Entrega del complejo de ribonucleoproteína Cas9/sgRNA en células inmortalizadas y primarias a través de partículas similares a virus ("nanocuchillas")

Las nanocuchillas permitieron la administración rápida, eficiente y dependiente de la dosis del complejo de ARN Cas9 y guía, tanto en células inmortalizadas como primarias, y en ausencia de antitransgén. La principal ventaja de este método es que las nanocuchillas son fáciles y relativamente baratas de preparar. Pueden administrar el Cas9 y guiar el complejo de ARN de una manera transitoria y dependiente de la dosis, limitando así los efectos fuera del objetivo, al tiempo que permiten una edición eficiente del genoma.

El protocolo de preparación para nanoblades es muy simple. Sin embargo, la calidad de las células productoras, así como su origen y su siembra antes de la transfección, son esenciales para obtener altos rendimientos de partículas similares a virus. Demostrando el procedimiento estará Laura Guiguettaz, ingeniera de mi laboratorio.

En el primer día, sembra de 3.5 a 4 millones de células HEK 293T en 10 mililitros de DMEM modificado y estreptomicina de penicilina en un plato de cultivo celular de 10 centímetros. Después de 24 horas, cuando las células alcancen el 70% de confluencia, reemplace el medio con DMEM fresco y use una pipeta P-1000 para agregar una solución de reactivo de transfección de manera aleatoria. Comience a cosechar nanocuchillas en el cuarto día recolectando el sobrenadante del medio de cultivo con una pipeta de 10 mililitros.

Es normal que el color del medio de cultivo se vuelva amarillo en esta etapa. Centrifugar el sobrenadante recolectado a 500 G durante cinco minutos para eliminar los desechos celulares y recuperar nueve mililitros del sobrenadante sin perturbar el pellet celular. Peletizar las nanocuchillas en una ultracentrífuga a 209, 490 G durante 75 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de la centrifugación, aspire lentamente el medio y vuelva a suspender el pellet blanco con 100 microlitros de PBS frío. Cubra el tubo con parafilm e incube durante una hora a cuatro grados centígrados con una agitación suave. Luego, vuelva a suspender el pellet nuevamente canalizando hacia arriba y hacia abajo.

Prepare una solución de sacarosa al 10% en PBS y filtre a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros. Coloque 2,5 mililitros de sacarosa al 10% en un tubo de ultracentrífuga. Incline el tubo y agregue lentamente los nueve mililitros de muestra que contiene VLP con una pipeta de baja velocidad mientras eleva progresivamente el tubo a una posición vertical.

Coloque los tubos en los cucharones del rotor, luego centrífuga las muestras a 209, 490 G durante 90 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante con cuidado y coloque el tubo boca abajo sobre papel de seda para eliminar cualquier líquido restante. Para fines didácticos y una mejor visualización del pellet viral, se pueden preparar nanoblades cargadas con la proteína fluorescente mCherry.

Después de un minuto, agregue 100 microlitros de PBS. Coloque el tubo con una cubierta de parafilm en un soporte de tubo en una mesa de agitación durante una hora a cuatro grados centígrados, y vuelva a suspender el pellet mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Prepare el tampón de dilución agregando un volumen de tampón de lisis que contenga un surfactante no iónico en cuatro volúmenes de PBS.

Diluya dos microlitros de nanocuchillas concentradas en 50 microlitros de tampón de dilución y vórtice brevemente. Transfiera 25 microlitros de la mezcla a un nuevo tubo que contenga 25 microlitros de tampón de dilución y repita el procedimiento para tener seis tubos de diluciones de nanoblade. Haga el control estándar agregando dos microlitros de nucleasa Cas9 recombinante en 50 microlitros de tampón de dilución, vórtice brevemente y haga ocho diluciones en serie.

Coloque 2,5 microlitros de cada dilución VLP y 2,5 microlitros de cada estándar en una membrana de nitrocelulosa cuidadosamente con una pipeta multicanal. Una vez que las partículas se absorben, bloquee la membrana con TBST suplementado con leche en polvo sin grasa al 5% durante 45 minutos a temperatura ambiente. Deseche el TBST e incube la membrana durante la noche a cuatro grados centígrados con el anticuerpo peroxidasa de rábano picante Cas9.

Lave la membrana tres veces con TBST y visualice la señal utilizando un kit de sustrato quimioluminiscente mejorado. Para la transducción de células diana con nanocuchillas, reemplace el medio de cultivo celular con 500 microlitros del medio que contienen nanocuchillas purificadas. Después de cuatro a seis horas de incubación celular, reemplace el medio a la cantidad normal de medio fresco.

En el protocolo, las células se sembraron para una distribución homogénea con una confluencia del 70 al 80% el día de la transfección, formando sincitios que conducen a células más grandes con múltiples núcleos después de 24 horas. 40 horas después de la transfección, la mayoría de las células formaron sincitia y comenzaron a desprenderse de la placa. La cantidad de Cas9 cargada dentro de las nanocuchillas se cuantificó utilizando una mancha de puntos en una membrana de nitrocelulosa, que mostró una quimioluminiscencia mejorada en comparación con la referencia recombinante Cas9.

Se trazó una curva de calibración para la señal de quimioluminiscencia cuantificada para diluciones recombinantes de Cas9 contra la cantidad conocida de Cas9. Luego, se mapeó la concentración de proteína Cas9 en cada preparación de nanoblade, revelando diferentes concentraciones de Cas9 de un lote a otro. El ensayo de endonucleasa T7 demostró que la eficiencia de las nanoblades puede diferir de un lote a otro.

Por ejemplo, se observó que un lote tenía una eficiencia de edición general del 20%, mientras que el otro lote mostraba una eficiencia del 60%. Las proteínas Flag-DDX3 fueron inmunoprecipitadas utilizando perlas de agarosa anti-bandera, seguidas de un análisis de Western blot de las proteínas recuperadas utilizando un anticuerpo anti-bandera. La inserción dirigida al sitio de la etiqueta de bandera en el locus DDX3 también se ensayó mediante PCR utilizando cebadores que flanquean el sitio de inserción o cebadores hacia adelante y hacia atrás específicos del locus DDX3 aguas abajo del sitio de inserción de la bandera.

Es importante colocar las células en una confluencia correcta, y obtener una distribución uniforme de las células. Tras la centrifugación de nanocuchillas, también es importante resuspendir el pellet y obtener una muestra homogénea de partículas virales concentradas. Las nanocuchillas han permitido a los científicos estudiar el mecanismo de reparación de rotura de ADN de doble cadena mediante la entrega del Cas9 y guiar el complejo de ARN a loci genómicos específicos de una manera rápida y coordinada.

También han permitido inactivar arneses largos no codificantes en células primarias del sistema inmune innato para estudiar su papel.