Name: Co-cultivo De Glioblastoma Células Madre-como En Las Neuronas Modeladas Para Estudiar La Migración Y Las Interacciones Celulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprende el ensayo de co-cultivo de células de glioblastoma con neuronas para estudiar la migración tumoral y las interacciones celulares. Este método permite cuantificar la capacidad invasiva con alta reproducibilidad.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Este trabajo fue apoyado por fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole cuenta con el apoyo de la Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon ha recibido una beca del Hospital Universitario de Toulouse (CHU Toulouse).

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes (del Hospital Haukeland, Bergen, Noruega, de acuerdo con las regulaciones del comité de ética local). Este protocolo sigue las directrices de los comités de ética de la investigación humana y animal de la Universidad de Burdeos. Las ratas embarazadas fueron alojadas y tratadas en las instalaciones para animales de la Universidad de Burdeos. La eutanasia de una rata embarazada de E18-timed fue realizada usando elCO2. Todos los procedimientos para animales se han realizado de acuerdo con las directrices institucionales y aprobados por el comité de ética local. Todos los productos comerciales están referenciados en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de las diapositivas modeladas
<ol><li>Preparación de sustrato para micropatterning<ol>
<li>Trate las cubiertas de vidrio circulares de 18 mm por activación de aire / plasma durante 5 min. Coloque los cubrebocas en una cámara cerrada con 100 μL de trietoxisilano (3-aminopropil) en un desecador durante 1 h.</li>
		<li>Incubar con 100 mg/mL de poli (etilenglicol)-valerato de succinimidilo (peso molecular 5.000 (Peg-SVA)) en tampón de carbonato de 10 mM, pH > 8, durante 1 h. Enjuague extensivamente con agua ultrapura y séquela bajo una capucha química. NOTA: En esta etapa, la muestra se puede almacenar a 4 °C en la oscuridad para su uso posterior.</li>
		<li>Añadir el fotoiniciador, cloruro de 4-benzoilbencil-trimetilamonio (PLPP), a 14,7 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS). NOTA: También se puede utilizar una forma concentrada de PLPP, un gel PLPP. Da como resultado un tiempo de iluminación ultravioleta (UV) más corto requerido para degradar el cepillo PEG (100 mJ / mm2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deposición de gel fotoiniciador<ol>
<li>Preparar una mezcla de 3 μL de gel PLPP y 50 μL de etanol absoluto para depositar en el centro del portaobjetos. Coloque la muestra bajo una campana química hasta la evaporación completa del etanol absoluto. NOTA: En esta etapa, la muestra se puede almacenar a 4 °C en la oscuridad para su uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Micropatterning de diapositivas de vidrio<ol>
<li>Monte el cubrebocas en una cámara Ludin y colótelo en la etapa motorizada de un microscopio equipado con un sistema de enfoque automático.</li>
		<li>Cargue las imágenes correspondientes a los micropatrones previstos en el software. Aplicar estos parámetros: replicación 4 x 4 veces, espaciamiento de 200 μm,dosis UV de 1.000 mJ/mm2. Después de la secuencia automática de iluminación UV, enjuague el PLPP con múltiples lavados de PBS. NOTA: Si se utilizó gel PLPP, retírelo mediante lavados extensos con agua desionizada, seque en una corriente de N2,y guárdelo a 4 °C.</li>
		<li>Incubar con laminina (50 μg/mL en PBS) durante 30 min. Lavar extensivamente con PBS. NOTA: Una solución fluorescente de proteína fluorescente verde purificada (GFP, 10 μg/mL en PBS) se puede mezclar con laminina para visualizar los micropatrones por microscopía de fluorescencia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparación de neuronas y células GBM para co-cultivo
<ol><li>Cultivo de neuronas del hipocampo de rata embrionaria<ol>
<li>Diseccione el hipocampo de ratas embrionarias (E18) y transfiera el tejido a una solución salina equilibrada de Hank (HBSS)/1 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinametanosulfónico ácido (HEPES)/penicilina-estreptomicina en un tubo de 15 mL. Retire el exceso de solución sin secar el hipocampo.</li>
		<li>Añadir 5 mL de tripsina-etilendiamina tetraacético (EDTA) suplementado con penicilina (10.000 unidades/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) y 1 mM de HEPES, e incubar durante 15 min a 37 °C. Lavar 2 veces con la solución HBSS/HEPES/penicilina-estreptomicina, y dejar que el tejido permanezca en esta solución durante 2-3 min.</li>
		<li>Disociar el tejido utilizando dos pipetas Pasteur pulidas con llama, pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces con cada tejido, teniendo cuidado de minimizar la formación de espuma. Cuente las células y evalúe la viabilidad de la suspensión celular. Placa de las neuronas en micropatterned coverslips como se indica a continuación. NOTA: La tasa de viabilidad celular es del 85-90% después de la extracción.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultivo celular para neuronas en coverslips micropatterned<ol>
