Name: Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Aprende a generar metástasis cerebrales en modelos murinos mediante inyección en la vena de la cola usando líneas celulares de cáncer de mama inflamatorio. Este método reproduce fielmente los pasos de colonización metastásica cerebral.

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Agradecemos a Christine F. Wogan, MS, ELS, de la División de Oncología Radioterápica del MD Anderson por la edición científica del manuscrito, y a Carol M. Johnston, del Núcleo de Histología de la División de Cirugía del MD Anderson, por su ayuda con la tinción de hematoxilina y eosina. Agradecemos al Núcleo de Medicina y Cirugía Veterinaria del MD Anderson por su apoyo a los estudios con animales. Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: Beca de Investigación Susan G. Komen Career Catalyst (CCR16377813 a BGD), Beca de Investigación de la Sociedad Americana Contra El Cáncer (RSG-19-126-01 a BGD) y el Programa de Investigación de Cáncer de Mama Raro y Agresivo del Estado de Texas. También cuenta con el apoyo parcial de la Subvención P30 de Apoyo al Centro Oncológico (Core) CA016672 del Instituto Nacional del Cáncer, de los Institutos Nacionales de la Salud, al Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas.

El método descrito aquí ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) del MD Anderson Cancer Center y cumple con las Pautas de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El flujo de trabajo esquemático, con todos los pasos incluidos, se presenta como Figura 1.
1. Preparación celular
NOTA: La línea celular MDA-IBC3 (ER-/PR-/HER2+), generada en el laboratorio24 del Dr. Woodward, se transdució de forma estable con un plásmido de proteína fluorescente verde luciferasa (Luc-GFP).
<ol><li>El cultivo transdució células en medios F-12 de Ham suplementados con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 1 μg/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de insulina y 1% antibiótico-antimitótico.</li>
	<li>Plaquetar celdas MDA-IBC3-Luc-GFP a 37 °C y 5% de CO2 en un matraz T-75 hasta que confluyan. Cambie el medio cada 3 días antes de que las células sean lo suficientemente confluentes como para pasar.</li>
	<li>Recoja las células retirando los medios, lavando cada matraz con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) 1x de Dulbecco (es decir, sin calcio ni magnesio) y agregando 2 ml de ácido tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,25 %. Incubar durante 3-5 min a 37 °C hasta que las células se desprendan.</li>
	<li>Agregue 5 ml de medio completo al matraz para recolectar las células y transferir todo el contenido a un tubo de centrífuga de 15 ml (optimizado para un tubo de centrífuga de 50 ml dependiendo del número total de células necesarias). Centrifugar a 290 x g durante 5 min a las células de pellets. NOTA: El medio completo es el medio F-12 de Ham suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1 μg/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de insulina y 1% de antibiótico-antimitótico.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante. A continuación, lave las células con 10 ml de 1x DPBS. Centrifugar a 290 x g durante 5 min para granular las células y desechar el sobrenadante con cuidado. Vuelva a suspender las células con 1 ml de DPBS 1x fresco y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Para hacer suspensiones unicelulares, filtre las células a través de filtros celulares estériles de 40 μm.</li>
	<li>Calcule la densidad de celdas mediante un contador de celdas automatizado. NOTA: Para reducir los errores en el recuento, cree diferentes diluciones de células y cuéntelas por separado, y calcule el valor medio para determinar la concentración de células (número de células/mL).<ol><li>Recoja 2 μL de suspensión celular + 8 μL de 1x DPBS para hacer una muestra de dilución 1:5.</li>
		<li>Recoja 1 μL de suspensión celular + 9 μL de 1x DPBS para hacer una muestra de dilución 1:10.</li>
		<li>Añadir 10 μL de tinte azul de tripano al 0,4%. Mezcle bien la mezcla de muestra pipeteándola hacia arriba y hacia abajo varias veces.</li>
