Name: Evaluación de las interacciones de proteínas en células vivas con emisión sensibilizada por FRET (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a cuantificar FRET en células vivas mediante microscopía confocal y algoritmos matemáticos. Este método permite detectar interacciones proteicas en tiempo real y estudiar señalización celular con precisión.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nos gustaría agradecer al Servicio de Imágenes de Neurociencia de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford por proporcionar equipos y espacio para este proyecto. Esta investigación fue apoyada por fondos intramuros del Instituto de Cáncer de Stanford y la División de Oncología Ginecológica de Stanford, así como GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación, Hungría.

1. Construcción de plásmidos
<ol><li>Para generar la sonda de fusión eGFP-mCherry1, utilice un vector de expresión celular de mamíferos N1 (consulte la Tabla de materiales) con mCherry110 insertado utilizando los sitios de restricción AgeI y BsrGI.</li>
	<li>Utilice los siguientes oligonucleótidos para amplificar eGFP11 sin un codón de parada como fragmento SalI-BamHI : cebador N-terminal 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' y C-terminal cebador 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.</li>
	<li>Inserte este fragmento SalI-BamHI en el sitio de clonación múltiple del vector N1 para introducir el enlazador RNPPV (cinco aminoácidos) entre la proteína fluorescente verde y roja. NOTA: Este enlazador produce una eficiencia FRET media para el par donante-aceptor GFP-Cherry de aproximadamente 0.25 -0.3 (Figura 1A). La elección de enlazadores rígidos12 yhelicoidales 13 de diferentes longitudes para escalar las eficiencias FRET medidas se ha discutido en otra parte, pero no es necesaria para nuestro propósito de la proteína de fusión. En el futuro, por simplicidad, llamaremos a las proteínas fluorescentes 'GFP' y 'Cherry'.</li>
</ol>2. Cultivo celular y transfección
<ol><li>Utilice cualquier línea celular, por ejemplo, células NRK, para experimentos FRET en medios, por ejemplo, medios de Eagle modificados de Dulbecco (DMEM), sin rojo fenol, para reducir la fluorescencia de fondo. Por la misma razón, se recomienda el uso de tripsina libre de rojo fenol.</li>
	<li>Una vez que las células son 80% confluentes, separe las células con 1 ml de tripsina-EDTA al 0,05%, cuente el número de células en suspensión utilizando una cámara Neubauer y siembre aproximadamente 10,000 células por pocillo de un vidrio de cubierta con cámara de 8 pocillos; alternativamente, a partir de un cultivo celular confluente cultivado en matraz T25, utilizar 1 gota de suspensión celular de una pipeta de 2 ml o 3 gotas de una suspensión celular de 5 ml de un cultivo confluente cultivado en un matraz de cultivo de células T 12,5.</li>
	<li>Cultivar células en cámaras de 8 pocillos (0,8 cm2 / pocillo) con vidrio de cubierta #1.0 para microscopía de células vivas de fluorescencia en condiciones de cultivo celular estándar (37 ° C y 5% deCO2).</li>
	<li>24 h después del recubrimiento transfecten las células utilizando un medio de transfección apropiado disponible comercialmente (ver Tabla de materiales), con GFP, cereza, GFP / mezcla de cereza (mezcla 1: 1, es decir, 0.8 μg y 0.8 μg GFP y ADN plásmido de cereza), y la quimera GFP-cereza.<ol><li>Para la transfección, use 5 μL del reactivo de transfección en 45 μL de DMEM y 1.6 μg de ADN plásmido. Revuelva moviendo suavemente el tubo de microcentrífuga.</li>
		<li>Después de 15 minutos de incubación de la mezcla a temperatura ambiente, agregue 1-2 μL de la mezcla de reactivos de transfección a cada pocillo del portaobjetos de la cámara de 8 pocillos. Devuelva el vidrio de la cubierta con cámara a la incubadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Deje transcurrir 20 h después de la transfección antes de la obtención de imágenes de células vivas, para permitir la expresión, el plegamiento y la maduración adecuados de las proteínas fluorescentes, especialmente del fluoróforo rojo.</li>
</ol>3. Imágenes FRET
<ol><li>Imagen de células transfectadas en una cámara ambiental humidificada y calentada a 37 °C. Para amortiguar los medios celulares a pH fisiológico, use gas CO 2 ajustado al 5% de flujo, o agregue 20 mM HEPES para hacer que el medio celular sea independiente del CO2.</li>
	<li>Use un microscopio de escaneo láser confocal. Establezca la excitación y la emisión de la siguiente manera para optimizar la señal y minimizar la diafonía.<ol><li>Utilice la línea de 488 nm del láser de iones de argón para excitar GFP y el láser de estado sólido bombeado por diodo de 561 nm (o láser de helio neón de 543 nm, dependiendo de las líneas láser disponibles) para excitar Cherry.</li>
		<li>Establezca lo siguiente en el software de un microscopio confocal comercial. Ajuste el espejo dicroico a 488/ 561 haciendo clic en el botón usando el menú desplegable. Recoja la fluorescencia utilizando luz láser de 488 nm para la excitación en el canal 1 a través de una banda de emisión de 505 - 530 nm (o 505 - 550 nm) y en el canal 2 con un filtro de paso largo &gt;585 nm y use la luz láser de 561 nm para la excitación en el canal 3 con un filtro de paso largo &gt; 585 nm (tipo en longitudes de onda). También se pueden usar filtros de paso de banda, por ejemplo, 590 - 650 nm o similares, que tienen la ventaja de excluir la dispersión Raman.</li>
	</ol></li>
