Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario
10 de febrero de 2021
Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.
Este protocolo permite el aislamiento eficiente y el cultivo de las células RPE del ratón. Los cultivos RPE de ratón primario sano son modelos valiosos para entender los mecanismos de las enfermedades oculares subyacentes. Las culturas RPE confluentes y viables se obtienen en un plazo de tres días y se pueden cultivar durante semanas.
Este protocolo se ha utilizado con éxito para comprender los mecanismos subyacentes a la degeneración macular relacionada con la edad temprana, que es la principal causa de ceguera entre los ancianos de los países desarrollados. Es importante visualizar los pasos de disección. Los detalles son críticos para el éxito del protocolo, por ejemplo, cómo manejar los globos oculares para que la esclera no se golpee, dónde se deben realizar exactamente los cortes y cómo incrustar las tazas de los ojos en la tripatina para que permanezcan abiertas.
Comience con la preparación de todos los reactivos necesarios para el protocolo. A continuación, comience a limpiar el globo ocular retirando cuidadosamente todo el tejido conectivo, la sangre y los músculos, utilizando fórceps dumont número cinco y tijeras en ángulo, sin hacer ningún corte en la esclerótica. Transfiera el globo ocular a un plato fresco que contenga tres mililitros de amortiguador HBSS libre de HEPES regularmente para mantener el ojo fresco y limpio y evitar cualquier contaminación.
Utilice el nervio óptico como mango para sostener el globo ocular y hacer un agujero en el centro de la córnea con una hoja de acero al carbono afilado número 11. Haga tres incisiones en la córnea a través del agujero con tijeras Dumont número cinco, asegurando que haya suficiente espacio para quitar la lente. Sujete el nervio óptico y aplique una ligera presión a la ora serrata con la base de las tijeras en ángulo, hasta que la lente salga por completo.
Mantenga intacto el epitelio del iris para evitar el desprendimiento de la retina neural y el RPE durante la incubación. Coloque el ojo en el búfer HBSS libre de HEPES. Incubar los ojos sin lentes en solución hialuronidasa a 37 grados Celsius durante 45 minutos en una incubadora aerada de dióxido de carbono al 5% para separar la retina neuronal del RPE.
Coloque cada ojo en un nuevo pozo con 1,5 mililitros de amortiguador HBSS HEPES frío por pozo e incubarlo en hielo durante 30 minutos. Después de lavar, coloque cada ojo en un plato de cultivo de 35 milímetros con un tampón HBSS HEPES fresco. Corta la córnea a través de las incisiones originales con tijeras Vannas de ocho centímetros hasta que se alcance la ora serrata, luego corta debajo de la ora serrata para eliminar el epitelio iris y la córnea.
Sostenga la ora serrata con pinzas curvas y usando micro fórceps en ángulo, tire de la retina neural, asegurándose de que la capa RPE no esté cortada. A continuación, corte el accesorio interno al nervio óptico. Corte el nervio óptico y transfiera cada taza de ojos a una placa de pozo diferente de 1,5 mililitros de trippsina fresca-EDTA por pozo.
Asegúrese de que las tazas de ojos permanezcan abiertas y completamente sumergidas en la triptina. Incubar las tazas oculares a 37 grados Celsius durante 45 minutos en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Recoge cada taza de ojos junto con cualquier hoja RPE desprendida durante la incubación de trypsin y transfiéralas a una placa de 12 pozos que contenga 1,5 mililitros de solución FBS por pozo.
Si las hojas RPE permanecen en la solución trypsin, utilice un micropipette para transferirlas al pozo con solución FBS. Sostenga cada vaso ocular por el nervio óptico y agite boca abajo en la placa de 12 pozos que contiene 1,5 mililitros de 20% FBS en el búfer HBSS HEPES hasta que se logre el desprendimiento completo de las hojas RPE. Recoge cualquier lámina de RPE y racimos RPE con un micropipette, evitando cualquier trozo blanco de esclerótica o coroide, que pueda contaminar los cultivos, y colócalos en un tubo de 15 mililitros.
