Name: Preparación a gran escala de exosomas derivados de células madre mesenquimales del líquido sinovial mediante cultivo de biorreactores 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Aprende a preparar exosomas de grado GMP a gran escala a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando un biorreactor 3D. Este método optimiza la producción para aplicaciones en investigación y tratamiento clínico de artritis.

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Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81972116, Nº 81972085, Nº 81772394); Programa clave de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (No.2018B0303110003); Proyecto de Cooperación Internacional de Guangdong (No.2021A0505030011); Proyectos de Ciencia y Tecnología de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (No.2020M682907); Fundación de Investigación Básica y Aplicada de Guangdong (No.2021A1515010985); Proyecto Sanming de Medicina en Shenzhen (SZSM201612079); Fondos especiales para la construcción de hospitales de alto nivel en la provincia de Guangdong.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humana del Segundo Hospital Popular de Shenzhen. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático de exosomas aislados del protocolo in vitro hSF-MSC.
1. Cultura e identificación de SF-MSCs humanas
<ol><li>Recolectar 20 ml de SF usando una jeringa y una aguja de pacientes clínicos con OA.<ol><li>Desinfecte la articulación de la rodilla del paciente con OA. Punción del tendón femoral cuádriceps fuera de la rótula en la cavidad articular con una aguja 7#.</li>
		<li>Extraer 10 mL del líquido articular. Cubra el sitio de punción con la varilla de transfusión y presione durante 5 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Desechar el sobrenadante SF después de la centrifugación a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular con 10 ml de solución salina tampón fosfato 1x (PBS), centrifugar a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C y desechar el PBS.</li>
	<li>Resuspender el pellet con 10 ml de medio de cultivo de MSC humano a una densidad celular de 5 x 104 células/ml (ver Tabla de materiales) y luego colocar la suspensión en una placa de 100 mm.</li>
	<li>Incubar el plato a 37 °C en una atmósfera que contenga un 5% deCO2.</li>
	<li>Después de 48 h, retire las células no adherentes cambiando el medio y lave con 1x PBS. Reemplace el medio cada 3 días durante 2 semanas.</li>
	<li>Recoger los sobrenadantes de cultivo celular.</li>
	<li>Identificar SF-MSCs mediante citometría de flujo.<ol><li>Digerir la tercera generación (P3) de SF-MSC, centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y recoja el pellet celular. NOTA: Un pasaje se reconoce como el subcultivo de las células a otra placa de cultivo. Las células primarias aisladas de SF y sembradas en platos se etiquetan como paso cero (P0). En aproximadamente un 75% de confluencia, las células se digieren y se separan de los platos, se siembran en otros platos y se etiquetan como P1.</li>
		<li>Añadir 400 μL de tampón de bloqueo (1% BSA en 1x PBS) a la célula granulada (5 x 104) y dejar reposar durante 15 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 100 μL de 1x PBS.</li>
		<li>Añadir 1 μL de CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, anticuerpos fluorescentes monoclonales HLA-DR (relación de dilución 1:100) (ver Tabla de materiales) por tubo e incubar a RT durante 30 min.</li>
		<li>Lave dos veces con 1x PBS y deseche el sobrenadante. Recoger el pellet celular y resuspender en 100 μL de 1x PBS.</li>
		<li>Detecte en un citómetro de flujo hasta 10.000 células utilizando filtros de 525/50 y 585/40 para detectar los fluoróforos.</li>
	</ol></li>
</ol>2.3D cultivo celular de biorreactor
<ol><li>Preparación de microportadores<ol><li>Hinche los 0,75 g secos de microportadores (ver Tabla de materiales) e hidrátese en 1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco (50 ml / g de microportadores) durante al menos 3 h en RT.</li>
		<li>Decantar el sobrenadante y lavar los microportadores durante 5 min en DPBS frescos (50 mL/g de microportadores). Deseche el PBS y reemplácelo con 1x DPBS nuevo (50 ml / g de microportadores).</li>
		<li>Esterilizar los microportadores en autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi). Permita que los microportadores esterilizados se asienten, decanten el sobrenadante.</li>
		<li>Enjuague brevemente los microportadores en el medio de cultivo (50 ml / g de microportadores) en RT. Deje que los microportadores se asienten, deseche el sobrenadante.</li>
	</ol></li>
	<li>Biorreactor de perfusión<ol><li>Esterilizar el biorreactor en autoclave (121 °C, 15 min, 15 psi).</li>
		<li>Contar el número de SF-MSCs y asignar 2.5 x 107 SF-MSCs y microportadores al biorreactor perfundido con medio de cultivo MSC de grado GMP (250 mL).</li>
		<li>Poner el biorreactor en una incubadora con 5% deCO2 a 37 °C. Gire el biorreactor a una velocidad de 15 rpm. Cambiar el medio de cultivo cada 6 días.</li>
		<li>Recolectar los sobrenadantes y microportadores del cultivo celular para su posterior análisis después del cultivo durante 14 días.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Identificación de exosomas y detección de seguridad
<ol><li>Ultracentrifugación<ol><li>Centrifugar el sobrenadante de cultivo celular a 300 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante; Deseche los desechos celulares.</li>
		<li>Centrifugar los sobrenadantes a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante; Deseche las vesículas más grandes (cuerpos apoptóticos y algunas microvesículas más grandes).</li>
		<li>Centrifugar de nuevo el sobrenadante a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C para eliminar vesículas más grandes; recoger los pellets y resuspender en 40 mL de 1x PBS.</li>
		<li>Centrifugar los pellets resuspendidos a 120.000 x g durante 70 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y resuspender los pellets que contienen exosomas en 500 μL de 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) NOTA: Para cada corrida, se inyectaron 500 μL de la muestra en la cámara a un caudal de 30 μL/min. Realice el análisis a 24,4 °C-24,5 °C.<ol><li>Diluir las muestras de exosomas recién aisladas con 1x PBS estéril a 1 ml que contenga 107-10 9 / ml de partículas e inyectarlas en el sistema de análisis de seguimiento de nanopartículas (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Configure manualmente el sistema de captura y análisis de acuerdo con el protocolo del fabricante. Visualice las partículas mediante la dispersión de la luz láser y capture su movimiento browniano en video digital.</li>
