Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Este protocolo utiliza dos ensayos semiautomatados diferentes para cuantificar rápidamente la actividad locomotora de C.elegans en medio líquido, y tiene el potencial de aplicarse para la detección de fármacos en modelos de enfermedad de C.elegans. Las principales ventajas de estas dos técnicas son su facilidad de uso y facilidad de reproducibilidad. Ambas técnicas tienen el potencial de evaluar los efectos de los medicamentos en el comportamiento de los gusanos con un rendimiento variable.

Estos ensayos de motilidad son útiles para evaluar la actividad locomotora de los modelos de enfermedad mitocondrial de C.elegans en los que el sistema neuromuscular de los animales está deteriorado. Para analizar la actividad locomotora de C.elegans en medio líquido en portaobjetos de vidrio después de sincronizar el control en cepas de gusanos mutantes en placas NGM con y sin tratamientos farmacológicos de interés para la etapa L4, use un pico de gusano y un estereomicroscopio para recoger cinco gusanos por cepa y condición en gotas individuales de 20 microlitros de solución S.basal en un portaobjetos de vidrio. Agregue gusanos de la misma condición experimental de diferentes placas NGM a múltiples gotas en la misma diapositiva para obtener múltiples réplicas técnicas.

Cuando se hayan recolectado todos los gusanos, permita que los animales se aclimaten en el tobogán durante un minuto a temperatura ambiente antes de registrar la actividad de natación de los gusanos en cada gota durante un minuto a 15 cuadros por segundo por gota. Para analizar la actividad locomotora de C.elegans grabada utilizando el software ZebraLab, utilice la opción ZEBRALAB AVI para subir vídeos al software. Haga clic en la opción Cuantización con archivos AVI.

Para crear un nuevo protocolo, seleccione Parámetros, Parámetros de protocolo y Hora, y establezca la duración del experimento en un minuto. Seleccione Sin papelera de tiempo y anule la selección de Período de integración de acuerdo con la salida de datos deseada y seleccione Archivo y Abrir una película para cargar cada archivo de video grabado previamente. Para construir una sola área de detección, use la herramienta de círculo para crear un área alrededor de toda la gota líquida en la que se encuentran los gusanos.

Se detectará la actividad de todos los gusanos dentro del área seleccionada. Para indicar la distancia a calibrar, dibuje una línea horizontal de izquierda a derecha del área de vídeo y seleccione Calibrar, Dibujar y Aplicar al grupo. Para permitir la detección de todas las diferentes cepas de gusanos C.elegans que se analizarán, anule la selección del icono Área y ajuste la Sensibilidad de detección en el Umbral de actividad.

Para visualizar las pistas realizadas por los animales mientras se realiza el análisis de la actividad, establezca la escala de visualización en 70 y seleccione Aplicar al grupo. Para analizar los vídeos, haga clic en Reproducir, seleccione Experimentar y Ejecutar para introducir un nombre de archivo para el vídeo. Después de guardar, aparecerá una ventana preguntando si analizar el video a la velocidad máxima de la computadora.

Haga clic en Sí. Se abrirá la ventana del experimento en ejecución. Haga clic en Inicio.

Cuando se complete el análisis de grabación, haga clic en Experimentar y detener para guardar la actividad analizada en la gota de una hoja de cálculo. Para analizar la actividad locomotora de C.elegans en medio líquido en un formato de placa de 96 pomos, cuando los gusanos alcanzaron la etapa L4, agregue 50 microlitros de 2% de peso por volumen de E.coli OP50 y medio S. basal a cada polo de una microplaca de fondo plano transparente de 96 pomos. Use el estereomicroscopio para elegir manualmente 15 gusanos sincronizados por pozo de la placa de 96 pozos y permita que los gusanos se aclimaten durante 20 minutos.

Al final del período de aclimatación, use un escáner plano estándar para escanear cada microplaca dos veces con menos de 10 segundos entre escaneos Para analizar los escaneos, use un software de código abierto para alinear los dos escaneos secuenciales y adquiera los datos de cambio de píxeles entre las dos imágenes y la puntuación relativa del escaneo de gusanos para determinar los cambios en la respuesta locomotora en función de la intensidad de la luz producida por el escáner cuando se establece en un píxel. umbral de cinco. En este análisis de la actividad locomotora de C.elegans en una sola gota de medio líquido, los gusanos de la enfermedad del complejo I mitocondrial demostraron una disminución significativa del 38% en su actividad locomotora en la etapa L4 en comparación con los gusanos de tipo salvaje. Del mismo modo, el análisis de escaneo de gusanos de las mismas poblaciones mostró una reducción significativa en la actividad locomotora para los gusanos modelo de enfermedad en etapa L4 en comparación con los gusanos de tipo salvaje N2 Bristol.

Esta pérdida de actividad locomotora también se observó en gusanos adultos de la enfermedad del complejo I mitocondrial en etapa uno según lo evaluado por el análisis de exploración de gusanos. Es esencial recordar usar el número correcto de gusanos al configurar cada ensayo. Después de este procedimiento, nuestro laboratorio realiza con frecuencia una detección de drogas.

Estas dos técnicas se utilizan en nuestro laboratorio para evaluar los efectos de fármacos de interés sobre la actividad de los gusanos en modelos animales preclínicos de enfermedad mitocondrial.