Tire de dos ojos del mismo ratón en un tubo. A continuación, centrífuga la mezcla RPE a 340 x g durante dos minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante. Resuspend suavemente el pellet RPE en una mezcla de un mililitro de 0,25% trypsin-EDTA e incubarlo durante un minuto en un baño de agua a 37 grados Celsius para desagregar las hojas de RPE en células individuales.
A continuación, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces, evitando la formación de burbujas. Añadir nueve mililitros de RPE recién preparado medio para diluir e inactivar la trypsin y centrifugar la mezcla a 340 x g durante dos minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspend cuidadosamente el pellet celular en 150 microlitros de medio RPE con 5% FBS.
A continuación, retire PBS de la cámara inferior de la plaquita de membrana recubierta de laminin preparada previamente y agregue 700 microlitros de medio RPE a ella. Retire la laminin de la cámara superior de la plaquita de membrana y distribuya la suspensión de la célula RPE en cuanto a caída y uniformemente al centro de la cámara. Coloque la plaquita de membrana sin perturbar en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante al menos 24 horas.
A continuación, compruebe la inserción de membrana debajo del microscopio para asegurarse de que la mayoría de las células RPE están conectadas a la plaquita y la confluencia es de al menos el 50% No cambie el medio durante las primeras 72 horas. Las células RPE aisladas mediante este protocolo mostraron el tamaño típico de RPE, morfología y pigmentación. Después de una semana se observó una monocapa RPE altamente polarizada con dos núcleos unidos por uniones estrechas, junto con la presencia de microvilli apicales e infoldings basales.
La polarización de la monocapa RPE fue confirmada por los valores TER, con un promedio superior a 200 ohmios centígrados cuadrados, que se mantuvo estable con el tiempo. En los ensayos de fagocitosis realizados en TPV bovino etiquetado FITC, se observó engullimiento y digestión de TPV, lo que indica la formación de una monocapa funcional confluente de células RPE. Las culturas viables requieren un corto tiempo de disección, lo que se logra con experiencia.
Algunas células RPE pueden permanecer unidas a la retina neuronal, pero si varias hojas de RPE permanecen unidas, el protocolo no tendrá éxito. Hialuronidasa fresca debe utilizarse cada vez para prevenir este problema. Estos cultivos celulares RPE de ratón primario funcional son una herramienta valiosa para estudiar la patobiología de la RPE en muchas enfermedades oculares.
Por ejemplo, este protocolo hizo posible estudiar la motos de ruta del RPE en un modelo de ratón de degeneración macular.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo actualizado y detallado para el aislamiento y cultivo eficiente de células primarias del epitelio pigmentario retiniano (RPE) de ratón. El método permite la generación de monocapas de RPE robustas, altamente polarizadas y pigmentadas, proporcionando un modelo in vitro valioso para estudiar los mecanismos de las enfermedades oculares y probar estrategias terapéuticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Oftalmología
- Biología celular
- Modelos experimentales
Antecedentes
- Los trastornos oculares son prevalentes en todo el mundo, pero la investigación está limitada por la escasez de tejidos oculares humanos.
- Los modelos de ratón se utilizan ampliamente debido a las similitudes anatómicas y fisiológicas con los seres humanos.
- Las alteraciones en la morfología y la función del epitelio pigmentario retiniano (RPE) son comunes en muchas enfermedades oculares, incluyendo la degeneración macular.
- El aislamiento y cultivo de células primarias de RPE de ratón es técnicamente desafiante, pero esencial para la modelización de enfermedades.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo reproducible para el aislamiento y cultivo de células primarias de epitelio pigmentario de la retina (RPE) de ratón.
- Permitir el estudio de los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a las enfermedades oculares.
- Establecer una plataforma para probar terapias potenciales contra trastornos retinianos.
Métodos Utilizados
- Diseción y limpieza cuidadosas de los ojos de ratón para preservar la integridad del epitelio pigmentario de la retina (RPE).
- Tratamientos enzimáticos (hialuronidasa y tripsina-EDTA) para separar y disociar láminas de RPE.
- Centrifugación y pipeteo suave para obtener células individuales de RPE.
- Siembra de células en insertos de membrana Transwell recubiertos con laminina para favorecer la formación de una monocapa.
