Name: Análisis multiplexado de la expresión génica de la retina y la accesibilidad a la cromatina utilizando scRNA-Seq y scATAC-Seq (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Aprende a realizar análisis multiplexado de expresión génica y accesibilidad a la cromatina en células de retina mediante scRNA-Seq y scATAC-Seq. Este método permite reconstruir redes regulatorias genéticas de forma rentable.

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Agradecemos a Linda Orzolek del Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core por su ayuda en la secuenciación de las bibliotecas producidas y a Lizhi Jiang por realizar los explantes de retina ex vivo .

<ol><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370, (2020).</li>
<li>Nagalakshmi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transcriptional+Landscape+of+the+Yeast+Genome+Defined+by+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing.</a> Science. 320, 1344-1349 (2008).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental & Molecular Medicine. 50, 96(2018).</li>
<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).</li>
<li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MULTI-seq%3A+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 16, 619-626 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19, 224(2018).</li>
<li>Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+robust+method+for+single+cell+chromatin+accessibility+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling.</a> Nature Communications. 9, 5345(2018).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. , 8598(2020).</li>
<li>Clark, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Analysis+of+Retinal+Development+Identifies+NFI+Factors+as+Regulating+Mitotic+Exit+and+Late-Born+Cell+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification.</a> Neuron. 102, 1111-1126 (2019).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+circulating+immune+cell+landscape+in+aging+and+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19.</a> Protein Cell. 11, 740-770 (2020).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).</li>
<li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Worthington+Biochemical+Corporation.+Papain+Dissociation+System%22">Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System</a>. , (2020).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chromium+Single+Cell+3%27+Reagent+Kits+v3+User+Guide%22">Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide</a>. , (2020).</li>
<li>Agilent. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNF-468+HS+Genomic+DNA+50+kb+Kit+Quick+Guide+for+Fragment+Analyzer+Systems%22">DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems</a>. , (2015).</li>
<li>ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ThermoFisher+Scientific%22">ThermoFisher Scientific</a>. , (2015).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chromium+Single+Cell+ATAC+Reagent+Kits+User+Guide+%28v1.1+Chemistry%29%22">Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry)</a>. , (2020).</li>
<li>Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+neurogenesis+by+somatostatin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14, 865-868 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10, 2907(2019).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Potential+Identified+by+Shared+Single-Cell+Profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. , (2020).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Single-Cell+Analysis+Maps+the+Continuous+Regulatory+Landscape+of+Human+Hematopoietic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation.</a> Cell. 173, 1535-1548 (2018).</li>
<li>Pliner, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cicero+Predicts+cis-Regulatory+DNA+Interactions+from+Single-Cell+Chromatin+Accessibility+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data.</a> Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).</li>
<li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ArchR%3A+An+integrative+and+scalable+software+package+for+single-cell+chromatin+accessibility+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177, 1888-1902 (2019).</li>
<li>METABRIC Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+and+transcriptomic+architecture+of+2%2C000+breast+tumours+reveals+novel+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups.</a> Nature. 486, 346-352 (2012).</li>
<li>Izadi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Connectivity+in+Colorectal+Cancer+Gene+Expression+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Iranian+Biomedical+Journal%22%5BJournal%5D)">Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network.</a> Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).</li>
</ol>

Nada que revelar.

El poder de MULTI-seq se deriva de la integración perfecta de datos de múltiples condiciones o modelos experimentales y el enorme beneficio en términos de costo y limitación de los efectos de lote. La utilización de MULTI-seq ofrece una profundidad de fenotipado de laboratorio sin precedentes. Los métodos de multiplexación no genéticos como el hashing celular o el hashing de núcleos abrieron la puerta a muestras multiplexadas mediante el uso de anticuerpos con código de barras <sup clas...