<li>Rehidrate los portaobjetos micropatterned del cristal con PBS, e incube el medio neuronal completo del cultivo celular.</li>
		<li>Semilla de las neuronas del hipocampo obtenidas de las ratas de E18 Sprague-Dawley directamente sobre el micropatterned el coverslip de cristal en una densidad de 50.000 células por elcm2 en el medio neurobasal (NBM) enriquecido con el suero del caballo del 3%. Colocar las neuronas micropatterned en la incubadora (37 °C, 5%CO2)durante 48 h. NOTA: Después de ~ 6 h, las neuronas del hipocampo primarias se pueden ver adhiriéndose a los micropatrones de laminina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Co-cultivo de células madre humanas GBM en las neuronas NOTA: Para este estudio, las células gbm GFP-positivas de la membrana y del paciente-tomate nuclear-derivadas fueron crecidas según protocolos publicados anteriores10.<ol>
<li>A medida que las células en forma de esferoide crecen en suspensión, centrífuga la suspensión durante 5 min a 200 × g. Lave los esferoides con 5 mL de PBS e incube las células con 0,5 mL del reactivo de disociación celular (consulte la Tabla de materiales)durante 5 min a 37 °C.</li>
		<li>Añadir 4,5 mL de NBM completo (complementado con suplemento B27, heparina, factor de crecimiento de fibroblastos 2, penicilina y estreptomicina, como se describió anteriormente8),y contar las células mediante una técnica de recuento automático.</li>
		<li>Semilla 1.000 células GBM sobre el cultivo neuronal micropatterned en NBM enriquecido con suero de caballo al 3%. Incubar la placa a 37 °C, 5% deCO2,y 95% de humedad.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Imágenes de células vivas
<ol><li>Inmediatamente después de la siembra de células GBM, coloque la muestra en el escenario de un microscopio invertido equipado con una cámara de termostato. Realice la proyección de imagen de la vivo-célula en el microscopio equipado de una etapa motorizada para registrar posiciones múltiples usando una caja de herramientas multidimensionales de las adquisiciones en el software. Adquiera imágenes de GFP/Tomate de campo brillante y epifluorescencia cada 5 minutos durante 12 h con un objetivo de 20x en un ambiente de temperatura (37 °C) y controlado por gas (5% CO2).</li>
</ol>4. Análisis de imágenes
NOTA: Utilizando Fiji, la pila de imágenes bidimensionales (2D) se preprocesó o procesó semiautomáticamente mediante el uso de una herramienta casera y fácil de usar (disponible en esta dirección: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), que está escrita en lenguaje de macros IJ1 (Figura 2A). El flujo de trabajo y los procedimientos automatizados se resumen en la Figura 2B.
<ol><li>Análisis de redes neuronales (Figura 2Bi)<ol>
<li>Seleccione una imagen de la pila. Haga clic con el botón derecho en la herramienta Red para abrir el cuadro de diálogo Opciones correspondiente y ajustar la configuración (por ejemplo, Umbral = Triángulo, Li, Huang..., Desenfoque gaussianoy Filtros medianos = 1, 2, 3...) para producir una segmentación precisa de las imágenes. A continuación, haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Haga clic con el botón izquierdo en la herramienta Red para activar automáticamente el siguiente procedimiento.<ol>
<li>Duplique la imagen seleccionada y divida en tres canales de color (Rojo-Gris-Verde).</li>
			<li>Seleccione el canal gris (campo brillante) y realice la mejora de estiramiento de contraste (CSE) para mejorar la separación entre diferentes áreas. Utilice el detector de borde Sobel (SED) para realizar la operación de convolución de procesamiento de señal 2D ya agrupada bajo el comando Buscar borde.</li>
			<li>Para el doble filtrado (F), aplique un desenfoque gaussiano y un filtro mediano para reducir el ruido y suavizar la señal del objeto. Convertir a máscara (CM) mediante la ejecución de algoritmos de umbral adaptados para obtener una imagen binaria (gris BIN) con píxeles negros (área de celda) y píxeles blancos (fondo). Esqueletizar (Sk) el área de la celda en una red simple (NET) y filtrar partículas (EP) en una imagen NET mediante la eliminación de partículas pequeñas no en red.</li>
			<li>Para los canales rojos y verdes (núcleo y membrana), realice el doble filtrado, conviértalo en Máscara utilizando el método de umbral adaptado y permita que bin-verde determine la morfología celular con el comando Analizar partículas.</li>
			<li>Combine todos los canales utilizando su región de interés (ROI) con el operador OR (combine) y reajuste su color inicial en una imagen RGB simple.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de motilidad unicelular (Figura 2Bii)<ol>
<li>Haga clic con el botón derecho en la herramienta Seguimiento de una sola celda para abrir el cuadro de diálogo Opciones correspondiente y ajuste la configuración (por ejemplo, Tipo de ruta = Núcleo o membrana, Umbral = Triángulo, Li, Huang..., Proyección Z = Intensidad máxima, Rebanadas de suma..., Desenfoque gaussiano y Filtros medianos = 1, 2, 3...) para producir una segmentación precisa de las imágenes. A continuación, haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Haga clic con el botón izquierdo en la herramienta de seguimiento de celda única para activar automáticamente el siguiente procedimiento.<ol>