		<li>Pipetear suavemente 10 μL de la muestra en el área de carga de muestras en forma de media luna de los portaobjetos de la cámara de recuento. Asegúrese de que no haya burbujas en el interior; Espere 30 s para permitir que las celdas se asienten en la cámara antes de contar.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluir las células con 1x DPBS hasta una densidad de 5 x 105 o 1 x 106 células por 100 μL. Transfiera la suspensión celular a tubos de microcentrífuga de 1,7 ml para la inyección en la vena de cola. Coloque las células en hielo hasta la inyección para mantener la viabilidad.</li>
</ol>2. Inyección en la vena de la cola
<ol><li>Use ratones hembra SCID/Beige atímicos de 4 a 6 semanas de edad.</li>
	<li>Prepare una jeringa de 30 G para extraer 100 μL de suspensión celular. Retire todas las burbujas de aire.</li>
	<li>Coloque el ratón en un bloqueador de roedores (diámetro de aproximadamente 1 pulgada) para facilitar la inyección de la vena de la cola y evitar lesiones por el movimiento durante el proceso de inyección.</li>
	<li>Use almohadillas de algodón con alcohol (hechas con etanol al 70%) para limpiar suavemente la cola del ratón 3-4 veces y manténgala presionada durante 5-10 segundos para que la vena de la cola sea más claramente visible.</li>
	<li>Inserte la jeringa en la cola del ratón en un ángulo de 15-30°. Empuje lentamente la suspensión celular hacia la vena de la cola.</li>
	<li>Retire la jeringa con cuidado y use la almohadilla de algodón para sostener la cola durante unos segundos para ayudar a detener el sangrado.</li>
	<li>Regrese a los ratones a sus jaulas y revíselos 2-4 h después de la inyección para asegurarse de que no se produzcan efectos adversos.</li>
</ol>3. Evaluación de la carga de metástasis cerebral
<ol><li>Prepare una solución diluida de D-luciferina. NOTA: La concentración de material es de 47,6 mM (15,15 mg/mL) y la concentración para su uso es de 1,515 mg/mL.<ol><li>Agregue 5 ml de 1x DPBS al frasco de D-luciferina.</li>
		<li>Coloque 2,5 ml de la solución en cada uno de los dos tubos cónicos de 50 ml.</li>
		<li>Agregue otros 5 ml de 1x DPBS al frasco de D-luciferina nuevamente para enjuagarlo. Coloque 2,5 ml en cada tubo cónico de 50 ml.</li>
		<li>Coloque otros 5 ml de 1x DPBS en la botella y enjuáguela nuevamente. Repita el proceso de enjuague dos veces.</li>
		<li>Agregue 1x DPBS a cada tubo de 50 ml hasta un total de 66 ml (aproximadamente 33 ml por tubo). Debe haber aproximadamente 33 ml de la solución en cada tubo.</li>
		<li>Mezcle bien los tubos y luego combine ambos en una unidad de filtración estéril (filtro PES de 150 ml, 0,45 μm).</li>
		<li>Filtre la solución y luego alícula la solución filtrada en microtubos estériles de color ámbar de 1,7 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Detección de metástasis cerebrales mediante imágenes de luciferasa.<ol><li>Descongele la D-luciferina manteniéndola en hielo y vórtice antes de inyectarla en los ratones.</li>
		<li>Limpie el área de la inyección con almohadillas de algodón con alcohol e inyecte 100 μl de D-luciferina por ratón por vía intraperitoneal utilizando una jeringa de insulina de 0,5 ml, una jeringa por cada jaula.</li>
		<li>Después de 10 minutos, anestesiar a los ratones con isoflurano (2% O2-2,5% de isoflurano) durante 5 minutos utilizando el vaporizador veterinario conectado a la cámara de inducción de pequeños animales.</li>
		<li>Encienda el sistema de imágenes in vivo. Mientras los ratones de la primera jaula están bajo anestesia, inyecte la D-luciferina en los ratones de la siguiente jaula.</li>
		<li>Coloque ratones en la máquina del sistema de imágenes in vivo y obtenga imágenes ventrales y dorsales. Seleccione un tiempo de exposición de 2 minutos y, en la vista de campo, elija la opción E (cuerpo entero). Presione Adquirir. A continuación, guarde la imagen (Figura 2). NOTA: Si la imagen muestra saturación de luminiscencia, reduzca el tiempo de exposición.</li>
	</ol></li>
	<li>Detección de metástasis cerebrales mediante imágenes de GFP.<ol><li>Preparación del tejido cerebral.<ol><li>Alrededor de 8-10 semanas después de la inyección de células o cuando los ratones estén moribundos debido a la carga de metástasis cerebral, eutanasiar a los ratones por inhalación de una sobredosis de isoflurano seguida de una luxación cervical, de acuerdo con los protocolos aprobados por la IACUC.</li>