Comprender cómo los genes pueden influir en el destino celular juega un papel clave en el interrogatorio de procesos como la enfermedad y la progresión embrionaria. Las complejas relaciones entre los factores de transcripción y sus genes diana se pueden agrupar en redes reguladoras de genes. La creciente evidencia coloca estas redes reguladoras de genes en el centro de la enfermedad y el desarrollo a través de los linajes evolutivos1. Mientras que las técnicas anteriores, como la qRT-PCR, se centraban en un solo gen o conjunto de genes, la aplicación de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento permite el perfil de transcriptomas celulares completos.
RNA-seq ofrece una visión de la transcriptómica a gran escala 2,3. La secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) brinda a los investigadores la capacidad no solo de perfilar transcriptomas, sino también de vincular tipos celulares específicos con perfiles de expresión génica4. Esto se logra bioinformáticamente alimentando perfiles celulares individuales en algoritmos de clasificación utilizando marcadores genéticos conocidos5. La multiplexación mediante secuenciación de índices marcados con lípidos (MULTI-seq) ofrece una diversidad sin precedentes en el número de perfiles scRNA-Seq que se pueden recoger6. Esta técnica basada en lípidos difiere de otras técnicas de indexación de muestras, como el hashing celular, que se basan en la presencia de antígenos de superficie y anticuerpos de alta afinidad en lugar de la integración de la membrana plasmática7. Ahora no solo es posible perfilar los perfiles de expresión génica en tipos de células, sino que se pueden combinar diferentes experimentos en una sola biblioteca de secuenciación, lo que reduce drásticamente el costo de un experimento individual de scRNA-seq6. El costo de scRNA-seq puede parecer prohibitivo para su uso en experimentos de fenotipado donde se analizan muchos genotipos, condiciones o muestras de pacientes diferentes, pero la multiplexación permite la combinación de hasta 96 muestras en una sola biblioteca6.
El perfil de la expresión génica a través de scRNA-seq no ha sido la única técnica basada en secuenciación de alto rendimiento que revoluciona la comprensión actual de cómo los mecanismos moleculares dictan el destino celular. Si bien comprender qué transcripciones de genes están presentes en una célula permite la identificación del tipo de célula, igualmente importante es comprender cómo la organización genómica regula el desarrollo y la progresión de la enfermedad. Los primeros estudios se basaron en la detección de la escisión mediada por DNasa de secuencias no unidas a histonas, seguida de la secuenciación de los fragmentos de ADN resultantes para identificar regiones de cromatina abierta. Por el contrario, el ensayo de una sola célula para la secuenciación de cromatina accesible de transposones (scATAC-seq) permite a los investigadores sondear el ADN con un transposón domesticado para perfilar fácilmente la cromatina abierta en el nivel de nucleótido único8. Esto ha pasado por una escala similar a scRNA-seq y ahora los investigadores pueden identificar tipos de células individuales y perfilar fenotipos en miles de genomas individuales8.
El emparejamiento de scRNA-seq y scATAC-seq ha permitido a los investigadores la capacidad de perfilar miles de células para determinar poblaciones celulares, organización genómica y redes reguladoras de genes en modelos de enfermedades y procesos de desarrollo 9,10,11,12. Aquí, los autores describen cómo utilizar primero MULTI-seq para condensar el fenotipado de una miríada de modelos animales y emplear scRNA-seq y scATAC-seq pareados para obtener una mejor comprensión del paisaje de la cromatina y las redes reguladoras en estos modelos animales.