		<li>Analice las cintas de video grabadas utilizando software (consulte la Tabla de materiales) basándose en el seguimiento de al menos 200 partículas individuales por ejecución.</li>
	</ol></li>
	<li>Microscopía electrónica de transmisión<ol><li>Fijar los exosomas en paraformaldehído al 4% (en frío 1x DPBS) durante 5 min.</li>
		<li>Monte 5 μL de los exosomas en rejillas de cobre. En este experimento, la concentración de exosomas es de 1 mg/ml cuantificada por un kit de ensayo de proteínas (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Incrustar los exosomas en ácido fosfotúngstico al 3% durante 10 minutos en hielo. Retire el exceso de ácido y seque las muestras en RT.</li>
		<li>Imagen de las muestras de exosomas por un TEM a una tensión de aceleración de 100 kV.</li>
	</ol></li>
	<li>Western blot<ol><li>Agregue 300 μL de tampón de lisis (1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.1 M Tris HCl, pH 7) y cóctel de inhibidores de proteasa (ver Tabla de materiales) a los exosomas.</li>
		<li>Mezcle los exosomas en el tampón de lisis pipeteando hacia arriba y hacia abajo y déjelo reposar sobre hielo durante 20 minutos.</li>
		<li>Centrifugar la mezcla a 9.391 x g durante 10 min a 4 °C y recoger el sobrenadante. Mida la concentración de proteína usando un kit de ensayo de proteínas (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Añadir 100 μL de tampón de carga de proteínas 4x y calentar a 100 °C durante 10 min.</li>
		<li>Cargar 15 μL de proteínas a una concentración de 10 mg/ml y funcionar mediante electroforesis en gel (120 V, 70 min) y electroblotting a 100 V, 60 min a 4 °C.</li>
		<li>Detectar los marcadores no exosomas específicos (calnexina) y los biomarcadores exosomales (CD9, CD63 y CD81) mediante Western Blot fluorescente (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Prueba de seguridad<ol><li>Para la detección de bacterias, hongos y Mycobacterium tuberculosis , siga los pasos 3.5.2-3.5.5.</li>
		<li>Sembrar 100 μL de la solución del exosoma (1 mg/ml) en una placa de cultivo de agar sangre (ver Tabla de materiales) e incubar la placa de cultivo a 37 °C durante 24 h.</li>
		<li>Sembrar 100 μL de la solución del exosoma (1 mg/ml) en una placa mediana de agar sabouraud (ver tabla de materiales) e incubar a 35 °C durante 48 h.</li>
		<li>Sembrar 100 μL de la solución del exosoma (1 mg/ml) en una placa de medio de cultivo de Lowenstein-Jensen (ver Tabla de materiales) e incubar a 37 °C durante 3 semanas.</li>
		<li>Detectar la aparición de bacterias, hongos y colonias de Mycobacterium tuberculosis mediante observación macroscópica. NOTA: Los criterios para evaluar la seguridad de los exosomas son la ausencia de microorganismos en la placa de cultivo.</li>
		<li>Para la detección de micoplasma, siga los pasos 3.5.7-3.5.9.</li>
		<li>Resuspender los exosomas en 50 μL de solución tampón incluida en el kit y calentar a 95 °C durante 3 min.</li>
		<li>Amplificar el micoplasma en solución de exosomas utilizando un kit de detección de micoplasma por PCR (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Detectar los productos de PCR en electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (30 min, 120 V).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Detección in vitro de la función del exosoma
<ol><li>Etiquetado de exosomas<ol><li>Marcar 100 μL de exosomas (1 mg/ml) con 1 mM Dil (1000x) (ver Tabla de materiales) e incubar a RT durante 30 min.</li>
		<li>Recuperar los exosomas por ultracentrifugación a 100.000 x g durante 70 min. Resuspender el pellet en 500 μL de 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Carga de imitadores Cy3-miR-140 en exosomas<ol><li>Mezclar 1 μg/μL de proteína exosomal y 5 μmol/mL de Cy3-miR-140 en un volumen final de 400 μL de tampón de electroporación (1,15 mM fosfato de potasio (pH 7,2), 25 mM de cloruro de potasio y 21% (v/v) (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Transfiera la mezcla a cubetas de electroporación frías de 0,4 cm y electroporate a capacitancia de 300 V/100 μF utilizando un sistema de transfección génica (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Inmediatamente después de la electroporación, mantenga la mezcla en RT durante 30 minutos para asegurarse de que la membrana del exosoma esté completamente restaurada.</li>
		<li>Tratar las mezclas con una unidad de RNasa A (ver Tabla de materiales) durante 20 minutos para eliminar los imitadores de miRNA fuera de los exosomas.</li>
		<li>Ultracentrifugar la mezcla de exosomas a 120.000 x g durante 90 min, desechar el sobrenadante y resuspender los exosomas en 500 μL de 1x PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo de captación de exosomas<ol><li>Sembrar los condrocitos (1 x 107) en placas confocales de 35 mm con 1 mL de DMEM/F12 que contenga 10% de FBS.</li>
		<li>Después de 24 h, tratar los condrocitos con exosomas marcados con DiI (100 ng/ml) o exosomas cargados con cy3-miR-140 (100 ng/ml) durante 1 h.</li>
		<li>Lavar con 1x PBS tres veces, y luego etiquetar con DAPI (10 ng/mL) durante 10 min en RT.</li>
		<li>Registre la señal de fluorescencia en microscopía de fluorescencia de barrido láser confocal (CLSM) utilizando los filtros apropiados (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análisis estadístico
<ol><li>Realizar análisis estadísticos utilizando el software estadístico apropiado. NOTA: Los datos representativos de cada figura se expresaron como la media ± DE. Se utilizó la prueba t de Student para la comparación de dos grupos utilizando software de estadística. Se realizó un ANOVA unidireccional seguido del múltiple de Tukey en el caso de las comparaciones entre múltiples grupos. Valores de p <0,05 (*), <0,01 (**) o <0,001 (***).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Las células madre mesenquimales han sido ampliamente utilizadas en medicina regenerativa debido a su autorrenovación, diferenciadas en células tisulares con funciones especializadas y efectos paracrinos16,17. Cabe destacar que los efectos paracrinos ejercidos por los exosomas han atraído mucha atención18. Los exosomas transportan la bioinformación de las MSC y realizan su función biológica y superan las deficiencias de MSC, como el almacen...