			<li>Después de la eutanasia con isoflurano seguida de una luxación cervical, rocíe a los ratones con una solución de etanol al 70% y retire el pelo del área de la cabeza y las orejas con unas tijeras. A continuación, haz un corte en la zona cervical del cuello (teniendo cuidado de no decapitar al ratón). Corta el cráneo y sácalo. A continuación, extirpe con cuidado el cerebro.</li>
			<li>Coloque los cerebros recolectados en casetes de pañuelos.</li>
			<li>Transfiera los casetes a un recipiente con 1x DPBS frío. NOTA: Las muestras de cerebro no deben conservarse en 1x DPBS durante más de 1 h. Si se van a recolectar varias muestras de cerebro al mismo tiempo, eutanasiar solo a unos pocos ratones a la vez (10 por ronda).</li>
		</ol></li>
		<li>Imágenes estereomicroscópicas.<ol><li>Transfiera todo el cerebro a una tapa de plato de papel de 100 cm.</li>
			<li>Encienda el microscopio estereoscópico y la luz ultravioleta, en la posición 3 con lente 0.5x, para permitir la visualización de todo el cerebro como se muestra en la Figura 3A (cuadrado rojo).</li>
			<li>Presione Live view (Figura 3A, cuadrado verde).</li>
			<li>Enfoca la vista mientras el cerebro está en posición ventral.</li>
			<li>Seleccione GFP (si las células están marcadas con GFP ) o TXRED (si las células están marcadas con RFP) (Figura 3A, cuadrado amarillo) en el software, seleccione el filtro adecuado en el microscopio y tome una fotografía. NOTA: Mantenga la configuración de la fuente de luz SOLA en aproximadamente el 30%; si el GFP es demasiado brillante, reduzca hasta que se observe la señal adecuada.</li>
			<li>Sin mover la muestra, encienda la luz brillante y seleccione BF (Figura 3A, cuadrado amarillo). Toma una foto.</li>
			<li>Repite los pasos anteriores con el cerebro en posición dorsal. NOTA: Dependiendo del tamaño, la misma lesión de metástasis cerebral GFP positiva puede aparecer tanto en posición ventral como dorsal. En tal caso, evite la cuantificación duplicada de la misma lesión. Guarde las imágenes con una extensión TIFF (que mantiene toda la información en el archivo de imagen).</li>
			<li>Guarde las imágenes con una extensión TIFF (que mantiene toda la información en el archivo de imagen).</li>
			<li>Repita los pasos para todas las muestras.</li>
			<li>Convierta las imágenes TIFF a JPEG para que los archivos se puedan abrir con cualquier ordenador que no tenga instalado el software asociado (Archivo | Importación/Exportación | convertir archivos).</li>
			<li>Para fusionar la imagen fluorescente con la imagen de campo claro, abra ambas imágenes y vaya a Archivo | Fusionar canales. Seleccione los componentes adecuados, verde para GFP y campo claro para BF, y presione Aceptar. Guarde la imagen combinada.</li>
			<li>Para cuantificar el área del tumor cerebral, use la imagen fluorescente. Seleccionar medida | Medición manual | Área. Seleccione la selección automática (Figura 3B, cuadrado verde) y mueva la flecha al área GFP-positiva y haga clic para crear automáticamente una selección. Haga clic de nuevo para confirmar la selección y luego se mostrarán todas las mediciones (Figura 3B, cuadrado rojo). Si hay más de un área positiva para GFP, repita el procedimiento.</li>
		</ol></li>
		<li>Después de obtener las imágenes cerebrales, proceda a los protocolos de fijación de tejidos de rutina utilizando formalina tamponada neutra al 10%.<ol><li>Una vez fijados los cerebros, se procede a la sección histológica estándar seguida de la tinción de hematoxilina y eosina para confirmar la presencia de metástasis cerebrales y la tinción inmunohistoquímica para detectar marcadores seleccionados. NOTA: La inmunocitoquímica se realizó en el Laboratorio Central de Patología del Centro Oncológico MD Anderson de la Universidad de Texas que cuenta con un protocolo estandarizado para la tinción inmunohistoquímica de marcadores conocidos.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El protocolo incluye varios pasos críticos. Las células deben mantenerse en hielo durante no más de 1 hora para mantener la viabilidad. Se deben usar almohadillas de algodón con alcohol para limpiar las colas de los ratones antes de la inyección, teniendo cuidado de no limpiar con demasiada fuerza o con demasiada frecuencia para evitar dañar la piel de la cola. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la suspensión celular, para evitar que los ratones mueran por émbolos en los vasos sanguíneos. Mantenga el ángulo de ...