	<li>Excite con los dos láseres secuencialmente y configure el modo de imagen en Switch después de cada línea para que la excitación de la imagen de 512 x 512 píxeles se alterne después de cada línea (y no después de cada fotograma, lo que abrogaría la capacidad de detectar FRET debido a la difusión de las proteínas marcadas mientras graba las imágenes con diferentes excitaciones; clic en el botón).</li>
	<li>Configure una miniserie temporal de tres imágenes haciendo clic en el botón para detectar si se produce un fotoblanqueo significativo y reducir potencialmente la potencia del láser. El fotoblanqueo de menos del 1% es óptimo. La alta intensidad del láser también puede conducir a la saturación de absorción reduciendo la eficiencia aparente de FRET14. La potencia del láser, hasta 10-20 μW medida en la lente del objetivo es segura de usar.</li>
	<li>Primero, las células de imagen que expresan la construcción de fusión GFP-Cherry. Establezca los parámetros que definen la intensidad láser integrada en el tiempo por píxel en una imagen confocal, es decir, el tiempo de permanencia del píxel en microsegundos, la transmisión del filtro sintonizable acústico-óptico (AOTF) en porcentaje y el zoom.<ol><li>Celdas de imagen con un objetivo de aceite de 63x y zoom ajustado a 3x. Esto proporciona suficiente ampliación y resolución a las celdas de imagen en su totalidad. Apunte a un tamaño de píxel de 70-80 nm.</li>
		<li>Establezca el tiempo de permanencia de Pixel en 2-4 μs y la transmisión AOTF para el láser de 488 nm y 561 nm de modo que las imágenes tengan una buena relación señal-ruido sin blanqueamiento y sin píxeles que muestren saturación de intensidad de fluorescencia. Es ventajoso ajustar la potencia del láser de 488 y 561 de modo que los niveles de señal en el canal 1 y el canal 3 sean similares.</li>
		<li>Establezca la ganancia del fotomultiplicador (modo promedio) en 600-800.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagen con estos ajustes 15-20 células que expresan la proteína de fusión GFP-Cherry. Las 15-20 celdas proporcionan buenas estadísticas mientras mantienen el tiempo total de una sesión de medición FRET limitado a unas pocas horas para ayudar a garantizar la estabilidad de la configuración microscópica.</li>
	<li>Imagen con las mismas celdas de configuración que expresan GFP, Cherry, GFP y Cherry y celdas no transfectadas. Busque celdas de expresión en el canal verde o en el canal rojo, respectivamente.</li>
	<li>Luego, se imagina 15-20 células que co-expresan proteínas de interés acopladas a GFP y Cherry, respectivamente. Buscando células de expresión, evite la exposición prolongada de las células para no blanquear las proteínas fluorescentes. La cereza tiene una fotoestabilidad más baja que la GFP, y la cereza blanqueadora, el aceptor compromete el análisis FRET. NOTA: Los espectros de absorción y emisión de GFP y Cherry se muestran en la Figura Suplementaria 1. Después de medir durante 5-6 h, es aconsejable repetir la imagen de algunas células que expresan la quimera GFP-Cherry al final de la sesión de imagen para documentar que la configuración se mantuvo estable y detectó que las eficiencias FRET de la proteína de fusión GFP-Cherry no cambiaron significativamente durante el transcurso de una sesión de imágenes.</li>
</ol>4. Análisis de imágenes para detectar eficiencias FRET absolutas mediante enfriamiento de donantes y emisión sensibilizada
NOTA: Aquí, se proporciona una guía práctica paso a paso sobre cómo determinar la eficiencia de FRET con el uso de la hoja de cálculo adjunta (Archivo complementario 2). La teoría y la derivación de las ecuaciones presentadas se pueden encontrar en detalle en publicaciones anteriores 4,15,16,17. Con los ajustes descritos, se recogen las siguientes intensidades de fluorescencia.
<ol><li>Mida la señal donante I 1 en el canal 1, el canal donante, con excitación de 488 nm y una banda de emisión de 505-530 nm. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq02.jpg"> donde ID es la señal donante no apagada en el canal 1 que se mediría en ausencia de un aceptor, es la eficiencia FRET media, y B 1 la señal de fondo promedio en el canal 1.</li>
	<li>Mida la señal aceptora I 3 en el canal 3, el canal aceptor, con excitación y emisión de 561 nm a &gt;585 nm. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq03.jpg"> donde IA es la señal aceptora y B 3 el fondo en el canal 3.</li>
	<li>Mida la señal FRET en el canal 2, el canal de transferencia, con excitación y emisión de 488 nm a &gt;585 nm. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq04.jpg"> Donde, la señal en el canal 2 es una suma de cuatro componentes diferentes: (i) I D(1 - E)S 1 es el derrame espectral de la señal donante apagada al canal de detección &gt;585 (con el factor de diafonía S 1), (ii) IA S 2 es la señal aceptora de la excitación directa por luz de 488 nm (con el factor de diafonía S2), iii) IDEα es la emisión sensibilizada del aceptor por FRET de la molécula donante excitada (α se detallará más adelante en 4.8. - 4.10.), y (iv) B2 es la señal de fondo.</li>
	<li>Medir las intensidades de fondo promedio en los canales 1, 2, 3 en células no transfectadas o simuladas; cualquiera de los dos está bien con una diferencia insignificante. Para todas las mediciones celulares, use la herramienta a mano alzada para delinear regiones de interés y evitar vesículas perinucleares con mayor autofluorescencia. Es importante evitar la autofluorescencia significativa de estas vesículas perinucleares.<ol><li>Introduce las medidas en las columnas X, Y y Z de la hoja de cálculo proporcionada. Las intensidades de fondo promedio en los 3 canales se ingresan en A2, B2 y C2 de la hoja de cálculo de Excel (Archivo complementario 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Mida las intensidades promedio en los canales 1, 2, 3 de las celdas que expresan GFP o Cherry solo, e ingrese las mediciones en las columnas C, D, E y N, O, P. Las intensidades de fondo respectivas se restan (en F, G, H y Q, R, S).</li>
