Name: Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir del síndrome de Turner (45XO) células fetales para el modelado posterior de déficits neurológicos asociados con el síndrome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas libres de integración a partir de fibroblastos fetales mediante nucleofección con plásmidos episomales. Este protocolo permite caracterizar iPSCs y diferenciarlos en neuronas para modelar déficits neurológicos asociados al síndrome de Turner.

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El apoyo financiero para la investigación anterior fue proporcionado por la Academia de Educación Superior manipal. La caracterización de la línea se realizó parcialmente en el laboratorio de M.M. Panicker en NCBS. Agradecemos a Anand Diagnostic Laboratory por su ayuda con el cariotipo.

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<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Japan+Academy%2C+Series+B%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).</li>
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<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La generación de modelos celulares estables de tejido fetal citogenéticamente anormal es necesaria para perpetuar el fenotipo defectuoso. La ruta iPSC es el método más eficaz de preparación celular para la conservación perpetua de propiedades defectuosas20.
Las células madre pluripotentes (PSC) muestran propiedades de autorrenovación y diferenciación en células especializadas que recuerdan a los embriones de escisión temprana21. Por lo tanto, las...

Las aneuploidies conducen a defectos de nacimiento / malformaciones congénitas y pérdida del embarazo en humanos. ~ 50% -70% de las muestras de pérdidas de embarazo muestran anomalías citogenéticas. Los embriones aneuploides perdidos al principio del embarazo no se pueden obtener fácilmente para el análisis experimental, lo que plantea la necesidad de desarrollar otros modelos que representen estrechamente la embriogénesis humana. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de células diagnosticadas con trastornos genéticos se han utilizado para modelar las irregularidades genéticas representativas y su consecuencia en el desarrollo fetal1,2,3,4. Estas iPSC se asemejan a las células epiblásticas del embrión en desarrollo y pueden recapitular los eventos tempranos de formación embrionaria. Permiten comprender y caracterizar el programa de desarrollo de los linajes celulares y el modelado en embriones de mamíferos tempranos. iPSCs derivadas previamente de fibroblastos cutáneas y amniocitos de pruebas diagnósticas prenatales de síndromes de aneuploidía como monosomía X (síndrome de Turner), trisomía 8 (síndrome de Warkany 2), trisomía 13 (síndrome de Patau) y trisomía parcial 11; 22 (síndrome de Emanuel) han proporcionado información valiosa sobre el desarrollo fallido4.
El síndrome de Turner (STT) es una afección rara caracterizada por infertilidad femenina, baja estatura, trastornos endocrinos y metabólicos, un mayor riesgo de enfermedad autoinmune y una predisposición a la enfermedad cardiovascular5. Aunque es el único síndrome de monosomía que puede superar, también es letal para el embrión en desarrollo causando abortos espontáneos6. Los individuos sobrevivientes con SST presentan grados de alteración del material cromosómico X en sus células. Los cariotipos van desde la pérdida completa de un cromosoma X (45,XO) hasta mosaicos como 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, la presencia de cromosomas en anillo, la presencia de material cromosómico Y,etc. 5.
El diagnóstico del síndrome generalmente se realiza mediante el cariotipo de sangre de individuos sintomáticos y el muestreo de vellosidades coriónicas (CVS) para detectar síndromes de aneuploidía temprana. Dado que los síndromes de aneuploidía representan ~ 30% de los abortos espontáneos, es rutinario cariotipar el producto de la concepción (POC) en un aborto espontáneo. Estas células fetales, incluidas las vellosidades coriónicas que poseen la anomalía citogenética y las iPSC derivadas de ellas, proporcionan una valiosa fuente de material biológico para estudiar los síndromes de aneuploidía4,6. Las iPSC de TS se han establecido previamente a partir de amniocitos a través de la reprogramación retroviral4,fibroblastos de vellosidades coriónicas (obtenidos a través del diagnóstico prenatal) a través de la reprogramación retroviral6,de