Name: Un método para preservar las raíces y rizosferas de los humedales para imágenes elementales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Aprenda a preservar raíces y rizosferas de humedales mediante congelación por impacto y liofilización para obtener imágenes elementales precisas. Este método rápido y económico mantiene la estructura y especiación química in situ.

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Los autores reconocen una subvención conjunta de semillas a Seyfferth y Tappero para apoyar la colaboración entre la Universidad de Delaware y el Laboratorio Nacional de Brookhaven. Partes de esta investigación utilizaron la línea de haz XFM (4-BM) de la Fuente Nacional de Luz Sincrotrón II, una Instalación de Usuario de la Oficina de Ciencias del Departamento de Energía de los Estados Unidos (DOE) operada para la Oficina de Ciencia del DOE por el Laboratorio Nacional Brookhaven bajo el Contrato No. DE-SC0012704.

1. Preparación de equipos de congelación por golpe
<ol><li>Coloque dos bloques de cobre (~ 5 cm x 5 cm x 15 cm) horizontalmente dentro de un refrigerador limpio capaz de contener nitrógeno líquido y verter suficiente nitrógeno líquido para sumergir los bloques. Una vez que el burbujeo disminuya, coloque dos espaciadores en la parte superior de un bloque de cobre en cada extremo. NOTA: La altura del espaciador determina la altura de la muestra a congelar; en este ejemplo se utiliza un espaciador de 2 cm para crear cubos de aproximadamente 3 cm x 3 cm x 2 cm. El volumen del nitrógeno líquido dependerá del tamaño del enfriador. En este ejemplo se utiliza aproximadamente 1 L para aproximadamente 5 cubos en serie. PRECAUCIÓN: Use el equipo de protección personal y la ventilación adecuados, ya que el nitrógeno líquido es un criógeno y un asfixiante.</li>
	<li>Usando pinzas y guantes criogénicos, coloque el otro bloque de cobre en su extremo, para facilitar la recuperación cuando la muestra esté en su lugar.</li>
</ol>2. Recogida de muestras y congelación por slam
<ol><li>Extraiga la planta y la rizosfera deseadas del suelo húmedo con una pala y asegúrese de que el agujero excavado sea mucho más grande que el volumen de raíz deseado. Coloque el suelo y la planta en un recipiente y colóquelo en una mesa de trabajo. NOTA: También se puede usar todo el suelo en maceta y la planta de un estudio de maceta.</li>
	<li>Determine la ubicación deseada del suelo donde se tomarán las raíces (es decir, la profundidad y la proximidad al brote). Corte el exceso de tierra con una cuchilla de acero, teniendo cuidado de no molestar el suelo en el área deseada. Cuando se alcance el área deseada, corte un "cubo" de raíz de aproximadamente 3 cm x 3 cm x 2 cm e inmediatamente coloque el cubo entre los dos espaciadores en el bloque de cobre horizontal. Usando guantes criogénicos, recoja el bloque vertical de cobre y colóquelo encima de los espaciadores para congelar el cubo de rizosfera.</li>
	<li>Después de que el burbujeo disminuya (~ 5 min), recupere el cubo de rizosfera congelado de los bloques de cobre y envuélvalo dentro de un cuadrado de papel de aluminio preeticado. Marque la orientación del bloque en la lámina si lo desea. Colocar en un segundo recipiente de nitrógeno líquido hasta su almacenamiento en un congelador de -80 °C.</li>
	<li>Repita según sea necesario para obtener el número deseado de cubos de raíz del sitio de campo o del experimento. Asegúrese de que ambos bloques de cobre den tiempo para enfriarse entre las muestras.</li>
</ol>3. Liofilización e incrustación de cubos de rizosfera
<ol><li>Prepare el liofilizador de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tenga cuidado de asegurarse de que ha obtenido la presión y la temperatura de vacío adecuadas antes de retirar las muestras del congelador de -80 °C.</li>