	<li>Para calcular E, la eficiencia FRET, determina los factores de diafonía S 1 y S2. El factor de diafonía espectral S1 se calcula a partir de células que expresan solo GFP <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq6v5.png"> en la columna I. Introduzca el valor medio de S1 en la celda D2 de la hoja de cálculo de Excel.</li>
	<li>Calcular el factor de diafonía espectral S2 a partir de células que expresan solo Cherry <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq07.jpg"> en la columna T. Introduzca la media de S2 en la celda E2 de la hoja de cálculo de Excel.</li>
	<li>Asegúrese de que el factor α relaciona la señal de cualquier número dado de moléculas GFP excitadas en el canal 1 con la señal de un número igual de moléculas de Cherry excitadas en el canal 2, y se define por <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq08.jpg">   <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq13v5.png"> donde Q A y QD son los rendimientos cuánticos de fluorescencia de Cherry y GFP; ηA y ηD las eficiencias de detección de fluorescencia aceptora y donante en los canales 2 y 1, respectivamente. NOTA: El factor α podría determinarse a partir de dos muestras que expresan cantidades absolutas conocidas de GFP y Cherry. Sin embargo, es imposible saber la cantidad exacta de GFP y Cherry expresada en una célula. Por lo tanto, calculamos el factor utilizando células que expresan la proteína de fusión GFP-Cherry. Aquí, aunque la cantidad absoluta aún se desconoce, se sabe que la proporción de moléculas donantes y aceptoras es una.</li>
	<li>Mida las intensidades medias en los canales 1, 2, 3 de las células que expresan la proteína de fusión GFP-Cherry, e introduzca las mediciones en las columnas AE, AF, AG. Las intensidades de fondo se restan (en AH, AI, AJ).</li>
	<li>Calcule el factor α (columna AJ) a partir de las intensidades de fluorescencia en los canales 1, 2 y 3 de la proteína de fusión GFP-Cherry de la siguiente manera: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq10v6.png"></li>
	<li>Las intensidades corregidas de fondo medidas en el canal 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B 2) y 3 (I 3 - B3), respectivamente, se miden utilizando la quimera GFP-Cherry. El factor de diafonía espectral S1 se determinó utilizando células que expresan GFP solamente (ver 4.7.). εD y ε A son los coeficientes de extinción de GFP, el donante, y Cherry, el aceptor, a 488 nm, y pueden determinarse a partir de la literatura (ε GFP = 53.000 M-1 cm-1)18 y la curva de absorción de Cherry (εCherry ≈ 5560 M-1cm 1). La proporción <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq11.jpg"> se ha introducido en la celda G2 de la hoja de cálculo de Excel. Introduzca el valor medio del factor α en J2.</li>
	<li>Utilice el factor α determinado para el cálculo de la eficiencia FRET, E, como sigue (columna AK): <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq12v6.png"></li>
	<li>Alternativamente, determine la eficiencia FRET, E, para los controles negativos, es decir, la coexpresión de GFP y Cherry y la expresión de GFP sola agregando las mediciones de los canales 1, 2 y 3 en la hoja de Excel en la columna AD, AE y AF bajo las mediciones de proteínas de fusión GFP-Cherry. Determinar las eficiencias FRET entre las proteínas de interés marcadas con GFP y Cherry de la misma manera.</li>
	<li>Determine la intensidad del donante insaciable, I D as (I 1 - B 1)/(1 - E), y la intensidad del aceptor como I A = I 3 - B3; Estos valores son proporcionales a los niveles de expresión de las proteínas marcadas.</li>
	<li>Determine la relación de intensidad (Q) aceptor-donante corregida de la proteína de fusión GFP-Cherry de la siguiente manera (columna AL): <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq13v5.png"></li>
	<li>Para otras células cotransfectadas, calcule la relación molecular aceptor-donante N A/ND de la siguiente manera: <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq14.jpg"> NOTA: La justificación para determinar la relación N A / N D y trazar la eficiencia celular media de FRET E versus N A / N D, es que una molécula donante puede transferir energía a múltiples aceptores, mientras que una molécula aceptora solo puede recibir energía de un donante en un momento dado. Incluso si solo un aceptor puede interactuar con un donante debido a la estequiometría de la interacción, se espera que un aumento de la concentración del aceptor aumente la fracción de donantes en complejo con el aceptor debido a la ley de acción de masas. Por lo tanto, para una expresión donante fija (o rango estrecho de), la eficiencia FRET debería aumentar con el aumento de N A / ND. Sin embargo, al trazar la eficiencia FRET E versus N A/N D para la coexpresión de GFP y Cherry, es decir, la sonda negativa, un aumento en NA/N D no debería resultar en un aumento en la eficiencia FRET (al menos a concentraciones aceptoras suficientemente bajas cuando no se produce FRET aleatorio debido a la proximidad de los colorantes aceptores a los colorantes donantes).</li>
</ol>

