Impresión 3D de microportadores de hidrogel in vitro mediante chorro de fuerza viscoso-inercial alternado

Ofrecemos un proceso bioimpreso suave para la preparación de microportadores con una buena controlabilidad y biocompatibilidad. Después de la encapsulación por células, los portadores también se pueden utilizar en la expansión celular in vitro y la construcción de microtejidos funcionales. El desplazamiento limitado, en lugar de fuerzas severas en condiciones similares, actúa sobre la boquilla durante el proceso de impresión, manteniendo las propiedades físicas / químicas originales de la biotinta en la máxima medida.

Además de los microportadores convencionales, se pueden construir unidades con distribución celular interna o estructuras de cápsulas encapsuladas en tritosina y aplicarlas al ensamblaje de diferentes estructuras tisulares. Para la preparación de la boquilla, cargue micropipetas de vidrio en el extractor de acuerdo con las instrucciones del fabricante y establezca los parámetros de tracción para el extractor. Use una microtorra para cortar la boquilla en el diámetro designado para obtener el diámetro de punta específico para el experimento, y esterilize la boquilla en alcohol durante cinco minutos.

Luego, enjuague la boquilla tres veces con agua estéril para eliminar cualquier residuo de alcohol. Para preparar la biotinta de hidrogel, diluya la solución madre de alginato de sodio al 4% esterilizada en cloruro de sodio al 0,9% a concentraciones de 0,5, 1, 1,5 y 2% en peso por volumen. Para la formación de microgotas, cargue cinco mililitros de biotinta en una jeringa estéril desechable e instale la jeringa en una bomba de jeringa.

Con una manguera de un milímetro de diámetro interior, conecte la jeringa y la boquilla de impresión. Apriete el tornillo de sujeción para asegurar la boquilla en su lugar y presione rápidamente la bomba de jeringa para cargar la biotinta en la boquilla. Ajuste los parámetros del generador de señal y preestablezca la trayectoria de movimiento y el modo de disparo de la vibración para que caiga bajo demanda.

A continuación, imprima las gotas siguiendo los patrones prediseñados. Para la formación de microportadores, agregue cinco mililitros de solución de reticulación a una placa de Petri y coloque el plato debajo de la boquilla de impresión como sustrato. Después de imprimir, reticule las microportadoras durante tres minutos antes de transferir la suspensión de la microportadora a un tubo de centrífuga.

Luego, enriquezca los microportadores por centrifugación y resuspóndalos en un medio de cultivo apropiado a aproximadamente 600 microportadores por mililitro. Antes de su inoculación, reemplace el sobrenadante de un cultivo celular A549 con cinco mililitros de medio libre de suero complementado con colorante CMFDA verde rastreador de células 10 micromolares para una incubación de 30 minutos en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, reemplace la solución de colorante con medio fresco y vuelva a suspender las células a una densidad de 1.6 veces 10 a las seis células por mililitro de medio.

Agregue un mililitro de suspensión de microportador a las células y un mililitro de células A549 a cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos de baja adherencia. Coloque la placa en un agitador en la incubadora de cultivo celular a 30 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, retire la placa del agitador y permita que los microportadores se asienten durante 30 minutos antes de observar y medir la boquilla de impresión, las placas de Petri y las células inoculadas por microscopía de fluorescencia de campo brillante y confocal.

Usando una boquilla de punta de 30 micrómetros, se pueden imprimir de manera estable múltiples tipos de biotinta, incluyendo PBS, 1.5% de alginato y 1.5% de gelatina en placas de Petri. A medida que las tintas aumentan en viscosidad, el proceso de impresión se vuelve cada vez más difícil y se necesitan mayores fuerzas motrices para obtener gotas más grandes. Los parámetros de impresión se pueden configurar para imprimir las gotas en arreglos 2D específicos, como se observa en este experimento de impresión.

El diámetro de la punta de la boquilla tiene un impacto directo del tamaño del microportador que se puede imprimir. Como se observa en estas imágenes de campo brillante y confocales, las células A549 se adhieren a los microportadores de alginato-colágeno después de dos días de cultivo. Después de seis días, las células A549 cubren casi por completo las superficies del microportador.

Después de este procedimiento, hemos recubierto la superficie del microportador con quitosano y hemos utilizado gluconato para disolver el gel de alginato para formar una estructura quística que se puede aplicar para construir estructuras huecas como los alvéolos. El proceso de impresión para preparar microportadoras es bastante suave, por lo tanto, este método puede ser ampliamente utilizado para imprimir microportadoras que contienen células.