	<li>Cuando el liofilizador esté listo para recibir muestras, coloque un cubo de rizosfera congelado dentro de un tubo limpio y lavado con ácido de 50 ml y cúbralo libremente con una toallita desechable limpia. Asegure la toallita con una banda elástica. Repita según sea necesario para asegurar un cubo por tubo. NOTA: Si la muestra es demasiado grande para un tubo, se puede colocar directamente en el recipiente del liofilizador utilizando el papel de aluminio como soporte de muestra.</li>
	<li>Coloque los tubos que contienen muestras en recipientes de liofilización y seque por congelación durante varios días. El tiempo exacto de secado dependerá de las propiedades del suelo. NOTA: Guarde las muestras secas en el liofilizador o en un desecador para evitar la rehidratación.</li>
	<li>Use una cuchilla de acero para cortar cubos de suelo secos a medida para que encajen en la forma deseada (por ejemplo, la forma de 25 mm de diámetro es ideal para la mayoría de las aplicaciones). Etiquete cada forma, coloque los cubos de suelo en las formas y coloque las formas dentro de un desecador al vacío.</li>
	<li>Prepare epoxi de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Asegúrese de que el epoxi elegido no esté contaminado y no cause cambios de especiación de los elementos deseados 20,29,30.</li>
	<li>Use un gotero para agregar epoxi a la forma en un lado del suelo, hasta que cubra completamente la muestra. El suelo se oscurecerá en color a medida que el epoxi humedece el suelo. NOTA: Agregue el epoxi lentamente para permitir que el aire en el suelo escape.</li>
	<li>Una vez que los formularios se llenan con epoxi, cierre el desecador de vacío y encienda el vacío. Dependiendo de la cantidad de aire atrapado en el suelo, es posible que se deba agregar más epoxi a las formas periódicamente. Verifique el nivel de epoxi cada 30-90 minutos durante las primeras 1-4 h y agregue epoxi según sea necesario.</li>
	<li>Retire la muestra de la forma una vez que el epoxi se haya endurecido (~ 5 días).</li>
</ol>4. Corte y seccionamiento de los cubos de rizosfera
<ol><li>Corte la muestra con una sierra húmeda de precisión de cuchilla de diamante. Cortar las muestras en diferentes lugares si no se obtienen raíces en el corte anterior.</li>
	<li>Lijar manualmente las muestras cortadas con papel de lija progresivamente más fino (por ejemplo, 220, 500, 1000 y 1500 granos) en el lado cortado durante ~ 30 s.</li>
	<li>Realizar imágenes superficiales de las muestras utilizando técnicas como LA-ICP-MS. NOTA: Para preparar secciones delgadas para S-XRF, envíe las muestras a una empresa capaz de preparar las secciones delgadas (pulido de lado simple o doble) o siga los pasos 4.4 - 4.6 como se describe a continuación.</li>
	<li>Pegue el lado de la muestra deseado a una diapositiva de cuarzo con súper pegamento y deje que se cure durante la noche.</li>
	<li>Usando una máquina de sección delgada, corte el suelo en toboganes de hasta 2 mm de espesor y luego muela al espesor deseado (típicamente 30 μm). La superficie de la muestra se puede pulir si se desea.</li>
	<li>Realice imágenes S-XRF de las secciones. Siga los pasos apropiados en la instalación de sincrotrón y la línea de haz deseada para solicitar y utilizar el tiempo de imagen.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este artículo describe un protocolo para obtener suelo a granel preservado + rizosferas de raíces de plantas de humedales utilizando una técnica de congelación por golpe que se puede utilizar para imágenes elementales y / o mapeo de especiación química.
Hay varios beneficios de este método sobre los métodos existentes. En primer lugar, este método permite la investigación simultánea de las raíces y las rizosferas circundantes. Actualmente existen métodos para preservar e imagen químicamente la...