La metástasis cerebral es una complicación común y mortal de las neoplasias malignas sistémicas. La mayoría de las metástasis cerebrales se originan en tumores primarios de pulmón, mama o piel, que en conjunto representan el 67-80% de los casos 1,2. Las estimaciones de la incidencia de metástasis cerebrales varían entre 100.000 y 240.000 casos, y estas cifras pueden estar subestimadas porque la autopsia es poco frecuente en pacientes que murieron de cáncer metastásico3. Los pacientes con metástasis cerebrales tienen un peor pronóstico y una menor supervivencia global en relación con los pacientes sin metástasis cerebrales4. Las opciones de tratamiento actuales para las metástasis cerebrales son en gran medida paliativas y no mejoran los resultados de supervivencia de la mayoría de los pacientes5. Por lo tanto, la metástasis cerebral sigue siendo un desafío, y la necesidad sigue siendo apremiante de comprender mejor los mecanismos de progresión de la metástasis cerebral para desarrollar terapias más efectivas.
El uso de modelos experimentales ha proporcionado información importante sobre los mecanismos específicos de la progresión metastásica del cáncer de mama al cerebro y ha permitido evaluar la eficacia de diversos enfoques terapéuticos 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Sin embargo, muy pocos modelos pueden recapitular de manera precisa y completa las complejidades del desarrollo de metástasis cerebrales. Se han generado varios modelos experimentales in vivo mediante la inoculación de células cancerosas en ratones mediante diferentes vías de administración, incluidas las inyecciones ortotópicas, de vena de cola, intracardíacas, intracarotídeas, arteriales intracarótidas e intracerebrales. Cada técnica tiene ventajas y desventajas, como se revisó en otro lugar3. Sin embargo, ninguno de estos modelos de ratón puede replicar completamente la progresión clínica de la metástasis cerebral.
Las metástasis cerebrales son particularmente comunes en pacientes con cáncer de mama inflamatorio (IBC, por sus siglas en inglés), una variante rara pero agresiva del cáncer de mama primario. El IBC representa entre el 1% y el 4% de los casos de cáncer de mama, pero es responsable de un desproporcionado 10% de las muertes relacionadas con el cáncer de mama en los Estados Unidos17,18. Se sabe que el IBC hace metástasis rápidamente; de hecho, un tercio de los pacientes con IBC tienen metástasis a distancia en el momento del diagnóstico19,20. Específicamente para la metástasis cerebral, los pacientes con IBC tienen una mayor incidencia de metástasis cerebral que los pacientes con IBCno 21. Recientemente, demostramos que la línea celular MDA-IBC3, derivada del líquido de derrame pleural maligno de un paciente con IBC ER-/PR-/HER2+ que recapitula las características de IBC en xenoinjertos de ratón, tiene una mayor propensión a desarrollar metástasis cerebrales en lugar de metástasis pulmonares en ratones cuando se inyecta por vena de cola, lo que convierte a esta línea celular en un buen modelo para estudiar el desarrollo de metástasis cerebrales16.
En este trabajo describimos los procedimientos para generar metástasis cerebrales mediante inyección en la vena de cola de células MDA-IBC3 y para evaluar la carga metastásica mediante microscopía estereofluorescente e imágenes de luciferasa. Este método se ha utilizado para descubrir mediadores clave de la metástasis del cáncer de mama en el cerebro y para probar la eficacia de las intervenciones terapéuticas 16,22,23. La desventaja de esta técnica es que no recapitula todos los pasos del proceso metastásico cerebral. Sin embargo, sus principales ventajas incluyen la robustez y reproducibilidad, la implicación de la biología de metástasis relevante de la intravasación, el atravesamiento de los pulmones y la extravasación en el cerebro, y su relativa simplicidad en términos de técnica.