células mononucleares sanguíneas7 a través de la reprogramación del virus de Sendai y de fibroblastos de la piel de los individuos de TS a través de la reprogramación lentiviral4 . Dado que el enfoque principal de nuestro laboratorio es comprender el fracaso del desarrollo, hemos generado IPSC TS a partir de POC, específicamente el componente de vellosidades coriónicas de un aborto espontáneo8. Todas las células aisladas de este tejido fetal tenían un cariotipo 45XO y producían iPSCs con el mismo cariotipo. Estas iPSC son únicas, ya que son las primeras que se generan a partir de un feto abortado y proporcionan un recurso valioso para estudiar las fallas del embarazo relacionadas con la aneuploidía. Este artículo proporciona una metodología detallada de la generación de iPSC a partir de esta fuente celular única a través de la reprogramación episomal.
Los primeros métodos de generación de iPSC utilizaron la transducción viral y los transposones para administrar los factores de reprogramación. Los métodos de inducción de células a la pluripotencia han evolucionado desde el uso de vectores retrovirales integradores9,vectores lentivirales excisables10,11 y métodos basados en transposones12 hasta vectores adenovirales no integradores13 y vectores basados en virus de Sendai14. La reprogramación basada en retrovirales y lentivirales, aunque eficiente, implica la integración de los factores de reprogramación en los cromosomas del huésped, causando mutaciones de inserción que tienen efectos imprevistos en las iPSC. Además, la reprogramación basada en virus impide la aplicación traslacional de iPSC. Se han explorado los sistemas basados en ARN15 y la entrega directa de proteínas16 para eliminar por completo los riesgos potenciales asociados con el uso de virus y transfecciones de ADN. Sin embargo, estos métodos han demostrado ser ineficientes.
En 2011, Okita et al. informaron una mejora en la eficiencia de la reprogramación por plásmidos episomales aumentados con la supresión de TP53 a través de shRNA. También reemplazaron cMYC con LMYC no transformador (MYC asociado al carcinoma de pulmón de células pequeñas) para mejorar la seguridad de las hiPSC. Estos plásmidos episomales expresan 5 factores de reprogramación: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC y shRNA para TP5317,18. Estos vectores se mantienen extracromosómicamente y se pierden de las células reprogramadas en el cultivo continuo, lo que hace que las líneas estén libres de transgenes dentro de 10-15 pasajes. La nucleofection es una forma especializada de electroporación que suministra ácidos nucleicos directamente al núcleo de las células huésped. Es un método eficiente para la entrega de los plásmidos de reprogramación en varios tipos de células. Los plásmidos episomales son rentables y compensan los altos costos de la nucleofección. Este método es eficiente y reproducible en condiciones optimizadas, produciendo iPSC estables a partir de una variedad de células somáticas. En este protocolo, describimos el método para la generación de iPSCs a partir de fibroblastos aislados del tejido fetal por nucleofección de plásmidos de reprogramación episomal. Aquí están los protocolos detallados para el aislamiento de fibroblastos de vellosidades coriónicas fetales, purificación de plásmidos, nucleofection, selección de colonias de la placa de reprogramación y establecimiento de iPSC estables.
Es esencial confirmar la presencia de rasgos de pluripotencia en las iPSC recién generadas. Esto incluye la demostración de factores relacionados con la pluripotencia (por ejemplo, expresión de fosfatasa alcalina, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherina; generalmente se muestra con ensayos de inmunofluorescencia o expresión génica), identificación de las tres capas germinales mediante ensayos de diferenciación in vitro para validar sus potenciales de diferenciación, cariotipo para determinar el contenido cromosómico, tipificación STR para establecer identidad con células madre, verificar la pérdida de genes exógenos, y ensayos in vivo más estrictos, como la formación de teratomas y la complementación tetraploide. Aquí describimos protocolos de caracterización de cariotipo, tinción de fosfatasa alcalina de células vivas, detección de biomarcadores relacionados con la pluripotencia por inmunofluorescencia, ensayos de diferenciación in vitro y método para demostrar pérdida de genes exógenos19.