La osteoartritis (OA), resultante del cartílago articular y la descomposición ósea subyacente, sigue siendo un desafío grave que conduce a la discapacidad 1,2. Sin suministro de sangre y nervios, la capacidad de autocuración del cartílago es mínima una vez lesionado 3,4. En las últimas décadas, las terapias basadas en la implantación autóloga de condrocitos (ACI) han progresado en el tratamiento de la OA5. Para el aislamiento y la expansión de los condrocitos, es necesario extraer cartílago pequeño del área que no soporta peso de la articulación OA, causando lesiones en el cartílago. Además, el procedimiento requerirá una segunda operación para implantar los condrocitos expandidos6. Por lo tanto, las terapias de un solo paso para el tratamiento de la OA sin lesiones del cartílago están bajo una exploración exhaustiva.
Las células madre mesenquimales (CMM) han sido sugeridas como alternativas prometedoras para el tratamiento de la OA 7,8. Originadas en múltiples tejidos, las MSC pueden diferenciarse en condrocitos con estimulación específica. Es importante destacar que las MSC pueden modular las respuestas inmunes a través de la antiinflamación9. Por lo tanto, las MSC tienen ventajas significativas en el tratamiento de la OA al reparar defectos del cartílago y modular la respuesta inmune, especialmente en el entorno inflamatorio. Para el tratamiento de la OA, las MSC del líquido sinovial (SF-MSC) han atraído recientemente mucha atención debido a su capacidad de diferenciación de condrocitos más fuerte que otras fuentes de MSC10,11. En particular, en la clínica ortopédica, la extracción de SF inflamatorio de la cavidad articular es una terapia de rutina para aliviar el síntoma de dolor de los pacientes con OA. El SF inflamatorio extraído generalmente se elimina como desechos médicos. Tanto los pacientes como los médicos están listos para considerar las CMM autólogas aisladas del SF inflamatorio como tratamiento de OA con muy pocos conflictos éticos. Sin embargo, la terapia SF-MSC se ve comprometida debido a los riesgos tumorigénicos, el almacenamiento prolongado y las barreras de envío distantes.
Los exosomas, secretados por muchos tipos de células, incluidas las MSC, llevan la mayor parte de la bioinformación de las células madre. Ha sido investigado en profundidad como terapia libre de células12,13. De acuerdo con los recursos actualizados disponibles en el sitio web del gobierno de ensayos clínicos (ClinicalTrials.gov), se inician y realizan estudios clínicos de exosomas más extensos en los campos de investigación del cáncer, la hipertensión y las enfermedades neurodegenerativas. El tratamiento con exosomas SF-MSC podría ser un ensayo emocionante y desafiante para hacer frente a la OA. La producción de exosomas a gran escala y de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP) es esencial para la traducción clínica. El aislamiento de exosomas a pequeña escala se ha realizado ampliamente en base al cultivo celular bidimensional (2D). Sin embargo, las estrategias de producción de exosomas a gran escala necesitan optimización. En este estudio se desarrolló un método de fabricación de exosomas a gran escala, basado en el cultivo masivo de SF-MSC en condiciones libres de xeno. Después de la ultracentrifugación de sobrenadantes de cultivo celular, se validó la seguridad y la función del exosoma.

