitativo para la identificación de lipidómica numerosas especies de lípidos en la levadura con la encuesta de exploración de ionización electrospray espectrometría de masas (ESI / MS). Este método supera actualmente los métodos disponibles para la identificación y cuantificación de los lípidos en la capacidad de resolver diferentes formas moleculares de los lípidos, la sensibilidad y la velocidad.

Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray

13 C-etiquetado de isótopos es una técnica útil para determinar el metabolismo de la célula central para varios tipos de microorganismos. Después las células han sido cultivadas con un sustrato marcado, GC-MS medición puede revelar las vías metabólicas funcional basada en los patrones de etiquetado único en proteinogenic aminoácidos.

Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de 13 C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos

Se presentan sólidos métodos bioquímicos y microscópicos para el estudio...

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Aquí se describe un método robusto para el fraccionamiento de las membranas de plasma de plantas en las membranas solubles resistentes y detergentes detergente a base de una mezcla de no marcado e in vivo completamente 15 N cultivos de células de Arabidopsis thaliana etiquetados. El procedimiento se aplica para los estudios proteómicos comparativos para entender los procesos de señalización.

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Aquí, describimos un protocolo para obtener el lípido gotitas índice (LD) para estudiar la dinámica de triacilgliceroles en las células cultivadas en experimentos de alto rendimiento. El ensayo de índice de LD es un método sencillo y fiable que utiliza BODIPY 493/503. Este ensayo no es necesario dispendious extracción o análisis de la microscopia.

Determinación de índice de lípidos por la recuperación de líquido de la fluorescencia en el hongo patógeno Ustilago Maydis

El protocolo aquí descrito se basa en la cuantificación del genoma de mRNA recién sintetizada purificada de células de levadura con 4-tiouracilo. Este método permite para medir la síntesis de mRNA desacoplado del decaimiento del mRNA y por lo tanto, proporciona una medida exacta de la transcripción del RNA polimerasa II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Aquí, presentamos una implementación de MATLAB de detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos en imágenes de microscopía de fluorescencia de fission y células de levadura en ciernes.

Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

Los protocolos describen métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento acoplados al índice de refracción o a la detección espectrométrica de masas para estudiar reacciones metabólicas en sistemas complejos libres de células basados en lisato.

Cromatografía líquida acoplada a la detección de índice de refracción o espectrometría de masas para perfiles de metabolitos en sistemas libres de células basados en lisato

Aprende a cuantificar la síntesis de novo de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetamiento metabólico con ácido acético 14C y cromatografía en capa delgada. Este método permite analizar múltiples muestras simultáneamente.

Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada (Video) | JoVE Journal

Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

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