<table><tbody><tr><td>0,15% de tripsina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>27250018 G Banding</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>Pluripotencia y medio corporal embrioide</td></tr><tr><td>4', 6 diamidino-2-fenilindol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Activina A</td><td>Sigma Aldrich SRP3003</td><td></td><td>Ensayos</td></tr> <tr><td>de diferenciaciónTinción viva de fosfatasa alcalina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td>Tinción AP</td></tr><tr><td>AMAXA Nucleofector II</td><td></td> Lonza-Nucleofection <td></td><td></td></tr><tr><td>AmnioMAX II medios completos</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>11269016</td><td>Medio específico para cultivos de células de vellosidades coriónicas fetales</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>HiMedia</td><td>TC021</td><td>Purificación de plásmidos</td></tr><tr><td>Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti Conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti Conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15240096</td><td>Control de</td></tr> <tr><td>la contaminaciónAnti-E-Cadherina</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-Nanog</td><td>BD Biosciences</td><td>560109</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-OCT3/4</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>BD Biosciences</td><td>561590</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>BD Biosciences</td><td>561469</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>560073</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Anti-TRA 1-81</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>básica Factor de Crecimiento de Fibroblastos[FGF2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td>Medio de pluripotencia</td></tr><tr><td>Factor Morfogenético Óseo 4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3016</td><td>Ensayos de diferenciación</td></tr><tr><td>Bovino Albúmina sérica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td>Colágeno bloqueante</td></tr><tr><td>humano tipo IV</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>354245 Ensayos de diferenciación</td></tr><tr><td>Mezcla de colagenasa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8051</td><td>Digestión de vellosidades coriónicas fetales</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Ensayos de diferenciación</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td>Ensayos de diferenciación</td></tr><tr><td>FastDigest EcoR1</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Digestión de restricción</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2518</td><td>Ensayos de diferenciación</td></tr><tr><td>Tinción de Giemsa HiMedia</td><td></td><td>S011</td><td>G Bandas</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>HiMedia</td><td>AS001</td><td>Fijador para cariotipo</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td>Ensayos de diferenciación</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Pluripotencia y medio corporal embrioide</td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Ensayos de diferenciación</td></tr><tr><td>Solución de insulina humana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td>Ensayos de diferenciación</td></tr><tr><td>Insulina Transferrina Selenita</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1884</td><td>Ensayos de diferenciación</td></tr><tr>:<td>KAPA HiFi PCR kit</td><td>Kapa Biosystems</td>, <td>KR0368</td><td>OriP, EBNA1, PCR,</td></tr><tr><td>KaryoMAX, Colcemid</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td>, <td>15210040</td><td>Detención mitótica para el cariotipo,</td></tr><tr><td>KnockOut, DMEM,</td><td>Thermo Fisher Scientific</td>, <td>10829018</td><td>Pluripotencia y medio corporal embrioide</td></tr>, <tr><td>KnockOut Serum Replacement</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td>, <td>10828028</td><td>Pluripotencia y medio corporal embrioide</td></tr><tr><td>Luria Bertani</td> agar <td>HiMedia</td><td>M1151F</td><td>Purificación de plásmidos</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>Ensayos de diferenciación</td><td></td></tr><tr><td>356234 MEM Aminoácidos no esenciales</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Pluripotencia y medio corporal embrioide</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>HiMedia</td><td>MB113</td><td>Fijador para cariotipo</td></tr><tr><td>Cadena pesada ventricular de miosina &alfa;/&beta;</td><td>Millipore</td><td>MAB1552</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>NHDF Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>VAPD-1001</td><td>Nucleofección</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Células de fijación</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td>Plásmido de reprogramación episomal</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td>Plásmido de reprogramación episomal</td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td>Reprogramación episomal Penicilina plásmida</td></tr><tr><td>estreptomicina</td><td>&nbsp; Thermo Fisher Scientific,</td><td>&nbsp; 15070063</td><td>Pluripotencia y medio corporal embrioide</td></tr><tr><td>Faloidina- Tetrametilrodamina B isotiocianato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1951</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>1 X PBS 1 tableta de PBS disuelta en 200mL de agua desionizada y esterilizada por autoclave Almacenamiento: Temperatura ambiente. PBST- 0.05% Tween 20 en 1X PBS. Almacenamiento: Temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Kit de purificación de plásmidos - Preparación Midi</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td><td>Purificación de plásmidos</td></tr><tr><td>Solución de cloruro de potasio</td><td>HiMedia</td><td>MB043</td><td>Solución hipotónica para cariotipo</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Kit</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Aislamiento genómico de ADN</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td>Medio de diferenciación de hepatocitos</td></tr><tr><td>Citrato de sodio</td><td>HiMedia</td><td>RM255</td><td>Solución hipotónica para el cariotipo</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>MB031</td><td>Tripsina de permeabilidad-EDTA</td></tr><tr><td>(0,05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td></td><td>25300054 Subcultivo de &nbsp; vellosidades coriónicas fetales fibroblastos</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td>Preparación de PBST</td></tr><tr><td>&beta; III Tubulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>Inmunocitoquímica</td></tr><tr><td>Y-27632 diclorhidrato Sigma</td><td>Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Ensayos de diferenciación</td></tr></tbody></table>

generación de células madre pluripotentes inducidas a partir del síndrome de turner (45xo) células fetales para el modelado posterior de déficits neurológicos asociados con el síndrome