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L punta de pipeta filtrada</td><td>Genesee Scientific</td><td>23430</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipetas serológicas</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-112</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 15240062</td><td></td><td>1%</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 15 mL a granel</td><td>Genesee Scientific</td><td>28103&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 500 mL Hams F-12 Medio [+] L-glutamina</td><td>GIBICO Inc. Estados Unidos</td><td>MT10080CV</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Contador de células automatizado (Invitrogen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf centufuge 5810R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>GIBICO Inc. EE. UU.</td><td>16000044</td><td>10%</td></tr><tr><td>Fisherbrand &nbsp; Filtros de células estériles (40 &mu; m)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-547</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>1 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>de insulina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 12585014</td><td></td><td>5 y micro; g/mL</td></tr><tr><td>de Invitrogen&nbsp; Correderas de cámara de recuento de células Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Líneas celulares MDA-IBC3</td><td>MD Anderson Cancer Center</td><td></td><td>Generadas por el laboratorio del Dr. Woodward24</td></tr><tr><td>Luciferase&ndash; proteína fluorescente verde (Luc&ndash; GFP) sistema de plásmidos</td><td>Biosciences</td><td>BLIV713PA-1</td><td></td></tr><tr><td>microtubos transparentes estériles 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific</td><td>24282S</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 10 y micro; L Punta de barrera de alcance, de baja unión, con estantes, estéril</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-401C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matraces tratados TC (T75), 250 ml, Vent</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-209</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4 %) para usar con el contador de células automatizado Countess</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25 %), rojo fenol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>inyección de venas de cola</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige</td><td>Envigo</td><td>SCID/beige ratones</td><td></td></tr><tr><td>BD Jeringa de insulina con la aguja ultrafina BD 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm)</td><td>BD</td><td>328466</td><td></td></tr><tr><td>Plas Labs &nbsp; Restricdores de roedores estilo Broome</td><td>Plas Labs 551BSRR</td><td>01-288-32A</td><td>Pedido deThermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Volu SolSocio de diversidad de proveedores Etanol 95% SDA (190 Proof)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50420872</td><td>70 % usado</td></tr><tr><td>Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Lo-Dosis&nbsp; Jeringas de insulina U-100</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro PES desechables 0.45 y micro; m</td> Sistema <td>de filtro FB12566501</td><td>Fisherbrand</td><td>para esterilizar la D-luciferina</td></tr><tr><td>D-Luciferina</td><td>Biosynth</td><td>L8220-1g concentración de</td><td>stock = 47,6 mM (15,15 mg/mL); concentración de uso = 1,515 mg/mL</td></tr><tr><td>Microtubo de 1,7 mL ámbar</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-282AM</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Patterson Veterinario NDC-14043-704-06</td><td></td><td>Anestésico líquido para uso en vaporizador anestésico</td></tr><tr><td>IVIS 200&nbsp;</td><td>Máquina PerkinElmer</td><td></td><td>para la obtención de imágenes de luciferasa, hasta 5 ratones al mismo tiempo, con máquina de anestesia</td></tr><tr><td>Recipientes de plástico con tapas&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>02-544-127</td><td></td></tr><tr><td>Casetes de pañuelos</td><td>Thermo Scientific</td><td>1000957</td><td></td></tr><tr><td>Webcol Preparación de alcohol&nbsp;</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Imágenes de microscopio estereoscópico</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico AZ100&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>modelo AZ-STGE</td><td>software NIS-ELEMENT</td></tr><tr><td>Formalina 10%</td><td>Fisher Chemical</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>TC platos tratados 100x20 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>25202</td><td></td></tr></tbody></table>

modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

La diseminación metastásica al cerebro es una manifestación común y devastadora de muchos tipos de cáncer. Solo en los Estados Unidos, alrededor de 200,000 pacientes son diagnosticados con metástasis cerebrales cada año. Se han logrado avances significativos en la mejora de los resultados de supervivencia de las pacientes con cáncer de mama primario y neoplasias malignas sistémicas; Sin embargo, el sombrío pronóstico de los pacientes con metástasis cerebrales clínicas pone de manifiesto la necesidad urgente de desarrollar nuevos agentes terapéuticos y estrategias contra esta enfermedad mortal. La falta de modelos experimentales adecuados ha sido uno de los principales obstáculos que han impedido avanzar en nuestra comprensión de la biología y el tratamiento de las metástasis cerebrales. En este trabajo describimos un modelo de xenoinjerto de metástasis cerebral generada mediante inyección en la vena de cola de una línea celular amplificada endógenamente por HER2 derivada del cáncer de mama inflamatorio (IBC), una forma rara y agresiva de cáncer de mama. Las células se marcaron con luciferasa de luciérnaga y proteína de fluorescencia verde para monitorear la metástasis cerebral, y se cuantificó la carga metastásica mediante imágenes de bioluminiscencia, microscopía estereoscópica fluorescente y evaluación histológica. Los ratones desarrollan metástasis cerebrales de forma robusta y consistente, lo que permite la investigación de mediadores clave en el proceso metastásico y el desarrollo de pruebas preclínicas de nuevas estrategias de tratamiento.

Con el argumento de que las células marcadas facilitan la monitorización y visualización de las metástasis cerebrales en modelos preclínicos de ratón, marcamos las células MDA-IBC3 con Luc y con GFP para monitorizar las metástasis cerebrales y cuantificar la carga metastásica mediante el uso de imágenes de bioluminiscencia y estereomicroscopía fluorescente. La inyección de las células MDA-IBC3 marcadas en las venas de la cola de ratones inmunocomprometidos SCID/Beige dio lugar a altos porcentajes de ratones que desarroll...

Describimos un modelo de xenoinjerto de ratón de metástasis cerebral de cáncer de mama generado mediante inyección en la vena de cola de una línea celular de cáncer de mama inflamatorio amplificada endógenamente por HER2.

