Métodos de microscopía a escala de tiempo múltiple para la caracterización de microburbujas marcadas con fluorescencia para la liberación de fármacos desencadenada por ultrasonido

Este protocolo se puede utilizar para caracterizar la respuesta de microburbujas marcadas fluorescentemente que están diseñadas para aplicaciones de administración de medicamentos activadas por ultrasonido, que incluyen los mecanismos de activación y los bioefectos. La clave está en la combinación de técnicas de imagen que nos permite desentrañar el problema multiescala de la administración de fármacos desencadenada por ultrasonido con burbujas, tanto a diferentes escalas espaciales como a diferentes escalas de tiempo. Para obtener imágenes de una sola burbuja mediante microscopía Brightfield, coloque una aguja de ventilación de calibre 19 y use una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 19 para extraer una pequeña cantidad de la suspensión de microburbujas del vial de vidrio en un tubo pequeño para facilitar el pipeteo en el siguiente paso.

Usando una pipeta, diluya la solución de microburbuja en solución salina tamponada con fosfato filtrado. Use una jeringa de 10 mililitros para inyectar la muestra en una salida del portamuestras hasta que el soporte esté lleno sin crear burbujas de aire, inyectando más de la muestra si es necesario. Cierre ambas válvulas del portamuestras y coloque el soporte de muestra perpendicular al eje óptico del microscopio.

Antes del análisis de la muestra, establezca la frecuencia de conducción de ultrasonido y la presión acústica deseadas en el generador de forma de onda arbitraria y, comenzando con el campo de visión en una esquina del soporte de la muestra, use la etapa XYZ para mover el soporte para ubicar microburbujas individuales en el campo de visión del microscopio, luego conecte una fibra óptica conectada a un baño de agua a una luz estroboscópica e inicie la grabación. Repita la imagen tantas veces como desee por configuración de ultrasonido, moviendo el soporte de la muestra al menos dos milímetros a un campo de visión que contenga microburbujas no sincronizadas para cada análisis. Para imágenes microscópicas de fluorescencia de las microburbujas, después de diluir la solución de microburbujas en solución salina tamponada con fosfato como se ha demostrado, establezca la frecuencia de conducción de ultrasonido y la presión acústica deseadas en el generador de forma de onda arbitraria y establezca el retardo de disparo para el láser en el generador de retardo de pulso para la excitación de fluorescencia de las nanopartículas de las microburbujas, luego use la etapa XYZ para mover el soporte de muestra para localizar microburbujas individuales y ponerlas en el foco de el objetivo, luego activar la grabación.

Repita la imagen como desee alterando la configuración del ultrasonido y moviendo el soporte de la muestra al nuevo campo de visión como se ha demostrado. Para la obtención de imágenes por microscopía intravital, primero coloque un soporte de animal calentado en la etapa de posicionamiento XY entre la guía de onda y el objetivo y agregue gel de acoplamiento a la guía de onda. Inserte un catéter de vena de la cola en la vena de la cola de un ratón anestésico portador de tumores y coloque el ratón equipado con una cámara de ventana en el soporte calefactado.

Agregue una gota de agua a la cubierta. Para visualizar la vasculatura del tejido tumoral, inyecte por vía intravenosa 30 microlitros de cuatro miligramos por mililitro de 2 megadalton dextrano marcados fluorescentemente en el catéter de la vena de la cola y use la etapa de traducción XY para mover al ratón hasta que se pueda localizar un campo de visión con vasos sanguíneos adecuados. Ajuste la velocidad de fotogramas, el campo de visión y la duración de la grabación de acuerdo con los parámetros del experimento y registre las imágenes de referencia de los recipientes.

Cuando se hayan adquirido las imágenes de referencia, establezca la frecuencia de conducción del ultrasonido, la longitud del pulso y la amplitud de la presión acústica en el generador de forma de onda arbitraria e inyecte por vía intravenosa 50 microlitros de muestra de microburbuja en la vena de la cola. A continuación, imagine la vasculatura como se demuestra. El análisis de las microburbujas por microscopía de fluorescencia confocal revela una distribución de partículas no uniforme de la cáscara de la microburbuja.

La estructura general de las microburbujas se puede visualizar aún más mediante microscopía electrónica de barrido. El análisis de la dinámica radial y el comportamiento fenomenológico de la microburbuja insonificada mediante microscopía brightfield permite la valoración del cambio relativo en el radio de la microburbuja a lo largo del tiempo. Aquí, se muestra una secuencia de imágenes de una entrega exitosa típica de nanopartículas marcadas fluorescentemente.

Se puede observar que las nanopartículas incrustadas en la cubierta de la microburbuja emiten fluorescencia cuando la luz láser llega a la burbuja. Sin embargo, como se observó en esta entrega fallida, las nanopartículas fluorescentes se iluminan sobre la cáscara de la microburbuja, que permanece intacta durante la exposición al ultrasonido. Las imágenes intravitales de múltiples fotones se pueden utilizar para determinar la extravasación espacial y temporal de las nanopartículas durante la exposición al ultrasonido, lo que puede ser beneficioso para comprender y optimizar los mecanismos subyacentes a la entrega de nanopartículas mediadas por ultrasonido.

Con la alineación perfecta de las vías ópticas y acústicas en todas las escalas de longitud y tiempo, se proporciona una visión completa de la administración de medicamentos desencadenada por ultrasonido. Las respuestas entregadas por nuestros experimentos multiescala ahora se traducirán a la práctica clínica. Los resultados proporcionarán información valiosa para una variedad de aplicaciones terapéuticas, incluida la terapia contra el cáncer.