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Las aneuploidias cromosómicas causan malformaciones congénitas graves, incluidas malformaciones del sistema nervioso central y muerte fetal. El cribado genético prenatal es puramente diagnóstico y no aclara el mecanismo de la enfermedad. Aunque las células de fetos aneuploides son material biológico valioso que soporta la aneuploidía cromosómica, estas células son de corta duración, lo que limita su uso para experimentos de investigación posteriores. La generación de modelos de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) es un método eficaz de preparación celular para la conservación perpetua de rasgos aneuploides. Se autorrenovan y se diferencian en células especializadas que recuerdan al desarrollo embrionario. Por lo tanto, las iPSC sirven como excelentes herramientas para estudiar los eventos tempranos del desarrollo. El síndrome de Turner (TS) es una afección rara asociada con la falta total o parcial de un cromosoma X. El síndrome se caracteriza por infertilidad, baja estatura, trastornos endocrinos, metabólicos, autoinmunes y cardiovasculares y defectos neurocognitivos. El siguiente protocolo describe el aislamiento y cultivo de fibroblastos a partir de tejido fetal TS (45XO), generación de TSiPSC libres de integración a través de la entrega de plásmidos de reprogramación episomal por nucleofection seguido de caracterización. Las TSiPSC de reprogramación se examinaron inicialmente mediante tinción de fosfatasa alcalina de células vivas seguida de un sondeo extenso para detectar biomarcadores de pluripotencia. Las colonias seleccionadas fueron diseccionadas mecánicamente, pasadas varias veces y se utilizaron células estables autorrenovadoras para experimentos posteriores. Las células expresaron factores de transcripción de pluripotencia OCT4, NANOG, SOX2, marcadores de superficie celular SSEA 4 y TRA1-81 típicos de las células madre pluripotentes. El cariotipo 45XO original se mantuvo después de la reprogramación. Las TSiPSCs fueron capaces de formar cuerpos embrioides y diferenciarse en células de endodermo, mesodermo y ectodermo expresando biomarcadores específicos del linaje ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Los plásmidos episomales exógenos se perdieron espontáneamente y no se detectaron después del paso 15 en las células. Estas TSiPSC son un valioso recurso celular para modelar el neurodesarrollo molecular y celular defectuoso que causa déficits neurocognitivos asociados con el síndrome de Turner.

Generación de iPSCs sin integración a partir de un feto abortado espontáneamente con cariotipo 45XO Se aislaron fibroblastos de FCV con un cariotipo 45XO específico del síndrome de Turner (ST) y se nucleofectaron con plásmidos de reprogramación episomal para generar TSiPSCs que pueden ser utilizados para el modelado posterior del síndrome, específicamente los déficits neurológicos asociados (Figura 1a&amp;b). Se utilizaron vectores episomales no indesingr...

Este protocolo describe la generación de iPSC libres de integración a partir de fibroblastos de tejido fetal a través de la administración de plásmidos episomales por nucleofection seguido de la descripción de los métodos utilizados para la caracterización de iPSC y la diferenciación neuronal.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir del síndrome de Turner (45XO) células fetales para el modelado posterior de déficits neurológicos asociados con el síndrome

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

El síndrome de Turner es una afección rara asociada con la falta total o parcial del cromosoma X. El síndrome se caracteriza por infertilidad, baja estatura, trastornos cardiovasculares y defectos neurocognitivos. En algunos casos, causa la muerte fetal.Aunque las células somáticas de los fetos aneuploides son biológicamente valiosas, son de corta duración, lo que limita su uso en la investigación. La generación de iPSC es, por lo tanto, un método eficaz de preparación celular para la conservación perpetua de los rasgos aneuploides. Se autorrenovan y pueden diferenciarse en tipos de células especializadas que recuerdan el desarrollo embrionario temprano.La entrega de plásmidos de reprogramación episomal no integradores a través de la ficción nuclear es un método eficiente y reproducible para generar iPSC completamente reprogramados y estables. Este método también se puede utilizar en células que son difíciles de programar. En este protocolo describimos la regeneración de iPSCs a partir de material fetal con anepupliod.Transfiera las vellosidades coriónicas fetales recolectadas a una placa de Petri estéril. Lávelo varias veces con PBS que contenga 1X solución antimicótica antibiótic

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.