<table><tbody><tr><td>10 y micro; L, 200 y micro; L, 1000 y micro; L puntas</td><td></td><td></td><td></td>de filtro de pipeta</tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; M Solicitud de solución de código de barras</td><td>del laboratorio de Gartner</td><td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested = verdadero</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>100% metanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>322415-100ML</td><td></td></tr><tr><td>10x Chip Holder</td><td>10x Genomics</td><td>1000195</td><td></td></tr><tr><td>10x Chromium controller & Kit de accesorios</td><td>10x Genomics</td><td>PN-120263</td><td></td></tr><tr><td>15mL Tubo de centrífuga</td><td>de calidad biológica</td><td>P886-229411</td><td></td></tr><tr><td>40 y micro; m Filtro de celdas FlowMi</td><td>Bel-Art</td><td>H13680-0040</td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; M Anchor Solution</td><td>Sigma o solicitud del laboratorio de Gartner</td><td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested = 50 verdadero</td><td></td></tr><tr><td>&micro; M Co-Anchor Solution</td><td>Sigma o solicitud del laboratorio de Gartner</td><td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested =verdadero</td><td></td></tr><tr><td>5200 Sistema analizador de fragmentos</td><td>Agilent</td><td>M5310AA</td><td></td></tr><tr><td>70 mmm Filtro de células FlowMi</td><td>Bel-Art</td><td>H13680-0070</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R Centrífuga</td><td>VWR</td><td>BK392302</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Cromo Siguiente Chip GEM G</td><td>10x Genómica</td><td>PN-1000120</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip H</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000161</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.1</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000175</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Single Cell 3' GEM, Biblioteca & Gel Bead Kit v3.1</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000121</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Ice Dry Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVA Foam Ice Pan</td><td>Tequipment</td><td>04393-54</td><td></td></tr><tr><td>FA 12-Capilar Array Corto, 33 cm</td><td>Agilent</td><td>A2300-1250-3355</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Baño de agua Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-20Q</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora con camisa de agua Forma CO2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol 50% Solución acuosa</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific Cámara de conteo Bright-Line Fisher</td><td>Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Illumina NextSeq o NovaSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapa Hifi Hotstart ReadyMix</td><td>HiFi</td><td>7958927001</td><td></td></tr><tr><td>Low TE Buffer Quality</td><td>Biological</td><td>351-324-721</td><td></td></tr><tr><td>Solución de cloruro de magnesio 1 m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Separador magnético Rack para tubos de 1,5 mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-400</td><td></td></tr><tr><td>Bastidor separador magnético para 200 y micro; Tubos en L</td><td>10x Genomics</td><td>NC1469069</td><td></td></tr><tr><td>MULTI-seq Primer</td><td>Sigma o IDT</td><td>Ver lista</td><td></td>de secuencias</tr><tr><td>MyFuge Mini Centrífuga</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1008</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Sustituto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Micropipetas Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>P2, P10, P20, P200, P1000</td> Sistema de disociación de papaína <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada 5424</td><td>R Eppendorf</td><td>2231000655</td><td></td></tr><tr><td>Morteros de pellets desechables sin RNasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus Inhibidor de ARNasa</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td></td></tr><tr><td>RPI cebador</td><td>Sigma o IDT</td><td>Ver lista</td><td></td>de secuencias Kit</tr> de <tr><td>índice único N, conjunto A</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000212</td><td></td></tr><tr><td>Kit de índice único T Set A</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000213</td><td></td></tr><tr><td>Solución de cloruro de sodio 5 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect Kit de reactivos</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia desechables estándar</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure PCR Tira de 8 tubos</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Solución de clorhidrato de Trizma, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano, 0,4% (p/v)</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Universal I5 primer</td><td>Sigma o IDT</td><td>Ver lista</td><td></td>de secuencias</tr><tr><td>Termociclador</td><td>Veriti Mezclador</td><td>de</td> vórtice 4375786 <td></td>aplicado a Biosystems</tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis multiplexado de la expresión génica de la retina y la accesibilidad a la cromatina utilizando scrna-seq y scatac-seq

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

Las potentes técnicas de secuenciación de próxima generación ofrecen un análisis sólido y completo para investigar cómo funcionan las redes reguladoras de genes de la retina durante el desarrollo y en los estados de enfermedad. La secuenciación de ARN unicelular nos permite perfilar de forma exhaustiva los cambios en la expresión génica observados en el desarrollo de la retina y la enfermedad a nivel celular, mientras que el ATAC-Seq unicelular permite perfilar el análisis de la accesibilidad a la cromatina y la unión al factor de transcripción a una resolución similar. Aquí se describe el uso de estas técnicas en la retina en desarrollo, y se demuestra MULTI-Seq, donde las muestras individuales se etiquetan con un complejo oligonucleótido-lípido modificado, lo que permite a los investigadores aumentar el alcance de los experimentos individuales y reducir sustancialmente los costos.

Este flujo de trabajo establece una estrategia para la investigación de fenotipos de desarrollo y procesos regulatorios utilizando la secuenciación de células individuales. La multiplexación de muestras MULTI-seq permite un ensayo inicial de fenotipado de bajo costo, mientras que la recolección y fijación emparejadas de muestras para scRNA-seq y scATAC-seq permite una investigación más profunda (Figura 1).
El código de barras MULTI-seq permite la secuenciación com...

Aquí, los autores muestran la utilidad de MULTI-seq para fenotipar y posteriormente emparejar scRNA-seq y scATAC-seq en la caracterización de los perfiles de accesibilidad transcriptómica y cromatina en la retina.

Análisis multiplexado de la expresión génica de la retina y la accesibilidad a la cromatina utilizando scRNA-Seq y scATAC-Seq