<li>Quite el canal gris. Aplique una proyección Z en la pila, que generará una imagen correspondiente a una pila de imágenes según el tiempo (T-stack). Doble filtro y convertir a máscara de los rastros dejados por las celdas. Elimine las partículas pequeñas de la imagen BIN-rojo/verde.</li>
			<li>Mediante el roi, seleccione cada contorno del trazado de celda y active la casilla Omitir detección de bordes en el cuadro de diálogo Opciones para omitir este paso de preprocesamiento para los pasos posteriores.</li>
			<li>
Aísle el canal rojo (Tipo de rastro = Núcleo) en la pila original. Seleccione un ROI y elimine el área exterior. Filtre dos veces todas las imágenes y conviértalas a Máscara (bin-red). Determinar la posición centroide X/Y de cada núcleo binarizado.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizando una macro ya publicada para el software de hoja de cálculo13,calcule el desplazamiento cuadrático medio, la relación de direccionalidad y la velocidad media de esta celda.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de seguimiento de múltiples células (Figura 2Biii)<ol>
<li>Haga clic con el botón derecho en la herramienta Seguimiento para abrir el cuadro de diálogo Opciones correspondiente y ajustar la configuración (por ejemplo, Umbral = Triángulo, Li, Huang..., Desenfoque gaussiano y Filtros medianos = 1, 2, 3...) para producir una segmentación precisa de las imágenes. A continuación, haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Haga clic con el botón izquierdo en la herramienta de seguimiento para activar automáticamente el siguiente procedimiento.<ol>
<li>Quite el canal gris.</li>
			<li>
Divida los canales rojo y verde, doble filtroy conviértalo en Máscara.</li>
			<li>Combinar los canales utilizando la calculadora de imágenes... con el operador AND, dejando sólo la señal del núcleo que se encuentra en las membranas. NOTA: Varios plugins en Fiji se pueden utilizar para determinar la posición X/Y de varias celdas en esta imagen preprocesada binaria al mismo tiempo (ver la Tabla de Materiales).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizando una macro13descrita anteriormente, calcule la gráfica de trayectoria, el desplazamiento cuadrático medio, la relación de direccionalidad y la velocidad promedio para estas celdas.</li>
	</ol></li>
	<li>Migración de esferoides en la estera neural (Figura 2Biv)<ol>
<li>Haga clic con el botón derecho en la herramienta Migración para abrir el cuadro de diálogo Opciones correspondiente y ajustar la configuración (por ejemplo, Umbral = Triángulo, Li, Huang..., Desenfoque gaussiano y Filtros medianos = 1, 2, 3...) para producir una segmentación precisa de las imágenes. A continuación, haga clic en Aceptar.</li>
		<li>Haga clic con el botón izquierdo en la herramienta de migración para activar automáticamente el siguiente procedimiento.<ol>
<li>Quite el canal rojo.</li>
			<li>
Divida los canales verde y gris.</li>
			<li>Para el canal gris, dibuje manualmente el contorno de la estera neuronal y mida su área.</li>
			<li>Para el canal verde, filtre dos veces la pila y conviértala en Máscara. Quite el área fuera del patrón (BIN) y determine el área de celda binarizada para cada imagen. NOTA: Los parámetros descritos anteriormente se calibran cambiando sus valores haciendo clic izquierdo en el icono de interés. Este procesamiento se puede realizar manualmente. Sin embargo, para un gran número de imágenes (aproximadamente cien por adquisición), canales (generalmente 3 canales) y pasos de procesamiento, sería preferible una herramienta automatizada o semiautomatizado.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li>
<li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li>
<li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2FCXCR4+expression+in+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li>
<li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li>
<li>Boyé, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li>
<li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li>
<li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiprotein+Printing+by+Light%3FInduced+Molecular+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li>
<li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li>
<li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li>
<li>Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Advance+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519(2020).</li>
<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li>
<li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li>
<li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Los glioblastomas invaden ampliamente el parénquima mediante el uso de diferentes modos: cooptación de los vasos sanguíneos circundantes, invasión intersticial o invasión en las TMM18. Este último modo no se caracteriza bien en la literatura debido a la dificultad en encontrar los modelos ines vitro o in vivo convenientes relacionados con la invasión de WMT. Aquí, se ha propuesto un modelo simplificado en el que las neuronas de roedores cultivadas se modelaron en superficies recu...