<table><tbody><tr><td>Kit de ensayo BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Ensayo de concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Placa de agar sangre</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0903</td><td>Cultivo de bacterias</td></tr><tr><td>anticuerpo CD105</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1243C</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>anticuerpo CD34</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1143C</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>anticuerpo CD45</td><td>BD Bioscience</td><td>555483</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>anticuerpo CD63</td><td>Abclonal</td><td>&nbsp; A5271</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>anticuerpo CD73</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1242C</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>anticuerpo CD81</td><td>ABclonal</td><td>&nbsp; A5270</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>CD9 anticuerpo</td><td>Abclonal</td><td>&nbsp; A1703</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>anticuerpo CD90</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1167C</td><td>Citometría</td></tr><tr><td>de flujo Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Termo</td><td></td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Confocal microscopía de fluorescencia de barrido láser</td><td>ZEISS</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cytodex</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Microcarrier</td></tr><tr><td>Dil</td><td>ThermoFisher</td><td>D1556</td><td>Etiqueta de exosomas</td></tr><tr><td>EZ-PCR Kit de detección de micoplasma</td><td>BI</td><td>20-700-20 Detección de</td><td>micoplasma</td></tr><tr><td>Citometría de flujo Identificación</td><td>de Beckman</td><td></td><td>MSC</td></tr><tr><td>Sistema Gene Pulser II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1652660</td><td>Transfección de genes</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.2</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td>Versión 8.0.2</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo HLA-DR</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1111C</td><td>Citometría de flujo</td></tr><tr><td>Medio de cultivo de Lowenstein-Jensen</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>T0573</td><td>Cultivo de Mycobacterium tuberculosis</td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500</td><td>Cultivo MSC</td></tr><tr><td>Nanosight NS300</td><td>Malvern</td><td>Nanosight NS300</td><td>Análisis de seguimiento de nanopartículas</td></tr><tr><td>Software NTA 2.3</td><td>Malvern</td><td></td><td>Análisis de datos</td></tr><tr><td>Odyssey FC</td><td>Gene Company Limited</td><td></td><td>Western blot fluorescente</td></tr><tr><td>OptiPrep tampón de electroporación</td><td>Sigma</td><td>D3911</td><td>Transfección</td></tr> génica <tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Inhibidor de la proteinasa</td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td>Eliminación de ARN</td></tr><tr><td>Placa de agar Sabouraud</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0919</td><td>Cultivo de hongos</td></tr><tr><td>TEM</td><td></td><td>JEM-1200EX</td><td></td></tr><tr><td>El Sistema de Cultivo Celular Rotativo (RCCS)</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4HD</td><td>Cultivo 3D</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>Centrífuga de exosomas</td></tr></tbody></table>