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

Este protocolo permitirá el uso de RNA-seq unicelular para el fenotipado inicial. Y, cuando se combina con ATAC-seq de una sola célula, la reconstrucción de las redes reguladoras de genes. El uso de MULTI-seq mantiene bajos los costos para la investigación inicial, y la fijación de muestras pareadas para RNA-seq de una sola célula y ATAC-seq de una sola célula permite el análisis del curso temporal de las redes reguladoras de genes.Los investigadores pueden utilizar este protocolo para comprender las redes genéticas que controlan el desarrollo y la progresión de la enfermedad. Para comenzar, agregue 20 microlitros de solución de código de barras de anclaje a cada muestra y pipetearla para mezclar. Incubar en hielo durante cinco minutos.Luego agregue 20 microlitros de solución de co-anclaje a cada muestra e incube en hielo durante otros cinco minutos. Agregue un mililitro de BSA y PBS helados al 1% a cada muestra y centrifugar las células a 300 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante sin alterar la bolita celular.Luego agregue 400 microlitros de BSA y PBS helados al 1%. Centrifugar a 300 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Determine la concentración de células para cada muestra utilizando un hemocitómetro y calcule el número total de células y el volumen requerido para Gel Bead-in-Emulsion o GEM.Combinar los volúmenes calculados de cada muestra en un nuevo tubo estéril de 1,5 mililitros y determinar la concentración celular final de las muestras combinadas. Después de la generación de GEM y el código de barras, realice la limpieza del ADNc de la expresión génica utilizando la selección de tamaño, asegurándose de no descartar el sobrenadante de la primera ronda de selección, que contiene el código de barras de la muestra. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y guárdelo en hielo.Vortex el reactivo de selección de tamaño basado en perlas paramagnéticas y agregue 260 microlitros del reactivo y 180 microlitros de 100% de isopropanol al sobrenadante. Pipetear la mezcla 10 veces e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Coloque el tubo en una rejilla magnética y espere a que la solución se aclare.Una vez que la solución esté clara, retire y deseche el sobrenadante. Agregue 500 microlitros de etanol al 80% a las perlas durante 30 segundos, luego deseche el sobrenadante. Repita esto para un total de dos lavados.Centrifuga brevemente las perlas y devuélvelas a la rejilla magnética. Ajuste el temporizador a dos minutos. A continuación, retire el etanol residual con una pipeta P10 y seque al aire las perlas en la rejilla magnética durante los dos minutos restantes.Retire las perlas de la rejilla magnética y vuelva a suspenderlas en 100 microlitros de tampón de elución. Pipetear completamente para resuspender e incubar a temperatura ambiente durante dos minutos, luego devolver las perlas a la rejilla magnética y esperar a que la solución se aclare. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mililitros.Repita la limpieza como se demuestra, utilizando la mitad del volumen del tampón de elución. Para las muestras destinadas a la secuencia scATAC, retire cualquier líquido del tubo de microcentrífuga con una pipeta P200 y congele rápidamente las muestras en hielo seco de etanol. Para disociar las células en las muestras destinadas a la secuenciación de scRNA, realice los pasos de disociación utilizando papaína, como se describe en el texto manuscrito.Centrifugar las células a 300 x g durante tres minutos a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante sin interrumpir el pellet celular. Agregue un mililitro de PBS refrigerado y mezcle 10 veces o hasta que las células estén completamente suspendidas. Nuevamente, centrifugar a 300 x g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, y repetir el lavado con PBS dos veces.Comience a vortex el tubo a la velocidad más baja y agregue 900 microlitros de metanol refrigerado, gota a gota, mientras continúa haciendo un vórtice suave del tubo para evitar que las células se aglutinen. Incubar las células en hielo durante 15 minutos. Determinar la concentración de las células fijas utilizando un hemocitómetro y evaluar la eficacia de la etapa de fijación con azul de tripano.Almacene el tejido congelado y las células fijas a menos 80 grados centígrados. El código de barras de secuencia MULTI permite la secuenciación combinada de múltiples muestras y su posterior deconvolución computacional. La muestra de origen se puede determinar para cada celda en función de su expresión de código de barras.Estas muestras combinadas se pueden analizar como un único conjunto de datos con fines de agrupación celular e identificación del tipo de célula. Debido a que cada celda tiene un código de barras antes de la generación GEM, los dobletes celulares tendrán una alta probabilidad de mostrar expresión para múltiples códigos de barras de secuencia MULTI, y la mayoría de los dobletes pueden identificarse y eliminarse antes de la agrupación y la identificación del tipo de célula. La secuenciación ATAC de una sola célula se puede utilizar para generar un conjunto de datos con tipos de células que coincidan con los encontrados por la secuenciación de ARN de una sola célula.El emparejamiento de la expresión génica de secuenciación de ARN de una sola célula y la información de accesibilidad del ADN de secuenciación ATAC de una sola célula permite la reconstrucción de las redes reguladoras de genes. Al intentar el protocolo, tenga en cuenta que el tiempo de dos minutos de la evaporación del etnol es crucial para la recuperación de la secuencia en los pasos de elución posteriores. La reconstrucción de redes reguladoras de genes utilizando ARN-seq unicelular pareado y ATAC-seq de una sola célula produce objetivos para la sobreexpresión de genes y estudios knockout.MULTI-seq se puede emplear en esta etapa para identificar efectos específicos del tipo de célula.