Las gliomas malas primarias, incluyendo GBMs, son tumores devastadores, con una tasa de supervivencia media de 12 a 15 meses divulgada para los pacientes de GBM. La terapia actual se basa en la resección de la masa tumoral grande y la quimioterapia juntadas con la radioterapia, que extiende solamente la tasa de supervivencia por pocos meses. Los fracasos terapéuticos están íntimamente relacionados con la mala administración de fármacos a través de la barrera hematoencefálica (BBB) y con el crecimiento invasivo en espacios perivascularios, meninges y a lo largo de las TMM1. La invasión perivascularia, también llamada cooptación vascular, es un proceso bien estudiado, y los mecanismos moleculares están empezando a dilucidarse; sin embargo, el proceso de invasión de células GBM a lo largo de wmts no se entiende bien. Las células tumorales migran al cerebro sano a lo largo de las estructuras secundarias de Scherer2. De hecho, hace casi un siglo, Hans-Joachim Scherer describió las rutas invasivas de gbm, que ahora se conocen como satellitosis perineuronal, satellitosis perivascularia, propagación subagal, e invasión a lo largo de la WMT (Figura 1A).
Algunas quimiocinas y sus receptores, como el factor-1α derivado de células del estroma (SDF1α) y el receptor de quimioquinas C-X-C (CXCR4), pero no el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), parecen estar implicados en la invasión de WMT3. Más recientemente, se ha demostrado que un eje NOTCH1-SOX2 transcelular es una vía importante en la invasión WMT de células GBM4. Los autores describieron cómo gbm stem-like células invaden el parénquima cerebral en las neuronas parcialmente unmyelinated, lo que sugiere la destrucción de las hellas de mielina por las células GBM. Un hito se alcanzó en 2019 cuando se publicaron de formaconsecutiva tres artículos en la revista Nature, subrayando el papel de la actividad eléctrica en el desarrollo del glioma5,6. El trabajo seminal de Monje y colaboradores arrojó luz sobre el papel central de la actividad eléctrica en la secreción de neuroligina-3, que promueve el desarrollo del glioma.
Winkler y colaboradores describieron las conexiones entre las células GBM (microtubos) siendo cruciales en los pasos invasivos, y últimamente, las interacciones entre las células GBM y las neuronas a través de las sinapsis neuroglioma recientemente descritas. Esas estructuras favorecen el estímulo glutamatérgico de los receptores α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) situados en la membrana celular de GBM, que promueve el desarrollo y la invasión del tumor. La invasión de células tumorales es un proceso central en la diseminación de metástasis o focos secundarios distantes, como se observa en pacientes con GBM. Se han identificado varios factores importantes en la invasión de GBM, como la trombospondina-1, un factor de crecimiento transformante beta (proteína matricelular regulada por TGFβ, o el receptor de quimioquinas CXCR3)7,8.
Aquí, se ha descrito un modelo biomimético simplificado para estudiar la invasión gbm, en la que las neuronas se modelan en pistas de laminina, y las células GBM se siembran en ella, como uni células o como esferoides (Figura 1B). Los dos entornos experimentales están dirigidos a recapitular la invasión en las neuronas, que se observa en GBM9,10,11. Tales modelos han sido desarrollados en el pasado como biomateriales de nanofibra alineados (electrospinning core-shell) que permiten estudiar la migración celular mediante la modulación de propiedades mecánicas o químicas12. El modelo de co-cultivo descrito en este artículo permite una mejor comprensión de cómo las células GBM escapan en las neuronas mediante la definición de nuevas vías moleculares involucradas en este proceso.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropilo) trietoxisilano</td><td>Sigma</td><td>440140-100ML</td><td>El grupo amino es útil para la bioconjugación de mPEG-SVA Placa de</td></tr><tr><td>fondo redondo de 96 pocillos</td><td>Sarstedt</td><td>2582624</td><td>Se utiliza para preparar esferoides</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>Almacenado a -20 & grados; C (a largo plazo) o 4 &deg; C (a corto plazo), enzima de disociación esférica</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>Almacenado a -20 & grados; C, descongelar antes de usar</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento básico de fibroblastos</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Almacenado a -20 ° C, descongelar antes de usar</td></tr><tr><td>Countess Cámara de recuento de célulasSlides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Se utiliza para el recuento de células</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Marienfeld</td><td>111580</td><td>Sustrato de cultivo celular</td></tr><tr><td>Cartuchos desecadores Sigma</td><td></td><td>Z363456-6EA</td><td>Se utiliza para reducir la humedad durante el tratamiento con trietoxisilano (3-aminopropilo)</td></tr><tr><td>DPBS 10x</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>Almacenado a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Fiji software, MTrack2 macro</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Utilizado para analizar imágenes</td></tr><tr><td>Matraz 75 cm&sup2;</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Laminin</td><td></td><td>114956-81-9</td><td>Promueve la adhesión neuronal</td></tr> Leonardo <tr><td>software</td><td></td><td></td><td>carga de micropatrones imaginados</td></tr><tr><td>MetaMorph Software&nbsp;</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>NA</td><td>Software de automatización de microscopía</td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma</td><td>M0512</td><td>Diluido en NBM para una concentración final del 2%</td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Microscopio invertido Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td><td></td><td></td> <td>equipado con una platina motorizada&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina - Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>almacenada a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>PLPP</td><td>Alveole</td><td>PLPPclassic_1ml</td><td>Fotoiniciador utilizado para degradar el cepillo PEG</td></tr><tr><td>Valerato de poli(etilenglicol)-succinimidilo (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio</td><td>VA-PEG-VA-5000-5g</td><td>Utilizado como recubrimiento antiincrustante</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alveole</td><td>PRIMO1</td><td>Aparato de proyección UV basado en dispositivo de microespejo digital (DMD)</td></tr><tr><td>Azul de tripán 0.4%</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>Se utiliza para el recuento de células</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td>Se utiliza para separar las células adherentes</td></tr></tbody></table>