preparación a gran escala de exosomas derivados de células madre mesenquimales del líquido sinovial mediante cultivo de biorreactores 3d

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Los exosomas secretados por las células madre mesenquimales (MSC) se han sugerido como candidatos prometedores para las lesiones del cartílago y el tratamiento de la osteoartritis. Los exosomas para aplicación clínica requieren una producción a gran escala. Con este objetivo, las MSC de líquido sinovial humano (hSF-MSC) se cultivaron en perlas de microportadores y luego se cultivaron en un sistema de cultivo dinámico de tres dimensiones (3D). Mediante la utilización de la cultura dinámica 3D, este protocolo obtuvo con éxito exosomas a gran escala a partir de sobrenadantes de cultivo SF-MSC. Los exosomas se cosecharon por ultracentrifugación y se verificaron mediante un microscopio electrónico de transmisión, un ensayo de transmisión de nanopartículas y Western blotting. Además, se detectó la seguridad microbiológica de los exosomas. Los resultados de la detección de exosomas sugieren que este enfoque puede producir un gran número de exosomas de grado de buenas prácticas de fabricación (GMP). Estos exosomas podrían utilizarse en la investigación de la biología de exosomas y el tratamiento clínico de la osteoartritis.

La citometría de flujo fue utilizada para identificar los marcadores de superficie de las SF-MSCs, de acuerdo con los criterios mínimos para definir las MSCs humanas recomendados por la International Society for Cellular Therapy14,15. El análisis de citometría de flujo reveló que las SF-MSCs cultivadas en este estudio cumplieron con los criterios de identificación de las MSCs. Fueron negativos para CD34, CD45 y HLA-DR (por debajo del 3%) y positivos para CD73, CD...

Aquí, presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando un biorreactor 3D.

Preparación a gran escala de exosomas derivados de células madre mesenquimales del líquido sinovial mediante cultivo de biorreactores 3D