Las raíces y sus rizosferas son dinámicas, heterogéneas y de importancia crítica para comprender cómo las plantas obtienen nutrientes minerales y contaminantes1,2,3. Las raíces son la vía principal por la cual los nutrientes (por ejemplo, fósforo) y los contaminantes (por ejemplo, arsénico) se mueven del suelo a las plantas y, por lo tanto, comprender este proceso tiene implicaciones para la cantidad y calidad de los alimentos, el funcionamiento del ecosistema y la fitorremediación. Sin embargo, las raíces son dinámicas en el espacio y el tiempo creciendo en respuesta a las necesidades de adquisición de nutrientes y a menudo varían en función, diámetro y estructura (por ejemplo, raíces laterales, raíces adventicias, pelos de raíz)2. La heterogeneidad de los sistemas radiculares se puede estudiar en escalas espaciales desde el nivel celular hasta el ecosistema y en escalas temporales desde el horario hasta el decenal. Por lo tanto, la naturaleza dinámica y heterogénea de las raíces y su suelo circundante, o rizosfera, plantea desafíos para capturar la química de la rizosfera a lo largo del tiempo. A pesar de este desafío, es imperativo estudiar las raíces en su entorno de suelo para caracterizar esta relación crítica planta-suelo.
La química de la rizosfera de las plantas de humedales es particularmente difícil de investigar debido a los gradientes de oxígeno empinados que existen desde el suelo a granel hasta las raíces, que cambian en el espacio y el tiempo. Debido a que las raíces necesitan oxígeno para respirar, las plantas de los humedales se han adaptado a las condiciones de bajo oxígeno de los suelos de los humedales mediante la creación de aerénquima4,5. Los aerénquimas son tejidos corticales ahuecados que se extienden desde los brotes hasta las raíces, permitiendo la difusión del aire a través de la planta hacia las raíces. Sin embargo, parte de este aire se filtra en la rizosfera en partes menos suberizadas de las raíces, particularmente cerca de las uniones laterales de las raíces, las puntas de las raíces menos maduras y las zonas de elongación6,7,8,9. Esta pérdida radial de oxígeno crea una zona oxidada en la rizosfera de las plantas de humedales que afecta la rizosfera (bio-geo)química y es distinta del suelo a granel reducido10,11,12. Para comprender el destino y el transporte de nutrientes y contaminantes en las rizosferas y raíces de los humedales, es fundamental preservar el suelo a granel químicamente reducido, la rizosfera oxidada y las raíces de las plantas de los humedales para su análisis. Sin embargo, debido a que el suelo a granel contiene componentes reducidos del suelo que son sensibles al oxígeno, los métodos de preservación de raíces y suelos deben preservar las estructuras radiculares y minimizar las reacciones sensibles al oxígeno.
Existen métodos para fijar los tejidos de las plantas y preservar la ultraestructura para la obtención de imágenes, pero esos métodos no se pueden aplicar para preservar químicamente las raíces que crecen en el suelo de los humedales. Para las investigaciones en las que solo se desea la distribución elemental dentro de las células vegetales, las plantas generalmente se cultivan hidropónicamente y las raíces se pueden eliminar fácilmente de la solución, fijarse bajo congelación a alta presión y sustitución por congelación y seccionarse para una variedad de aplicaciones de imágenes, incluida la espectrometría de masas de iones secundarios de alta resolución (nanoSIMS), la microscopía electrónica y el análisis de fluorescencia de rayos X sincrotrón (S-XRF)13, 14,15. Para investigar la placa de Fe en el exterior de las raíces de los humedales, estos estudios hidropónicos deben inducir artificialmente la formación de placa de Fe en la solución16,que no representa con precisión la heterogeneidad de la distribución y composición mineral de la formación de placa de Fe y los elementos asociados in situ17,18,19,20. Existen métodos para preservar el suelo de los humedales y los microorganismos asociados con la congelación21,pero es difícil obtener raíces con esta técnica. Los métodos actuales para visualizar las raíces que crecen en el suelo y su química rizosférica consisten en dos tipos de medición principales: flujos elementales y concentración elemental total (y especiación). El primero se mide típicamente utilizando gradientes difusivos en películas delgadas (DGT)22 , 23,24, en las que el suelo se coloca en rizoboxes para apoyar el crecimiento de las plantas en un entorno de laboratorio y los elementos lábiles en el suelo se difunden a través de un gel en una capa de unión. Esta capa de unión se puede obtener imágenes para cuantificar los elementos lábiles de interés. Esta técnica puede ilustrar con éxito las relaciones entre las raíces y larizosfera 24,25,26,27,pero los artefactos de la delimitación radicular pueden existir al cultivar plantas en rizoboxes, y la información sobre el interior de la raíz no se captura con DGT. Este último implica el muestreo de las raíces y la rizosfera, la preservación de la muestra y el análisis directo de la distribución elemental en una sección de muestra. Para este muestreo ambiental de las raíces de las plantas de los humedales y su rizosfera circundante, se requiere un manejo cuidadoso de la muestra para evitar los artefactos de la preparación de la muestra.
Aquí se describe un protocolo que preserva eficazmente las estructuras radiculares y la química de la rizosfera de las plantas de los humedales mediante la congelación por golpe y la liofilización. La congelación repentina puede ralentizar drásticamente las transformaciones de solutos sensibles al oxígeno, pero puede dañar las raíces y causar movilización cuando las muestras se secan. Sin embargo, la congelación por golpe donde la muestra se congela entre bloques de cobre preenfriados con nitrógeno líquido minimiza el daño a la raíz y la distorsión de la muestra28. Las muestras conservadas se incrustan en una resina epoxi que conserva As speciation20,29 y se pueden cortar y pulir para obtener imágenes de raíces dentro de su suelo de rizosfera. Las muestras en este informe fueron analizadas por imágenes de especiación química S-XRF después de la sección delgada. Sin embargo, también se podrían utilizar otras técnicas de imagen, incluida la espectrometría de masas de plasma acoplada inductivamente a la ablación con láser (LA-ICP-MS), la emisión de rayos X inducida por partículas (PIXE), la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS) y la espectroscopia de ruptura inducida por láser (LIBS).