co-cultivo de glioblastoma células madre-como en las neuronas modeladas para estudiar la migración y las interacciones celulares

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Los glioblastomas (GBMs), gliomas malignos de grado IV, son uno de los tipos más mortales de cáncer humano debido a sus características agresivas. A pesar de los avances significativos en la genética de estos tumores, cómo las células GBM invaden el parénquima cerebral sano no se entiende bien. En particular, se ha demostrado que las células GBM invaden el espacio peritumoral a través de diferentes rutas; el principal interés de este trabajo es la ruta a lo largo de los tractos de materia blanca (WMTs). Las interacciones de las células tumorales con los componentes de la célula nerviosa peritumoral no están bien caracterizadas. Aquí, se ha descrito un método que evalúa el impacto de las neuronas en la invasión celular GBM. Este papel presenta un análisis in vitro avanzado de la co-cultura que mímico la invasión de WMT analizando la migración de GBM vástago-como las células en neuronas. El comportamiento de las células GBM en presencia de neuronas se monitorea mediante el uso de un procedimiento de seguimiento automatizado con software de código abierto y de libre acceso. Este método es útil para muchas aplicaciones, en particular, para estudios funcionales y mecanicistas, así como para analizar los efectos de los agentes farmacológicos que pueden bloquear la migración celular GBM en las neuronas.