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

Presentamos un protocolo para producir un gran número de exosomas de grado GMP a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando nuestro biorreactor 3D. Estos exosomas podrían utilizarse en la investigación de la biología de exosomas y el tratamiento clínico de la artritis. Demostrando el procedimiento estará el Dr. Yujie Liang.Comience a recolectar las células mesenquimales humanas, o MSC, centrifugando el líquido sinovial a 1, 500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular con 10 mililitros de PBS. Centrifugar las células resuspendidas a 1.500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius y desechar PBS antes de volver a suspender el pellet con 10 mililitros de medio de cultivo MSC humano a una densidad celular de cinco veces 10 a la cuarta células por mililitro y luego colocar la suspensión en un plato de 100 milímetros.Incubar el plato a 37 grados centígrados en una atmósfera que contenga 5% de dióxido de carbono. Después de dos semanas, recolecte el sobrenadante de cultivo celular para identificar las células madre mesenquimales del líquido sinovial, o SF-MSC, utilizando citometría de flujo. Para hacerlo, digiera el pasaje de tercera generación tres de SF-MSC por centrifugación a 1.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Luego, deseche el sobrenadante antes de recoger la bolita celular. A continuación, agregue 400 microlitros del tampón de bloqueo al pellet celular a la concentración de cinco veces 10 al cuarto y deje que el pellet repose durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, centrifugar la suspensión celular como se describió anteriormente, luego resuspender el pellet separado en 100 microlitros de 1X PBS.Añadir un microlitro del anticuerpo fluorescente monoclonal a una relación de dilución de 1:100 por tubo como se describe en el manuscrito, y colocar el tubo para incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, lave las células dos veces con 1X PBS y resuspenda las células en 100 microlitros de 1X PBS. Luego, detecte los fluoróforos en hasta 10, 000 células en un citómetro de flujo utilizando canales rojos y FIFC.Para preparar los microportadores, hinche e hidrate en seco 0,75 gramos de los microportadores en 1X DPBS a la concentración de 50 miligramos por gramo durante al menos tres horas a temperatura ambiente. Luego, decantar el sobrenadante para lavar los microportadores en DPBS fresco durante cinco minutos. Después de reemplazar el medio con 1X DPBS fresco a 50 miligramos de los microportadores por gramo, esterilice los microportadores en autoclave a 121 grados centígrados durante 15 minutos a 15 libras por pulgada cuadrada.Luego, deje que los microportadores esterilizados se asienten antes de decantar el sobrenadante. Enjuague los microportadores en el medio de cultivo a la concentración de 50 miligramos de los microportadores por gramo a temperatura ambiente. Cuando los microportadores estén asentados, deseche el sobrenadante.Para preparar el biorreactor de perfusión, esterilice el biorreactor en autoclave como se describió anteriormente. Cuando haya terminado, cuente el número de SF-MSC para asignar 2.5 veces 10 al séptimo SF-MSC y microportadores al biorreactor perfundido con 250 mililitros del medio de cultivo MSC de grado GMP. Coloque el biorreactor en una incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados a una velocidad de 15 rotaciones por minuto.Cambiar el medio de cultivo cada seis días. Después de 14 días, recolecte los sobrenadantes y microportadores del cultivo celular para su posterior análisis. Centrifugar el sobrenadante de cultivo celular a 300 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y recoger el sobrenadante mientras desecha los restos celulares.A cuatro grados centígrados, centrifugar secuencialmente el sobrenadante a 2, 000 veces G durante 10 minutos y luego a 10, 000 veces G durante 30 minutos para descartar las vesículas más grandes y recoger el pellet. Después de resuspender el pellet en 40 mililitros de PBS, centrifugar la suspensión celular a 120, 000 veces G durante 70 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, resuspenda el pellet recolectado que contiene exosomas en 500 microlitros de PBS.Diluir las muestras de exosomas recién aisladas con PBS estéril a la concentración de 10 a la séptima a 10 a la novena partículas por mililitro e inyectar 500 microlitros de la muestra para cada ejecución en el análisis de seguimiento de nanopartículas, o sistema NTA, a 30 microlitros por minuto y 24.4 a 24.5 grados centígrados. Configure manualmente el sistema de captura y análisis de acuerdo con el protocolo del fabricante. Visualice las partículas mediante la dispersión de la luz láser y capture su movimiento browniano en video digital.A continuación, analice las cintas de video grabadas utilizando software, rastreando al menos 200 partículas individuales por ejecución. Para la Western blotting, agregue 300 microlitros del tampón de lisis y el cóctel de inhibidores de la proteasa a los exosomas con la mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego, deje reposar sobre hielo durante 20 minutos.Después de la centrifugación de la mezcla a 9, 391 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, mida la concentración de proteína en el sobrenadante utilizando un kit de ensayo de proteínas. Después del ensayo, caliente la muestra con 100 microlitros de tampón de carga de proteína 4X a 100 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, cargue 15 microlitros de proteínas a una concentración de 10 miligramos por mililitro para que funcionen mediante electroforesis en gel a 120 voltios durante 70 minutos, y electrotransferencia a 100 voltios durante 60 minutos a cuatro grados centígrados.Detectar los marcadores específicos no exosomales, como la calnexina y los biomarcadores exosomales como CD9, CD63 y CD81 mediante Western blot fluorescente. En el estudio, se utilizó citometría de flujo para identificar los marcadores de superficie de SF-MSCs. El análisis de citometría de flujo reveló que los SF-MSCs cultivados fueron negativos para CD34, CD45 y HLA-DR, y positivos para CD73, CD90 y CD105, cumpliendo con los criterios de identificación de MSCs.Bajo microscopía invertida, se observó que los SF-MSC proliferan en microportadores. El SF-MSC proliferó en la cultura 3D más rápidamente a partir de seis días en comparación con la cultura 2D. Los exosomas de SF-MSCs de cultivo 2D y 3D se identificaron utilizando Western blot y se encontró que los exosomas expresaban CD63, CD9 y CD81 mientras eran negativos para calnexina.El análisis de nanocitos demostró que el diámetro de los exosomas 2D y 3D era de aproximadamente 120 nanómetros. El análisis microscópico electrónico de transmisión reveló la morfología de los exosomas 2D y 3D, mostrando vesículas aproximadamente esferoidales. Utilizando el análisis NTA, se analizó la concentración de partículas de 30 a 160 nanómetros de tamaño.Después del cultivo 3D, la concentración de partículas fue de 4.0 veces 10 a seis por mililitro. Sin embargo, después del cultivo 2D, la concentración de partículas del mismo tamaño fue de 2,5 veces 10 a seis por mililitro. Además, el cultivo 3D produjo más proteínas exosómicas que el cultivo 2D.El análisis representativo muestra la internalización de exosomas marcados con Dil por condrocitos primarios. Los exosomas marcados con dil que ingresaron a los condrocitos primarios se pueden ver con un pico a las tres horas. El estudio de entrega in vitro demostró que los exosomas podrían administrar microARN-140 marcado con sulfocianina3 a los condrocitos.El recubrimiento de las células, el inicio de la reacción en el biorreactor y el sobrenadante son los pasos más importantes en este protocolo. El cultivo 3D se usa comúnmente para el cultivo a gran escala de células adherentes. Otros métodos, como la flexión de espín, también se pueden utilizar para la producción a gran escala de exosomas.Nuestro método mejora el rendimiento de los exosomas, lo que permite la aplicación preclínica basada en exosomas MSC.