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Utilizamos el método de la vena de cola para generar metástasis cerebrales en modelos de ratón utilizando líneas celulares derivadas de pacientes con cáncer de mama inflamatorio, o IBC, una forma altamente agresiva de cáncer de mama primario. La generación de metástasis cerebrales en modelos de ratón suele implicar inyecciones intracardíacas o intracarotídeas. Sin embargo, el método de la vena de cola ofrece una ventaja sobre estas técnicas, ya que imita mejor los pasos de la colonización de la metástasis cerebral y es relativamente sencillo de realizar.Los doctores Xiaoding Hu y Emilly Villodre, ambos instructores en mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento. Para detectar metástasis cerebrales mediante imágenes GFP de ocho a 10 semanas después de la inyección de células tumorales, desinfecte el ratón con etanol al 70% y retire el pelaje de la cabeza y las orejas. Corta la zona cervical del cuello.Extirpar y extraer el cráneo para permitir que se extraiga el cerebro. Coloque el cerebro en un casete de papel desechable y coloque el casete en un recipiente de DPBS frío durante no más de una hora. Para obtener imágenes por microscopía estereoscópica, transfiera el cerebro a una tapa de plato de tejido de 100 centímetros bajo un microscopio estereoscópico equipado con luz ultravioleta y seleccione el objetivo de 0,5x para permitir la visualización de todo el cerebro.Presione la vista en vivo y enfoque la vista mientras el cerebro está en posición ventral. Seleccione el filtro apropiado en el software y el microscopio para el marcador fluorescente en las células y tome una fotografía. Sin mover la muestra, cambie a imágenes de campo claro y seleccione el filtro de campo claro.Toma una foto. A continuación, imagine el cerebro en posición dorsal como se demostró anteriormente. Para analizar las imágenes de todo el cerebro, primero convierta los archivos de imagen de TIFF a JPEG para que puedan abrirse con cualquier computadora que no tenga el software asociado.A continuación, abra un par de imágenes fluorescentes y de campo claro y seleccione los canales de archivo y combinación. Seleccione los componentes adecuados, haga clic en Aceptar y guarde la imagen combinada. Para cuantificar el área del tumor cerebral en la imagen fluorescente, seleccione selección automática.Mueva la flecha al área de posición GFP y haga clic para crear una selección automáticamente. A continuación, haga clic de nuevo para confirmar la selección. Se mostrarán todas las medidas.Si se puede observar más de un área positiva de GFP, repita la medición con el área siguiente. Las lesiones metastásicas cerebrales pueden detectarse tan pronto como ocho semanas después de la inyección mediante imágenes de luciferasa y microscopía estereofluorescente. Después de la obtención de imágenes, se pueden fijar y procesar partes de las metástasis cerebrales en formol para la tinción con hematoxilina y eosina a fin de validar la presencia de lesiones de metástasis cerebrales, y para la tinción inmunohistoquímica con el fin de detectar marcadores proteicos específicos de interés.Al intentar este protocolo, es importante mantener la viabilidad celular manteniendo las células en hielo durante no más de una hora, y evitar las burbujas de aire en la suspensión celular para evitar la formación de émbolos y la mortalidad de los ratones. Después de la inyección en la vena de la cola, monitoreamos el crecimiento y la progresión de la metástasis cerebral con imágenes de luciferasa. Después de la eutanasia, la microscopía estereofluorescente y la histología confirmaron lesiones de metástasis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video describe una técnica de inyección de células cancerosas marcadas mediante inyección de venas de cola en un modelo de ratón. Además, monitorizamos la formación y el crecimiento del cáncer de mama mediante imágenes de animales vivos in vivo en tiempo real.

Inyección de venas de cola: un método para administrar células cancerosas para estudios metastásicos en un modelo de ratón

Fuente: Lim, M., et al. Modelado de metástasis cerebrales mediante inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna. J. Vis. Exp. (2022)En este video, un ratón anestesiado se somete a un procedimiento quirúrgico en el que se inyectan células cancerosas en la arteria carótida común (CCA) para facilitar la entrega dirigida al cerebro. El procedimiento implica la sutura y manipulación precisas de las arterias carótidas para dirigir las células inyectadas hacia la arteria carótida...