<ol><li>Förster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+der+Physik%22%5BJournal%5D)">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li>
<li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence+digital+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li>
<li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li>
<li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+the+c-Fos%2Fc-Jun+complex+in+vivo%3A+A+combined+FRET%2C+FCCS%2C+and+MD-modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li>
<li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li>
<li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li>
<li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413(2013).</li>
<li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quality%2C+reproducibility%2C+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li>
<li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+measured+by+the+sensitized+emission+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194(2020).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).</li>
<li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li>
<li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li>
<li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li>
<li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li>
<li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li>
<li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li>
<li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+EGFP%2C+EYFP%2C+and+ECFP+with+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li>
<li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness%2C+protein+folding%2C+and+FRET+Forster+radius%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li>
<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li>
<li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270(2015).</li>
<li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li>
<li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes%3A+Simulations+and+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado detalla el uso de la sonda de calibración de proteínas fluorescentes uno a uno acoplada genéticamente para cuantificar FRET utilizando la detección de emisión sensibilizada del aceptor y enfriamiento de la molécula donante por microscopía confocal. Este método se puede aplicar para evaluar las interacciones de proteínas en el contexto fisiológico de la célula viva en diferentes compartimentos subcelulares. La resolución espacial se puede mejorar aún más aplicando el algoritmo presentado para calcu...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