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En este protocolo, la expresión de genes en la levadura...

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

Un método para el aislamiento de células de la retina individuales y la amplificación posterior de sus ADNc se describe. Una sola célula de la transcriptómica revela el grado de heterogeneidad presente celular en un pañuelo de papel y descubre nuevos genes marcadores de poblaciones celulares raras. El protocolo de acompañamiento se puede ajustar para adaptarse a diferentes tipos de células.

Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

Los cromosomas de diseño del proyecto Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, se pueden distinguir de sus homólogos nativos utilizando un ensayo de genotipado basado en PCR llamado PCRTagging, que tiene un punto final de presencia/ausencia. Aquí describimos un método de detección de PCR en tiempo real de alto rendimiento para el genotipado de PCRTag.

Análisis qPCRTag - Un alto rendimiento, Tiempo real ensayo PCR para Sc2.0 Genotipado

Describimos un método basado en la secuenciación de ARN dirigido que incluye la preparación de bibliotecas de ADNc indexadas, hibridación y captura con sondas personalizadas y análisis de datos para interrogar transcripciones seleccionadas para la expresión génica, mutaciones y fusiones de genes. Targeted RNAseq permite una evaluación rápida y rentable de transcripciones seleccionadas en un secuenciador de escritorio.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

Aquí, presentamos un enfoque combinatorio para clasificar los tipos de células neuronales antes del aislamiento y para la posterior caracterización de los transcriptomas de una sola célula. Este protocolo optimiza la preparación de muestras para el éxito de secuenciación de ARN (RNA-Seq) y describe una metodología diseñada específicamente para la mejora de la comprensión de la diversidad celular.

RNA-Seq de una sola célula de subconjuntos definidos de células de ganglio retiniano

Ensayo para cromatina transposasa accesible junto con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es un método de genoma cromatina accesible de descubrir. Se trata de un protocolo de ATAC-seq paso a paso, desde el molecular al final análisis computacional, optimizado para los linfocitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo puede ser adoptada por los investigadores sin experiencia previa en métodos de secuenciación de próxima generación.

Asignación de genoma cromatina accesible en linfocitos T humanos primarios por ATAC-Seq

Aquí presentamos un método de secuenciación de ARNm de una sola célula multiplexado para perfilar la expresión génica en tejidos embrionarios de ratón. El método de secuenciación de mRNA de una sola célula basada en gotas (scRNA-Seq) en combinación con estrategias de multiplexación puede perfilar celdas individuales de varias muestras simultáneamente, lo que reduce significativamente los costos de reactivos y minimiza los efectos experimentales por lotes.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

ATAC-seq es un método de secuenciación de ADN que utiliza la transposasa mutante hiperactiva, Tn5, para mapear los cambios en la accesibilidad de la cromatina mediada por factores de transcripción. ATAC-seq permite el descubrimiento de los mecanismos moleculares subyacentes a las alteraciones fenotípicas en las células cancerosas. Este protocolo describe los procedimientos de optimización para ATAC-seq en tipos de células epiteliales, incluidas las células cancerosas.

Optimización ATAC-SEQ para la investigación epigenética del cáncer

Aquí presentamos un protocolo ATAC-seq rápido y sencillo para implementarse en un gusano completo de la etapa L4 de Caenorhabditis elegans usando solo 30 μL de pellet de gusano.

Perfilado de accesibilidad de la cromatina en larvas completas de Caenorhabditis elegans L4

Este estudio presenta un protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificación de barras espacial directa de una sección tisular con análisis multioma de célula única. Este enfoque permite simultáneamente un perfilado espacial de expresión génica en células individuales y la modificación de la histona H3K27ac, ofreciendo conocimientos mecanicistas sobre la regulación génica en el contexto de la microanatomía tisular.

Perfilado multiómico integrado de célula única y resuelto espacialmente del transcriptoma y objetivos epigenómicos en secciones de tejido congelado

Aprende a realizar análisis multiplexado de expresión génica y accesibilidad a la cromatina en células de retina mediante scRNA-Seq y scATAC-Seq. Este método permite reconstruir redes regulatorias genéticas de forma rentable.

Análisis multiplexado de la expresión génica de la retina y la accesibilidad a la cromatina utilizando scRNA-Seq y scATAC-Seq

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