Análisis crio-EM y de partículas individuales con Scipion

Scipion proporciona las herramientas para crear todo el flujo de trabajo de procesamiento de una manera integradora para un análisis de una sola partícula en crio-EM para lograr una reconstrucción de alta resolución de la muestra biológica. Este marco permite crear el flujo de trabajo de procesamiento utilizando varios paquetes de procesamiento de imágenes, favoreciendo la interoperabilidad, la trazabilidad, la reproducibilidad y la combinación de información transmitida por diferentes métodos para generar una salida más precisa. Scipion está en constante crecimiento, incluyendo nuevos métodos y paquetes.

Además, se ha extendido a la crioelectrónica y al modelado atómico, lo que permite también crear flujos de trabajo para procesar estos datos. Para crear un proyecto en Scipion, haga clic en Crear proyecto para crear el proyecto. Para importar las películas del microscopio, seleccione Importar películas.

Aparecerá una nueva ventana. En esta ventana, ingrese la ruta a los datos y establezca el voltaje del microscopio en 300 kilovoltios, la aberración esférica en dos milímetros, el contraste de amplitud en 0.1, la tasa de aumento en 50, 000, el modo de frecuencia de muestreo en Desde imagen y el tamaño de píxel en 1.34 angstroms. Cuando se hayan establecido todos los parámetros, haga clic en Ejecutar.

Cuando finalice el método, abra la ficha Resumen, haga clic en Analizar resultados. Aparecerá una nueva ventana con una lista de las salidas generadas por el método. Para ejecutar el método de flujo óptico para la alineación de películas, abra el método de alineación óptica xmipp3 y seleccione las películas importadas como películas de entrada y establezca el rango de fotogramas en ALIGN de 2 a 13.

En Parámetros adicionales, establezca la opción Usar alineación de película anterior a FOTOGRAMAS SUMAR en No.Deje todas las demás opciones establecidas en sus valores predeterminados y ejecute el programa. Haga clic en Analizar resultados para comprobar las micrografías obtenidas y la trayectoria de los desplazamientos estimados. Para cada micrografía, es posible verificar la densidad espectral de potencia, las trayectorias obtenidas para alinear la película tanto en las coordenadas cartesianas como polares, y el nombre de archivo de la micrografía obtenida.

Observe que las partículas de la muestra son mucho más visibles en la micrografía en comparación con un solo fotograma de la película. Para la selección de partículas, abra el método de selección manual xmipp3 y seleccione las micrografías obtenidas previamente como micrografías de entrada. Haga clic en Ejecutar.

Aparecerá una nueva ventana interactiva. En esta ventana, cambie el tamaño de píxel a 150. La micrografía seleccionada aparecerá en una ventana más grande.

Elija todas las partículas visibles dentro de una región. Cuando todas las partículas se hayan seleccionado manualmente, haga clic en Activar entrenamiento para iniciar el aprendizaje. Las regiones restantes de la micrografía se seleccionarán automáticamente.

Compruebe las partículas recogidas. Para incluir una partícula adicional, haga clic en una partícula de interés. Para eliminar cualquier partícula incorrecta, mantenga presionada la tecla Mayús y haga clic en las partículas según sea necesario.

Cuando todas las partículas se hayan seleccionado automáticamente, seleccione las siguientes cuatro micrografías una a la vez para crear un conjunto de entrenamiento representativo. Las partículas en cada micrografía seleccionada se seleccionarán automáticamente, verificando cada micrografía para incluir o eliminar partículas según sea necesario. Cuando se haya adquirido un conjunto de entrenamiento, haga clic en Coordenadas para guardar las coordenadas de todas las partículas seleccionadas.

Después de adquirir el conjunto de entrenamiento, abra xmipp3 auto-picking para indicar la selección manual anterior en Xmipp particle picking run y configure Micrographs para que elija en Igual que supervisado. Haga clic en Ejecutar para generar un conjunto de alrededor de 100.000 coordenadas. Para aplicar el enfoque de consenso, abra la selección criológica de esfín y establezca las micrografías preprocesadas como las micrografías de entrada en el modelo de selección en el valor predeterminado.