Modelado de metástasis de tumores cerebrales mediante la inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna

Un cáncer de cerebro modelo murino de metástasis de mama se establece con ultrasonido intracardiaco inyección guiada por imágenes de células MDA-MB231/Br-GFP. Desarrollo de las metástasis intracraneales multifocales ha sido supervisado longitudinalmente utilizando alta resolución 9.4 T MRI.

Guiada por imagen de ultrasonido de inyección intracardiaca de desarrollar un modelo de ratón de cáncer de mama metástasis cerebrales Seguido por Longitudinal MRI

Este manuscrito proporciona el procedimiento detallado de la inyección de la arteria ilíaca (IIA), una técnica para administrar células cancerosas específicamente a los tejidos de las extremidades posteriores, incluidos los huesos, para establecer metástasis óseas experimentales. Aunque inicialmente se estableció con modelos de tumores de mama, este protocolo puede extenderse fácilmente a otros tipos de cáncer.

Intra-ilíaca Arteria inyección de Modelamiento eficiente y selectiva de microscópico metástasis en los huesos

La metástasis desempeña un papel profundo en la virulencia del cáncer, representando aproximadamente el 90% de las muertes.  Presentamos un protocolo para un modelo de melanoma metastásico en ratones que es útil para determinar la eficacia de agentes terapéuticos frente a este fenómeno clínico.

La inyección de células de melanoma murino singénico para determinar su potencial metastásico en los pulmones

Se desarrolló un procedimiento quirúrgico para administrar células tumorales mamarias al hígado murino mediante inyección en la vena porta. Este modelo permite la investigación de las etapas tardías de la metástasis hepática en un huésped totalmente competente para el sistema inmunitario, incluida la extravasación de células tumorales, la siembra, la supervivencia y el crecimiento metastásico en el hígado.

Una inyección Modelo vena porta del hígado para estudiar la metástasis del cáncer de mama

Aquí, presentamos un protocolo para implantar las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de manera sencilla, menos forma invasiva y fácil de manejar, y este modelo Murino ortotópico mama cáncer con un entorno de almohadilla de grasa mamaria adecuada puede utilizarse para investigar diversos aspectos de la cáncer.

Ortotópico inyección de las células de cáncer de mama en la almohadilla de grasa mamaria de ratones

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

La inyección intravenosa de células cancerosas se usa a menudo en la investigación de metástasis, pero la carga tumoral metastásica puede ser difícil de analizar. Aquí, demostramos un modelo de metástasis de inyección en la vena de la cola e incluimos un enfoque novedoso para analizar la carga tumoral de pulmón metastásica resultante.

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

El modelado intracraneal de metástasis cerebral se complica por la incapacidad para controlar el tamaño del tumor y la respuesta al tratamiento con métodos precisos y oportunos. La metodología presentada combina la inyección de tumores intracraneales con el análisis de imágenes por resonancia magnética, que cuando se combina, cultiva inyecciones precisas y consistentes, monitorización animal mejorada y mediciones precisas del volumen tumoral.

Modelado de metástasis cerebrales a través de inyección intracraneal e imágenes de resonancia magnética

La metástasis cerebral es una causa de morbilidad y mortalidad graves en pacientes con cáncer. La mayoría de los modelos de ratón con metástasis cerebral se complican con metástasis sistémicas que confunden el análisis de la mortalidad y los resultados de la intervención terapéutica. Aquí se presenta un protocolo para la inyección carótida interna de células cancerosas que produce tumores intracraneales consistentes con tumores sistémicos mínimos.

Modelado de metástasis cerebrales mediante inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna

Aprende a generar metástasis cerebrales en modelos murinos mediante inyección en la vena de la cola usando líneas celulares de cáncer de mama inflamatorio. Este método reproduce fielmente los pasos de colonización metastásica cerebral.

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

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