Las neuronas modeladas co-cultivadas con las células fluorescentes de GBM fueron preparadas según lo descrito en la sección del protocolo, y los experimentos de seguimiento fueron realizados. Las células GBM modificaron rápidamente su forma mientras migraban sobre las neuronas (Figura 1B:panel 6 y Video 1). Las células migraron a lo largo de las extensiones neuronales, en un movimiento aleatorio (Video 1). Las células fluorescentes GBM y las...

Aquí, presentamos un ensayo de co-cultivo fácil de usar para analizar la migración de glioblastoma (GBM) en neuronas modeladas. Desarrollamos una macro en el software FiJi para una fácil cuantificación de la migración de células GBM en las neuronas, y observamos que las neuronas modifican la capacidad invasiva de las células GBM.

Co-cultivo De Glioblastoma Células Madre-como En Las Neuronas Modeladas Para Estudiar La Migración Y Las Interacciones Celulares

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

Los glioblastomas son tumores cerebrales devastadores con un alto perfil invasivo. Este sistema de co-cultivo imita la migración de las células de glioblastoma en las neuronas para recapitular una de las rutas invasivas observadas en los pacientes. La geometría y composición de nuestro modelo de co-cultivo se controla con precisión.Facilita una mejor reproducibilidad y también una cuantificación directa de procesos biológicos complejos. Este método se puede adaptar a la diagnosis clínica co-cultivando las células y las neuronas recién disociadas del glioblastoma. Define un índice clínico, que es muy importante como resultado clínico.Nuestro método también se puede utilizar para cuantificar otras células migratorias, como fibroblastos o células inmunes. Demostrando el procedimiento estará Joris Guyon, un estudiante de doctorado de mi equipo. Para hacer un sustrato para el micropatterning, tratar 18 milímetros de tapas de vidrio circulares por aire o activación de plasma durante cinco minutos antes de colocar los cubrebocas en un desecador con 100 microlitros de trietoxisilano durante una hora, a continuación, incubar una solución de PEG-SVA a 100 miligramos por mililitro durante una

co-culture-glioblastoma-stem-like-cells-on-patterned-neurons-to-study

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Un dispositivo de microfluidos en compartimientos para la investigación de la migración de células madre del cáncer se describe. Esta novedosa plataforma crea un microambiente celular viable y permite la visualización microscópica de locomoción de células vivas. Muy móviles células cancerosas se limitan a estudiar los mecanismos moleculares de la infiltración agresivo, que puede conducir a terapias más eficaces en el futuro.

Evaluación de la migración de las células madre del cáncer compartimentar Utilizando dispositivos de microfluidos y imágenes de células vivas

Este video describe un ensayo de cocultivo de células de glioblastoma en neuronas con micropatrones, que imitan la invasión de los tractos neuronales mielinizados por las células madre similares al glioblastoma a medida que migran sobre las neuronas en los espacios peritumorales. Este ensayo puede ayudar a analizar los efectos de los fármacos que inhiben la migración de las células de glioblastoma en las neuronas de un glioma.