El análisis basado en microscopía de la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) permite evaluar las interacciones entre proteínas en células vivas. Proporciona información espacial y temporal, incluida información sobre dónde en la célula y en qué compartimento subcelular tiene lugar la interacción y si esta interacción cambia con el tiempo.
Theodor Förster sentó las bases teóricas de FRET en 19481. FRET es una transferencia de energía sin radiación de un donante excitado a una molécula aceptora y depende de la distancia de las moléculas y la orientación relativa de sus dipolos de transición, así como de la superposición entre los espectros de emisión donante y absorción aceptora. La tasa de transferencia de energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia donante-aceptante. Por lo tanto, FRET se puede utilizar para medir la proximidad molecular en el rango de 1-10 nm.
FRET compite con otros procesos de desexcitación de la molécula donante y da como resultado la llamada emisión sensibilizada y de enfriamiento del donante. La extinción del donante es una reducción del número de fotones donantes emitidos, mientras que la emisión sensibilizada es un aumento de los fotones aceptores emitidos. Muchos análisis FRET microscópicos utilizan mediciones de intensidad de fluorescencia, incluido el fotoblanqueo aceptor 2, el fotoblanqueo del donante2 o el fotoblanqueo sensibilizado por FRET del aceptor3.
Aquí, se presenta un protocolo experimental paso a paso y un algoritmo matemático para cuantificar FRET utilizando la extinción del donante y la emisión sensibilizada por aceptor4,5, un método a menudo denominado FRET ratiométrico. Se han publicado muchos protocolos sobre cómo aproximar la emisión sensibilizada, pocos han cuantificado la eficiencia FRET absoluta 6,7,8,9. La cuantificación de las eficiencias FRET en la célula viva requiere determinar (i) la diafonía (derrame espectral o sangrado) de las proteínas fluorescentes y, también (ii) la eficiencia de detección de la configuración microscópica. Mientras que la diafonía se puede evaluar mediante imágenes de células que expresan solo uno de los fluoróforos, la evaluación de la eficiencia de detección relativa de la fluorescencia donante y aceptora es más complicada. Requiere el conocimiento de al menos la relación entre el número de moléculas donadoras y aceptoras que dan lugar a las señales medidas. El número de fluoróforos expresados en células vivas varía, sin embargo, de célula a célula y es desconocido. El llamado factor α caracteriza las intensidades relativas de la señal de una sola molécula donante y aceptora excitada. El conocimiento del factor es un requisito previo para las mediciones cuantitativas ratiométricas de FRET en muestras con proporciones variables de moléculas aceptoras a donantes, como las que se encuentran durante las imágenes de células vivas con proteínas fluorescentes. El uso de una proteína de fusión donante-aceptor 1 a 1 como sonda de calibración permite la determinación del factor α y también sirve como control positivo. Esta sonda genéticamente acoplada es expresada por células en cantidades totales desconocidas, pero en una cantidad relativa fija y conocida de uno a uno. El siguiente protocolo establece cómo construir la sonda 1 a 1 y cómo usarla para cuantificar la eficiencia de FRET. Una hoja de cálculo que incluye todas las fórmulas se puede encontrar en el suplemento y puede ser utilizada por los lectores para ingresar sus propias medidas en las columnas respectivas como se describe a continuación.
Si bien el protocolo utiliza el par donante/aceptor GFP-Cherry, el enfoque presentado se puede realizar con cualquier otro par FRET. El Archivo Suplementario 1 proporciona detalles sobre los pares cian-amarillo.