Establezca el umbral de confianza en 0,3 y el tamaño del cuadro en 150 y, a continuación, haga clic en Ejecutar. El método también debe generar alrededor de 100, 000 coordenadas. A continuación, abra la selección de consenso profundo de xmipp3 y establezca las coordenadas de entrada para incluir la salida del criolo de esfín y la selección automática de xmipp3, el tipo de modelo Seleccionar para preentrenado y el entrenamiento de salto y puntuación directamente con el modelo preentrenado en Sí, luego haga clic en Ejecutar.

Al final de la ejecución, haga clic en Analizar resultados. En la nueva ventana, haga clic en el icono del ojo. Se abrirá una segunda ventana nueva con una lista de todas las partículas.

Los valores de la puntuación Z en la columna darán una idea de la calidad de cada partícula, ya que un valor bajo es indicativo de una mala calidad. Para ordenar las partículas de la puntuación Z más alta a la más baja, haga clic en Xmipp Z-score deep learning y seleccione las partículas con una puntuación Z superior a 0,75. A continuación, haga clic en Coordenadas para crear un nuevo subconjunto con aproximadamente 50.000 coordenadas.

Para calcular la resolución localmente, abra xmipp3 local MonoRes y establezca el volumen de entrada en la salida del último paso de refinamiento, el ¿Desea usar la mitad de volúmenes a Sí, y el Rango de resolución de 1 a 10 angstroms? Cuando se hayan establecido los parámetros, haga clic en Ejecutar. Cuando se haya calculado la resolución, haga clic en Analizar resultados y seleccione Mostrar histograma de resolución y Mostrar sectores de color.

Se mostrará la resolución en las diferentes partes del volumen. La mayoría de los vóxeles de las partes centrales de las estructuras deben representar resoluciones alrededor de tres angstroms, mientras que las peores resoluciones se observarán en las regiones exteriores de las estructuras. También se mostrará un histograma de las resoluciones por vóxel con un pico alrededor o por debajo de tres angstroms.

Para aplicar un enfoque, abra el afilado xmipp3 localdeblur y seleccione la salida del último paso de refinamiento como Mapa de entrada, y establezca el mapa de resolución en el mapa MonoRes de obtención. Una vez ejecutado el comando, haga doble clic en el conjunto de volúmenes generados como salida en la pestaña Resumen. Se pueden comprobar los volúmenes generados en cada iteración.

También se recomienda abrir el volumen con otras herramientas, como UCSF Chimera, para observar mejor las características del volumen en 3D. En esta figura, se puede observar una correlación de concha de Fourier de tres angstroms, que está muy cerca del límite de Nyquist. Como se ilustra, las rebanadas de volumen 3D reconstruidas exhiben un alto nivel de detalle y estructuras bien definidas.

Después del análisis local, la mayoría de los vóxeles centrales logran una resolución inferior a tres angstroms. Sin embargo, las regiones exteriores de las rebanadas de resolución local demuestran una resolución más baja, lo que es consistente con la difuminación observada dentro de esas áreas. Después del post-procesamiento, se pueden observar las frecuencias más altas del volumen del mapa 3D, revelando más detalles y mejorando la representación.

Cuando la resolución alcanzada es lo suficientemente alta, incluso algunas de las partes bioquímicas de la estructura se pueden observar. Si la estructura obtenida tiene una resolución baja, y no es capaz de evolucionar hacia una mejor, se puede observar un volumen borroso con una baja correlación de capa de Fourier, curva de resolución e histograma de la estimación local. Después de la recolección, se puede verificar la clasificación 2D para evaluar la calidad de la partícula.

Por ejemplo, en esta clasificación, las partículas son ruidosas, descentradas o acopladas, lo que indica que la recolección fue incorrecta. Se puede realizar otro punto de control durante la estimación inicial del volumen. En este ejemplo, se creó una estimación incorrecta mediante una configuración incorrecta para el método.

Una vez que se produce un mapa 3D con una resolución suficiente, el siguiente paso es proponer un modelo atómico para el mapa. Esto se puede hacer dentro de Scipion utilizando los complementos de modelado. Esta técnica se puede utilizar para reconstruir con éxito macromoléculas biológicas para la evaluación de sus interacciones moleculares y la función del conjunto biológico como base para el diseño de fármacos.