Análisis multiplexado de la expresión génica de la retina y la accesibilidad a la cromatina utilizando scRNA-Seq y scATAC-Seq

Este protocolo permitirá el uso de RNA-seq unicelular para el fenotipado inicial. Y, cuando se combina con ATAC-seq de una sola célula, la reconstrucción de las redes reguladoras de genes. El uso de MULTI-seq mantiene bajos los costos para la investigación inicial, y la fijación de muestras pareadas para RNA-seq de una sola célula y ATAC-seq de una sola célula permite el análisis del curso temporal de las redes reguladoras de genes.

Los investigadores pueden utilizar este protocolo para comprender las redes genéticas que controlan el desarrollo y la progresión de la enfermedad. Para comenzar, agregue 20 microlitros de solución de código de barras de anclaje a cada muestra y pipetearla para mezclar. Incubar en hielo durante cinco minutos.

Luego agregue 20 microlitros de solución de co-anclaje a cada muestra e incube en hielo durante otros cinco minutos. Agregue un mililitro de BSA y PBS helados al 1% a cada muestra y centrifugar las células a 300 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante sin alterar la bolita celular.

Luego agregue 400 microlitros de BSA y PBS helados al 1%. Centrifugar a 300 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Determine la concentración de células para cada muestra utilizando un hemocitómetro y calcule el número total de células y el volumen requerido para Gel Bead-in-Emulsion o GEM.

Combinar los volúmenes calculados de cada muestra en un nuevo tubo estéril de 1,5 mililitros y determinar la concentración celular final de las muestras combinadas. Después de la generación de GEM y el código de barras, realice la limpieza del ADNc de la expresión génica utilizando la selección de tamaño, asegurándose de no descartar el sobrenadante de la primera ronda de selección, que contiene el código de barras de la muestra. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y guárdelo en hielo.

Vortex el reactivo de selección de tamaño basado en perlas paramagnéticas y agregue 260 microlitros del reactivo y 180 microlitros de 100% de isopropanol al sobrenadante. Pipetear la mezcla 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Coloque el tubo en una rejilla magnética y espere a que la solución se aclare.

Una vez que la solución esté clara, retire y deseche el sobrenadante. Agregue 500 microlitros de etanol al 80% a las perlas durante 30 segundos, luego deseche el sobrenadante. Repita esto para un total de dos lavados.

Centrifuga brevemente las perlas y devuélvelas a la rejilla magnética. Ajuste el temporizador a dos minutos. A continuación, retire el etanol residual con una pipeta P10 y seque al aire las perlas en la rejilla magnética durante los dos minutos restantes.

Retire las perlas de la rejilla magnética y vuelva a suspenderlas en 100 microlitros de tampón de elución. Pipetear completamente para resuspender e incubar a temperatura ambiente durante dos minutos, luego devolver las perlas a la rejilla magnética y esperar a que la solución se aclare. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mililitros.

Repita la limpieza como se demuestra, utilizando la mitad del volumen del tampón de elución. Para las muestras destinadas a la secuencia scATAC, retire cualquier líquido del tubo de microcentrífuga con una pipeta P200 y congele rápidamente las muestras en hielo seco de etanol. Para disociar las células en las muestras destinadas a la secuenciación de scRNA, realice los pasos de disociación utilizando papaína, como se describe en el texto manuscrito.

Centrifugar las células a 300 x g durante tres minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante sin interrumpir el pellet celular. Agregue un mililitro de PBS refrigerado y mezcle 10 veces o hasta que las células estén completamente suspendidas. Nuevamente, centrifugar a 300 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y repetir el lavado con PBS dos veces.

Comience a vortex el tubo a la velocidad más baja y agregue 900 microlitros de metanol refrigerado, gota a gota, mientras continúa haciendo un vórtice suave del tubo para evitar que las células se aglutinen. Incubar las células en hielo durante 15 minutos. Determinar la concentración de las células fijas utilizando un hemocitómetro y evaluar la eficacia de la etapa de fijación con azul de tripano.

Almacene el tejido congelado y las células fijas a menos 80 grados centígrados. El código de barras de secuencia MULTI permite la secuenciación combinada de múltiples muestras y su posterior deconvolución computacional. La muestra de origen se puede determinar para cada celda en función de su expresión de código de barras.

Estas muestras combinadas se pueden analizar como un único conjunto de datos con fines de agrupación celular e identificación del tipo de célula. Debido a que cada celda tiene un código de barras antes de la generación GEM, los dobletes celulares tendrán una alta probabilidad de mostrar expresión para múltiples códigos de barras de secuencia MULTI, y la mayoría de los dobletes pueden identificarse y eliminarse antes de la agrupación y la identificación del tipo de célula. La secuenciación ATAC de una sola célula se puede utilizar para generar un conjunto de datos con tipos de células que coincidan con los encontrados por la secuenciación de ARN de una sola célula.

El emparejamiento de la expresión génica de secuenciación de ARN de una sola célula y la información de accesibilidad del ADN de secuenciación ATAC de una sola célula permite la reconstrucción de las redes reguladoras de genes. Al intentar el protocolo, tenga en cuenta que el tiempo de dos minutos de la evaporación del etnol es crucial para la recuperación de la secuencia en los pasos de elución posteriores. La reconstrucción de redes reguladoras de genes utilizando ARN-seq unicelular pareado y ATAC-seq de una sola célula produce objetivos para la sobreexpresión de genes y estudios knockout.

MULTI-seq se puede emplear en esta etapa para identificar efectos específicos del tipo de célula.