<table><tbody><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA sin rojo fenol (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Clontech mCherry N1 vector</td><td>Addgene</td><td>3553</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific 15630080</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámaras LabTek de 8 pocillos #1.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de las interacciones de proteínas en células vivas con emisión sensibilizada por fret

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) es la transferencia de energía sin radiación de un donante excitado a una molécula aceptora y depende de la distancia y orientación de las moléculas, así como del grado de superposición entre los espectros de emisión donante y absorción aceptora. FRET permite estudiar la interacción de proteínas en la célula viva a lo largo del tiempo y en diferentes compartimentos subcelulares. En la literatura se han descrito diferentes algoritmos basados en la intensidad para medir FRET utilizando microscopía. Aquí, se proporciona un protocolo y un algoritmo para cuantificar la eficiencia FRET basada en la medición tanto de la emisión sensibilizada del aceptor como del enfriamiento de la molécula donante. La cuantificación de FRET ratiométrico en la célula viva no solo requiere la determinación de la diafonía (derrame espectral o sangrado) de las proteínas fluorescentes, sino también la eficiencia de detección de la configuración microscópica. El protocolo proporcionado aquí detalla cómo evaluar estos parámetros críticos.

La Figura 1 muestra las imágenes obtenidas en el canal donante, canal 1 (488, 505-530 nm), el canal de transferencia, canal 2 (488, &gt;585 nm), y el canal aceptor, canal 3 (561, &gt;585 nm), respectivamente. Imágenes representativas de células que expresan GFP solamente, solo cereza, co-expresando GFP y cereza, y expresando la proteína de fusión GFP-Cherry. Las eficiencias celulares medias de FRET calculadas en células NRK que expresan proteína de fusión GFP...

La transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre dos moléculas fluoróforas se puede utilizar para estudiar las interacciones de proteínas en la célula viva. Aquí, se proporciona un protocolo sobre cómo medir FRET en células vivas mediante la detección de la emisión sensibilizada del aceptor y el enfriamiento de la molécula donante utilizando microscopía de barrido láser confocal.

Evaluación de las interacciones de proteínas en células vivas con emisión sensibilizada por FRET