<table><tbody><tr><td>Bloques de cobre</td><td>McMaster Carr</td><td>89275K42</td><td></td></tr><tr><td>Disco de diamante</td><td>Buehler</td><td>15 LC, 102 mm x 0,3 mm</td><td>Velocidad de funcionamiento: 225 rpm</td></tr><tr><td>Formas epoxi</td><td>Struers</td><td>40300085</td><td>FixiForm</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Epotek</td><td>301-2FL</td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>Loctite</td><td>404</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de corte fino</td><td>Buehler</td><td>Sierra húmeda PetroThin</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Buehler</td><td>IsoMet 1000</td><td></td></tr></tbody></table>

un método para preservar las raíces y rizosferas de los humedales para imágenes elementales

A Method to Preserve Wetland Roots and Rhizospheres for Elemental Imaging

Las raíces interactúan ampliamente con su entorno de suelo, pero visualizar tales interacciones entre las raíces y la rizosfera circundante es un desafío. La química de la rizosfera de las plantas de humedales es particularmente difícil de capturar debido a los gradientes de oxígeno pronunciados desde las raíces hasta el suelo a granel. Aquí se describe un protocolo que preserva eficazmente la estructura radicular y la química de la rizosfera de las plantas de los humedales a través de la congelación y la liofilización. La congelación por golpe, donde la muestra se congela entre bloques de cobre preenfriados con nitrógeno líquido, minimiza el daño a la raíz y la distorsión de la muestra que puede ocurrir con la congelación instantánea al tiempo que minimiza los cambios de especiación química. Si bien la distorsión de la muestra sigue siendo posible, la capacidad de obtener múltiples muestras rápidamente y con un costo mínimo aumenta el potencial para obtener muestras satisfactorias y optimiza el tiempo de obtención de imágenes. Los datos muestran que este método tiene éxito en la preservación de especies reducidas de arsénico en raíces de arroz y rizosferas asociadas con placas de hierro. Este método se puede adoptar para estudios de relaciones planta-suelo en una amplia variedad de ambientes de humedales que abarcan rangos de concentración desde el ciclo de oligoelementos hasta aplicaciones de fitorremediación.

Este método permite la preservación de raíces y especies químicas en las raíces y la rizosfera de las plantas de humedales y en el suelo a granel. En este trabajo, se utilizó el método para evaluar la especiación y colocalización con óxidos de Fe y Mn y nutrientes vegetales en la rizosfera del arroz(Oryza sativa L.). El arroz se cultivó en las instalaciones de RICE en la Universidad de Delaware, donde se utilizan 30 mesocosmos de arrozales (2 m x 2 m, 49 plantas cada uno) para cultivar arroz en diversas condicio...

Describimos un protocolo para muestrear, preservar y seccionar raíces intactas y el suelo de la rizosfera circundante de ambientes de humedales utilizando arroz(Oryza sativa L.) como especie modelo. Una vez conservada, la muestra se puede analizar utilizando técnicas de imagen elemental, como la imagen de especiación química de fluorescencia de rayos X sincrotrón (XRF).

Un método para preservar las raíces y rizosferas de los humedales para imágenes elementales

Roots extensively interact with their soil environment but visualizing such interactions between roots and the surrounding rhizosphere is challenging. The ...