La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

El Inducible Stemgent Dox ratón TF Set Lentivirus puede reprogramar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células. Aquí se demuestra el protocolo para la expresión de DOX-inducible de los factores de la transcripción del ratón reprogramación Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc para generar iPS colonias que expresan marcadores comunes MES pluripotencia.

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

Un método sencillo y fiable en el aislamiento y cultivo de células madre neurales en humanos descartados tejido cortical fetal se describe. Cultivos derivados de enfermedades neurológicas conocidas humanos pueden ser utilizados para la caracterización de los patológicos procesos celulares y moleculares, así como ofrecer una plataforma para evaluar la eficacia farmacológica.

Generación de las células troncales nerviosas de desechados Humanos tejido cortical fetal

Este protocolo implica procedimientos detallados para el aislamiento de células derivadas de la orina de pacientes con distrofia muscular; su reprogramación eficiente y rápida a través de la transducción del virus de Sendai.

Generación de pluripotentes inducidas Células Madre de la distrofia muscular pacientes: Eficiente Reprogramación-Integración libre de orina células derivadas

Este protocolo describe cómo se pueden diferenciar las células progenitoras neurales de las células madre pluripotentes inducidas humanas, con el fin de producir una población de células neuronales robusta y replicativa, que puede usarse para identificar las vías de desarrollo que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad en muchos trastornos neurológicos.

Una guía para la generación y uso de hiPSC NPCs derivados para el Estudio de las Enfermedades Neurológicas

En este estudio, generamos células madre pluripotentes inducidas a partir de células de líquido amniótico de ratón, utilizando un sistema de transposones no viral.

La producción de células madre pluripotentes a partir de células de ratón amniótico líquido mediante un sistema de transposón

El modelado del desarrollo del cerebro humano se ha visto obstaculizado debido a la complejidad sin precedentes del tejido epitelial neural. Aquí, se describe un método para la generación robusta de organoides cerebrales para delinear eventos tempranos del desarrollo del cerebro humano y para modelar la microcefalia in vitro.

Generación de derivados de IPSC organoides cerebro humano para modelar los trastornos del neurodesarrollo temprano

Este protocolo describe la reprogramación de primaria amniótico líquido y membrana de las células madre mesenquimales en células pluripotentes inducidas mediante un enfoque episomal no integrar en condiciones totalmente químicamente definidas. Se detallan los procedimientos de extracción, cultivo, reprogramación y caracterización de las células pluripotentes inducidas resultante por métodos rigurosos.

Reprogramación de primario líquido amniótico y las células de la membrana a pluripotencia en condiciones libres de Xeno

Se describe un protocolo para reprogramar fibroblastos derivados de la piel humana en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs), y su posterior diferenciación en astrocitos inducidos (iAs). Este método conduce a la generación rápida y reproducible de iNPCs e iAs en grandes cantidades.

Modelado in vitro para enfermedades neurológicas utilizando la conversión directa de fibroblastos a células progenitoras neuronales y la diferenciación en astrocitos

Este protocolo describe una metodología para recapitular la neurogénesis alterada del síndrome de Down (SD) utilizando iPSC humanas con SD. El protocolo identificó el defecto del ciclo celular bifásico como la causa de la neurogénesis alterada en el síndrome de Down. Proporciona una plataforma sólida para comprender los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a la neurogénesis anormal asociada con el SD.

In vitro Modelado de la neurogénesis del síndrome de Down utilizando células madre pluripotentes inducidas por humanos

Aquí describimos un protocolo que facilita la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas humanas en astrocitos funcionales específicos del prosencéfalo. Esto permite investigar el papel de las células gliales en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo, como el síndrome del cromosoma X frágil, y modelar otros trastornos cerebrales.

Generación y caracterización de astrocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanamente que carecen de ribonucleoproteína mensajera X frágil

Aprende a generar células madre pluripotentes inducidas libres de integración a partir de fibroblastos fetales mediante nucleofección con plásmidos episomales. Este protocolo permite caracterizar iPSCs y diferenciarlos en neuronas para modelar déficits neurológicos asociados al síndrome de Turner.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir del síndrome de Turner (45XO) células fetales para el modelado posterior de déficits neurológicos asociados con el síndrome (Video) | JoVE Journal

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir del síndrome de Turner (45XO) células fetales para el modelado posterior de déficits neurológicos asociados con el síndrome

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