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Este protocolo describe un proceso experimental paso a paso y un algoritmo matemático para cuantificar FRET utilizando la extinción del donante y la emisión sensibilizada por el aceptor. La cuantificación de las eficiencias FRET en la célula viva requiere determinar la diafonía de las proteínas fluorescentes y las eficiencias relativas de emisión y detección de los fluoróforos en la configuración microscópica. La diafonía se puede evaluar mediante imágenes de células que expresan solo un fluoróforo.La evaluación de la eficiencia de detección de una molécula donante o aceptora requiere un conocimiento de la relación entre el número de moléculas donantes y aceptoras que dan lugar a la señal de medida. El número de fluoróforos expresados en células vivas varía de célula a célula y es desconocido. La sonda de calibración utilizada en este método, una proteína de fusión donante-aceptor uno a uno, permite determinar la eficiencia de detección relativa de las moléculas donante y aceptora.Para comenzar, utilice un vector de expresión celular de mamíferos N1 con mCherry 1 para generar la sonda de fusión EGFP mCherry 1. Diseñar oligonucleótidos para amplificar EGFP sin un codón de parada como una célula de un fragmento BAM h1. El enlace de cinco aminoácidos entre la proteína fluorescente verde y roja debe producir una deficiencia media de FRET para el par donante-aceptor de cerezas GFP de 0.25 a 0.3.Use cualquier línea celular y medio sin rojo fenol para reducir la fluorescencia de fondo. Una vez que las células estén 80% confluentes, separarlas con un mililitro de 0.05% tripsina EDTA y sembrar aproximadamente 10, 000 células en cada pocillo de una placa de ocho pocillos agregando tres gotas de una suspensión de células de cinco mililitros. 24 horas después del recubrimiento, transfectar las células utilizando un medio de transfección apropiado.Incubar las células durante 20 horas antes de obtener imágenes de células vivas para permitir la expresión, el plegamiento y la maduración adecuados de las proteínas fluorescentes. Imagen de las células en una cámara ambiental humidificada y calentada a 37 grados centígrados con un microscopio de barrido confocal. Para amortiguar los medios celulares a pH fisiológico, agregue 20 HEPES milimolares para que el medio celular sea independiente del dióxido de carbono.Luego monte el portaobjetos en el microscopio. Utilice la línea de 488 nanómetros del láser de iones de argón para excitar el GFP y el láser de diodo de 561 nanómetros para excitar la cereza. Configure el láser de 488 nanómetros para la excitación en el canal uno a través de una banda de emisión de 505 a 530 nanómetros y en el canal dos con un filtro de paso largo de más de 585 nanómetros.Utilice el láser de 561 nanómetros para la excitación en el canal tres con un filtro de paso largo de más de 585 nanómetros. Excite los dos láseres secuencialmente y configure el modo de imagen para cambiar después de cada línea para que la excitación de la imagen de 512 por 512 píxeles se alterne después de cada línea. Configure una mini serie temporal de tres imágenes para detectar si se produce un fotoblanqueo significativo y reducir la potencia del láser si es necesario.Primero, las células de imagen que expresan la construcción de fusión de cerezas GFP. Establezca los parámetros que definen la intensidad láser integrada en el tiempo por píxel en una imagen confocal. Utilice un objetivo de aceite de 63X y un zoom ajustado a 3X para obtener imágenes de una celda en su totalidad con suficiente aumento y resolución.Apunte a un tamaño de píxel de 70 a 80 nanómetros. Establezca el tiempo de permanencia de píxeles de dos a cuatro microsegundos y la transmisión AOTF para el láser de 488 nanómetros y 561 nanómetros, de modo que las imágenes muestren una buena relación señal-ruido sin blanqueamiento y sin píxeles que indiquen saturación de intensidad de fluorescencia. Ajuste la potencia del láser de 488 y 561 de modo que los niveles de señal en el canal uno y el canal tres sean similares.Establezca la ganancia del multiplicador de fotos en 600 a 800. Imagen de 15 a 20 células que expresan la proteína de fusión de cereza GFP, células que expresan GFP, cereza, GFP y cereza, y células no transeccionadas. A continuación, las células de imagen co-expresan las proteínas de interés acopladas a GFP y cereza respectivamente.Para calcular FRET, mida la señal donante en el canal uno, el canal donante con excitación de 488 nanómetros y una banda de emisión de 505 a 530 nanómetros. Luego mida la señal aceptora en el canal tres, el canal aceptor con excitación de 561 nanómetros y emisión por encima de 585 nanómetros. Finalmente, mida la señal FRET en el canal dos, el canal de transferencia con excitación de 488 nanómetros y emisión por encima de 585 nanómetros.La señal en el canal dos es una suma de cuatro componentes diferentes: el derrame espectral de la señal donante apagada en el canal de detección de más de 585 con un factor de diafonía S1, la señal aceptora de la excitación directa por luz de 488 nanómetros con un factor de diafonía S2, la emisión sensibilizada del aceptor por FRET de la molécula donante excitada, y la señal de fondo. Las imágenes se obtuvieron en el canal donante, el canal de transferencia y el canal aceptor, se muestran células que expresan GFP solamente, solo cereza, coexpresión de GFP y cereza, y la proteína de fusión de cereza GFP. Las eficiencias celulares medias de FRET calculadas en células NRK que expresan proteína de fusión de cereza GFP y aquellas que coexpresan cereza GFP se representan gráficamente versus la relación de intensidad de la relación aceptor-donante o la relación molecular en cada célula.Aquí se muestran imágenes FRET normalizadas píxel por píxel de células que expresan la proteína de fusión de cereza GFP, coexpresando GFP y cereza como control negativo y expresando subunidades receptoras del receptor de Ashwell-Morell. RHL1 y 2 de la lectina hepática de rata se marcaron con GFP y cereza en el lado citoplasmático de la membrana plasmática. Las eficiencias medias celulares FRET de las células que expresan GFP RHL1 y cereza RHL2 y GFP RHL1 delta stock y cereza RHL2 se representan gráficamente frente a la relación molecular aceptor-donante.El enfoque FRET cuantitativo presentado permite lo siguiente. Detección de interacciones proteicas en el contexto fisiológico de la célula viva. Cambios en las interacciones de proteínas a lo largo del tiempo.Diferencias en las interacciones en compartimentos subcelulares hasta el nivel píxel por píxel de una imagen confocal. Y la dependencia de la señal FRET detectada de la relación aceptor-donante molecular expresada en una célula viva.

assessing-protein-interactions-live-cells-with-fret-sensitized

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe cómo la imagen de interacciones proteína-proteína mediante un ensayo basado en la proximidad FRET.