Este método proporciona a los investigadores una nueva forma de preparar las raíces de las plantas acuáticas, la rizosfera circundante y el suelo a granel para las técnicas de imagen elemental. La principal ventaja de este método es que es relativamente rápido y asequible, al tiempo que preserva con precisión la distribución y especiación de los elementos de interés. Esta técnica se puede utilizar para responder preguntas sobre muchos elementos y sistemas de plantas, desde nutrientes en sistemas agrícolas hasta el destino y el transporte de contaminantes en sistemas de encadenado.Asegúrese de trabajar rápidamente y al mismo tiempo tenga en cuenta el área o áreas deseadas del sistema radicular para el muestreo. Y tome múltiples muestras por sistema raíz. Para preparar el equipo de congelación de slam para un experimento, coloque bloques de cobre de dos, cinco por cinco por 15 centímetros horizontalmente en un refrigerador limpio capaz de contener nitrógeno líquido.Y usando el EPP apropiado, vierta suficiente nitrógeno líquido en el refrigerador para sumergir los bloques. Una vez que el burbujeo disminuya, coloque un espaciador en cada extremo de un bloque de cobre. Luego, usando pinzas y guantes criogénicos, coloque el otro blog de cobre en su extremo para facilitar la recuperación cuando la muestra esté en su lugar.Para recolectar la muestra, use una planta en maceta o use una pala para comenzar a extraer la planta y la rizosfera deseadas del suelo húmedo, cuidando que el agujero excavado sea mucho más grande que el volumen de raíz deseado. Use una cuchilla de acero para cortar cualquier exceso de tierra, teniendo cuidado de no molestar el suelo dentro del área deseada. Cuando las áreas deseadas alcancen, corte un cubo de raíz de aproximadamente tres por tres por dos centímetros, e inmediatamente coloque el cubo entre los dos espaciadores en el bloque de cobre horizontal.Para una congelación por golpe de la muestra, use los guantes criogénicos para colocar el bloque de cobre vertical en los espaciadores durante aproximadamente cinco minutos. Cuando el burbujeo disminuye, transfiera la muestra del cubo de rizosfera congelado slam a un trozo de cuadrado de papel de aluminio preetitiqueta. Para secar por congelación los cubos de tierra, cuando el liofilizador haya alcanzado la presión y temperatura de vacío adecuadas, coloque una muestra de cubo de rizosfera congelada para un tubo de 50 mililitros limpio y lavado con ácido o directamente en el liofilizador y use una toallita desechable limpia para evitar que el polvo entre en la bomba de vacío.Coloque las muestras en el recipiente del liofilizador durante al menos unos días hasta que se sequen. Cuando los tejidos hayan sido liofilizados, use una cuchilla de acero para secar los cubos de suelo a un tamaño apropiado para el análisis antes de colocar los cubos en formas etiquetadas dentro de un desecador al vacío. Después de preparar epoxi de acuerdo con las instrucciones del fabricante, use un gotero para agregar lentamente epoxi a la forma en un lado del suelo, hasta que el epoxi cubra completamente la muestra.El suelo se oscurecerá en color a medida que el epoxi humedece el suelo. Una vez que las formas estén llenas de epoxi, cierre el desecador y encienda el vacío. Verifique el nivel de un epoxi cada 30 a 90 minutos durante las primeras una a cuatro horas, agregando epoxi adicional si es necesario.Una vez que el epoxi se haya endurecido, retire la muestra. Después de incrustar, use una sierra húmeda de precisión de hoja de diamante para cortar la muestra. Cortar la muestra en una dirección diferente si no se obtienen raíces en el corte anterior.Después del recorte, lija manualmente el lado cortado de cada muestra con papel de lija progresivamente más fino durante 30 segundos por tamaño de grano. En esta figura, se pueden observar varios diámetros de raíz dentro de la matriz del suelo como secciones transversales. Las raíces pueden demostrar diferentes niveles de calidad.Por ejemplo, en esta imagen, se puede observar una raíz bien conservada, una raíz distorsionada por el proceso de liofilización y una raíz que se extrayó durante el proceso de sección delgada. El análisis de esta sección transversal de la raíz con una raíz lateral en la sección longitudinal por imágenes de fluorescencia de rayos X sincrotrón como se ha demostrado permite la detección de hierro, manganeso y arsénico. La presencia de hierro dentro del suelo y alrededor de la raíz en la placa de hierro también es visible en las imágenes de micrografía de luz.El manganeso está presente de manera única dentro de la corteza de la raíz lateral, pero también se co-localiza con el hierro en algunas áreas dentro de la placa de hierro como un tono verde-azul. El arsénico se encuentra principalmente dentro de la vasculatura de la raíz lateral que se fusiona con la vasculatura de la raíz primaria. Las imágenes de especiación química revelan una variabilidad en la localización de las especies de arsénico.Como se observa en esta gráfica tricolor, el arsenito y el glutatión de arsenito están estrechamente asociados en la vasculatura, mientras que el arseniato se localiza principalmente dentro del exterior de la raíz, asociado con la placa de hierro. Antes de la recolección de muestras, determine la parte deseada del sistema radicular para las imágenes elementales. Esto dictará la orientación de ubicación de la clave raíz eliminada.Siguiendo este protocolo, las muestras se pueden obtener imágenes a escala micrométrica o más gruesa utilizando una variedad de técnicas, dependiendo de las preguntas de investigación específicas, los elementos de interés o la instrumentación disponible.

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