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Investigación

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Biology

Biología

Un sistema 3D de los condrocitos articulares humanos en cultivo de altos niveles de líquido sinovial se describe. El líquido sinovial refleja el microambiente más naturales para el cartílago articular, y puede ser fácilmente obtenido y almacenado. Así, este sistema puede ser utilizado para el estudio de la regeneración del cartílago y de terapias de detección para el tratamiento de la artritis.

Un sistema 3D para los condrocitos articulares humanos cultivo de líquido sinovial

Se presenta un protocolo que establece células madre mesenquimales (MSCs) aisladas del líquido sinovial y de la médula ósea de minicerdos y recolectadas de forma no invasiva mediante aspiración con jeringa. El fenotipado celular se realizó mediante citometría de flujo después del aislamiento celular y cultivo in vitro de médula ósea y fluidos sinoviales derivados de MSCs.

Aislamiento y Celular del fenotipo de células madre mesenquimales derivadas del líquido sinovial y la médula ósea de cerdos enanos

El potencial terapéutico de las células madre/estroma mesenquimales (MSCs) está bien documentado, sin embargo, el mejor método para preparar las células para los pacientes sigue siendo controvertido. En este artículo, comunicamos protocolos para generar y administrar de manera eficiente agregados esféricos terapéuticos o 'esferoides' de MSCs preparados en condiciones libres de xeno para aplicaciones experimentales y clínicas.

Producción y Administración de la terapéutica madre mesenquimales / célula del estroma (MSC) esferoides imprimado en 3-D Los cultivos bajo condiciones Xeno-libres

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

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Este artículo presenta un protocolo sencillo y económico para el simple aislamiento y purificación de células madre mesenquimales del líquido sinovial del conejo blanco de Nueva Zelanda.

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Un exosomas es una nueva generación de compañías de entrega de drogas. Hemos establecido un protocolo de aislamiento de exosomas con alto rendimiento y pureza para entrega de siRNA. También había encapsulado con fluorescencia inespecífica siRNA en exosomas y había investigado la absorción celular de exosomas cargado de siRNA en las células cancerosas.

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Optimización de la administración de vesículas extracelulares mediante un andamio bioimpreso en 3D con vaina central para el tratamiento de heridas crónicas

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Endoteliales que forman colonias células progenitoras (ECFCs) son una herramienta prometedora para estudiar la homeostasis vascular y la reparación.

El aislamiento y la expansión a gran escala de células humanas adultas Colonia progenitoras endoteliales formación

Aprende a preparar exosomas de grado GMP a gran escala a partir de células madre mesenquimales del líquido sinovial utilizando un biorreactor 3D. Este método optimiza la producción para aplicaciones en investigación y tratamiento clínico de artritis.

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Preparación a gran escala de exosomas derivados de células madre mesenquimales del líquido sinovial mediante cultivo de biorreactores 3D

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