Imágenes de interacciones proteína-proteína In vivo</em

Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) microscopía es una poderosa técnica para monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas utilizando biosensores diversos como los periodistas. Aquí describimos cómo construir un epifluorescencia personalizado FRET sistema de imágenes a partir de componentes disponibles en el mercado y cómo usarlo para FRET experimentos.

FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares

El video describe la técnica de imagen FLIM-FRET para determinar la interacción proteína-proteína en bacterias vivas que expresan proteínas citoplasmáticas marcadas con proteínas fluorescentes, un eGFP donante y mCherry aceptor. La técnica combinada también permite la cuantificación de las proteínas que interactúan.

Imágenes FLIM-FRET para la caracterización de interacciones proteína-proteína en bacterias vivas

Las interacciones entre las proteínas son fundamentales para todos los procesos celulares. El uso de bioluminiscencia de transferencia de energía de resonancia, la interacción entre un par de proteínas se puede controlar en células vivas y en tiempo real. Además, los efectos de las mutaciones potencialmente patógenos pueden ser evaluados.

La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Este protocolo describe un enfoque basado en la espectroscopia de la fluorescencia fluctuación para investigar las interacciones entre las proteínas median las interacciones célula-célula, es decir, proteínas localizadas en las ensambladuras de la célula, directamente en las células vivas. Ofrecemos directrices detalladas sobre la calibración del instrumento, adquisición de datos y análisis, incluyendo las correcciones a las fuentes de posible artefacto.

Un análisis de espectroscopia de fluorescencia fluctuación de interacciones de proteínas en los contactos célula-célula

Aquí, presentamos un protocolo para el uso simultáneo de Förster Resonancia Sensores de tensión basado en la transferencia de energía para medir recuperación de carga y de la fluorescencia de la proteína después de photobleaching para medir la dinámica de la proteína que permite la medida de fuerza-sensible dinámica de proteínas dentro de células vivas.

Medición de la proteína sensible a la fuerza dinámica en células vivas usando una combinación de técnicas fluorescentes

Las interacciones proteína-proteína son críticas para los sistemas biológicos, y estudios de la cinética de Unión proporcionan penetraciones en la dinámica y función de complejos de la proteína. Se describe un método que cuantifica los parámetros cinéticos de una proteína compleja mediante la transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia y la técnica de flujo detenido.

Uso en transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia de Vitro para el estudio de la dinámica de los complejos de la proteína en una escala de tiempo de milisegundos

Presentamos un protocolo experimental y un flujo de trabajo de análisis de datos para realizar espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color de células vivas (FCCS) combinada con transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) para estudiar la dinámica de los receptores de membrana en células vivas utilizando técnicas modernas de etiquetado de fluorescencia.

Espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia de doble color para estudiar la interacción proteína-proteína y la dinámica de proteínas en células vivas

La transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) es una técnica de imagen para detectar interacciones de proteínas en células vivas. Aquí, se presenta un protocolo FRET para estudiar la asociación de enzimas modificadoras de histonas con factores de transcripción que las reclutan a los promotores objetivo para la regulación epigenética de la expresión génica en tejidos vegetales.

Investigación de las interacciones entre las enzimas modificadoras de histonas y los factores de transcripción in vivo mediante la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la dinámica espacio-temporal de la activación y fosforilación de Akt en células HepG2 vivas. Las imágenes de transferencia de energía por resonancia (FRET) de Förster son una poderosa herramienta que proporciona información valiosa sobre las vías de señalización de la insulina y la regulación metabólica en las células cancerosas.

Imágenes de transferencia de energía por resonancia de Förster de células vivas de la dinámica de activación de Akt regulada metabólicamente en células HepG2

Aprende a cuantificar FRET en células vivas mediante microscopía confocal y algoritmos matemáticos. Este método permite detectar interacciones proteicas en tiempo real y estudiar señalización celular con precisión.

Evaluación de las interacciones de proteínas en células vivas con emisión sensibilizada por FRET

Explorar más videos