- Evaluación de la polarización, morfología y función del RPE (por ejemplo, medición de la resistencia transepitelial [TER], ensayo de fagocitosis).
Resultados principales
- Se obtienen cultivos de EPR confluentes y viables en tres días y se mantienen durante semanas.
- Las monocapas de EPR muestran morfología, pigmentación y polarización típicas, confirmadas por altos valores de resistencia transepitelial (TER) (>200 Ω·cm²).
- Los ensayos funcionales demuestran actividad fagocítica, lo que indica monocapas de EPR sanas y confluentes.
- El protocolo se ha aplicado con éxito para estudiar la degeneración macular relacionada con la edad en modelos de ratón.
Conclusiones
- Este protocolo permite el aislamiento y cultivo reproducible de células primarias funcionales de EPR de ratón.
- Los cultivos resultantes son adecuados para investigar la patobiología del EPR en diversas enfermedades oculares.
- El modelo proporciona una plataforma para pruebas preclínicas de intervenciones terapéuticas para trastornos retinianos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento y cultivo eficiente de células primarias de epitelio pigmentario retiniano (RPE) de ratón aborda un cuello de botella crítico en la modelización de enfermedades oculares y en la selección terapéutica. Este protocolo reproducible permite la generación de monocapas de RPE altamente polarizadas y funcionales, lo que favorece la desvinculación mecanicista y la validación de objetivos en las líneas preclínicas de oftalmología. La plataforma aumenta la confianza predictiva en la investigación traslacional y en la selección de carteras en el descubrimiento de fármacos para trastornos retinianos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar los mecanismos de enfermedad impulsados por el epitelio pigmentario retiniano (RPE) relacionados con trastornos retinianos hereditarios y degenerativos.
- Apoya la desactivación de riesgos biológicos al proporcionar un sistema basado en células primarias fisiológicamente relevante.
- Facilita la validación funcional de dianas mediante la evaluación cuantitativa de la polarización del RPE y de la actividad fagocítica.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona monocapas de RPE robustas y reproducibles, adecuadas para cribado de compuestos y ensayos mecanicistas posteriores.
- Normaliza las condiciones del ensayo con resultados cuantitativos como la resistencia transepitelial (TER) y las mediciones de fagocitosis.
- Permite la preparación escalable de cultivos de RPE validados para flujos de trabajo de cribado de alto contenido.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea los modelos de RPE in vitro con fenotipos relevantes para la enfermedad observados en la degeneración macular y otras patologías retinianas.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al facilitar estudios mecanicistas y pruebas terapéuticas.
- Reduce el riesgo de traslación al modelar funciones de RPE relevantes para el ser humano en un sistema controlado.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este protocolo sitúa el cultivo primario de RPE de ratón como una herramienta fundamental que conecta el descubrimiento inicial, la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica en el desarrollo de fármacos oculares.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la prueba de hipótesis y la aclaración mecanicista de la disfunción del epitelio pigmentario retiniano (RPE) en modelos de enfermedad.
- Selección: Ofrece plataformas de ensayo cuantitativas y reproducibles para la evaluación de compuestos y la selección fenotípica.
- Análisis: Proporciona mediciones estandarizadas, como la resistencia eléctrica transepitelial (TER) y tasas de fagocitosis, para la comparación entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Permite alinear hallazgos in vitro con modelos de enfermedad in vivo y con el desarrollo de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo validado y reutilizable para diversos programas de investigación ocular y terapéuticos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios relacionados con el epitelio pigmentario retiniano.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los procedimientos de cultivo celular primario.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir una evaluación preclínica robusta.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos terapéuticos oculares.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia técnica en técnicas de microdisección y cultivo primario de células.
- Exige acceso a instrumentación especializada, como campanas de flujo laminar, incubadoras y herramientas analíticas para ensayos de TER y fagocitosis.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Puede requerir adaptaciones para diferentes cepas de ratones o modelos de enfermedad según los objetivos experimentales.
- La viabilidad y el rendimiento son sensibles al tiempo de disección, la frescura de los reactivos y el control de contaminación.