Cocultivo de células de glioblastoma en neuronas modeladas: una técnica para monitorear la migración de células de glioblastoma en neuronas de hipocampo de rata in vitro

El cocultivo de cortes de cerebro organotípicos con células de carcinoma permite visualizar cambios morfológicos por fluorescencia, así como de campo brillante (vídeo) microscopía durante el proceso de la invasión de células de carcinoma de tejido cerebral. Este sistema modelo también permite enfoques de cambio de células y de reposición y ofrece una amplia variedad de manipulaciones y análisis.

Sistema Coculture con un cerebro rebanada organotípicos y 3D esferoide de células de carcinoma

Protocolo para la propagación de muestras quirúrgicas de glioma de alto grado disociadas en medio de neuroesfera sin suero para seleccionar células con fenotipo de células madre cancerosas. Para los especímenes que no pueden crecer como neuroesferas, se sugiere un protocolo alternativo. Una técnica de incrustación de la parafina para mantener la arquitectura 3D de la neuroesfera para el immunocytochemistry se describe.

Optimización Del Cultivo Celular De Glioma De Alto Grado De Muestras Quirúrgicas Para Su Uso En Modelos Animales Clínicamente Relevantes E Inmunoquímica 3D

Los modelos ex vivo actuales de glioblastoma (GBM) no están optimizados para el estudio fisiológicamente relevante de la invasión tumoral humana. Aquí, presentamos un protocolo para la generación y mantenimiento de cultivos de corte organotípico de tejido humano GBM fresco. Se proporciona una descripción de microscopía de lapso de tiempo y técnicas de análisis de migración celular cuantitativa.

Un Modelo de Cultura de Rebanadas Organotípicas de Glioblastoma Humano para el Estudio de la Migración de las Células Tumorales y los Efectos Específicos para el Paciente de los Medicamentos Anti-Invasivos

Comprender el comportamiento maligno del cáncer requiere crear modelos precisos de cómo las células tumorales interactúan con los componentes del microambiente tumoral, como los macrófagos. En este trabajo describimos dos métodos para estudiar la interacción de las células del glioblastoma con los macrófagos asociados al tumor y la microglía, donde se evalúa el efecto sobre la invasión del glioblastoma.

Cocultivo Los ensayos para Estudiar macrófagos y microglia Estimulación de Glioblastoma Invasion

Aquí, describimos la técnicas de imagen de células vivas para medir cuantitativamente la migración y la invasión de células de glioblastoma cerebral tumor con el tiempo y las condiciones de tratamiento múltiples.

Análisis de imágenes de células vivas para estudio Glioblastoma cerebral Tumor células madre migración y la invasión

Aquí presentamos un sistema de cultivo monocapa mixto ex-vivo para el estudio de la migración de células de glioma humano (hGC) en tiempo real. Este modelo proporciona la capacidad de observar interacciones entre hGCs y axones mielinados y no mielinizados dentro de una cámara compartimentada.

Monitoreo en tiempo real de la migración de células de glioma humano en cocultivos de axón-oligodendrocitos de ganglios de raíz dorsal

Aquí, describimos un ensayo de invasión fácil de usar para el glioblastoma. Este ensayo es adecuado para células similares al glioblastoma similares a un tallo. También se describe una macro de Fiji para cuantificar fácilmente la invasión, la migración y la proliferación.

Un modelo de esferoides 3D para Glioblastoma

Presentamos un modelo de migración de glioblastoma 3D utilizando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes generadas a partir de tumores recién diagnosticados y recurrentes. Esta plataforma permite visualizar la dinámica migratoria específica del paciente y evaluar la eficacia terapéutica. El ensayo puede multiplexarse tras la migración para evaluar la localización y los patrones de expresión de proteínas.

Ensayo reproducible de migración de glioblastoma 3D con localización esferoide mediada por nanopartículas magnéticas bajo condiciones hipóxicas

Aprende el ensayo de co-cultivo de células de glioblastoma con neuronas para estudiar la migración tumoral y las interacciones celulares. Este método permite cuantificar la capacidad invasiva con alta reproducibilidad.

Co-cultivo De Glioblastoma Células Madre-como En Las Neuronas Modeladas Para Estudiar La Migración Y Las Interacciones Celulares (Video) | JoVE Journal

Co-cultivo De Glioblastoma Células Madre-como En Las Neuronas Modeladas Para Estudiar La Migración Y Las Interacciones Celulares

Explorar más videos