Cribado de fragmentos basado en RMN en una muestra mínima pero en modo de automatización máxima

Realizamos estudios de resonancia magnética nuclear. Esto nos permite determinar las estructuras de proteínas, ARN y ADN en solución. Estas biomoléculas son los constituyentes, son los componentes de nuestras células, y nuestros protocolos que presentamos aquí se refieren a la selección de moléculas pequeñas y su unión a estos objetivos.

De estas moléculas, nuestra química medicinal y biología estructural pueden derivar nuevos medicamentos que combaten enfermedades. La principal ventaja de nuestra técnica es que tenemos un control total sobre la calidad de las dianas moleculares, como las proteínas, y tenemos un control total sobre la calidad de los fragmentos de moléculas pequeñas y los fármacos, y también podemos detectar proteínas para la unión de una amplia gama de afinidades, lo cual es una ventaja en comparación con otras metodologías. Para preparar muestras de cribado para la medición de RMN, utilice un robot de preparación de muestras para distribuir 768 compuestos en ocho placas de 96 pocillos para obtener 64 mezclas que contienen 12 fragmentos a una concentración final de 4,2 milimolares por mezcla.

Transfiera el objetivo biomolecular de interés, diluido en un tampón de cribado apropiado, al número apropiado de tubos cambiadores de muestras de alto rendimiento de RMN de tres milímetros con código de barras, y use el robot para transferir 10 microlitros de cada mezcla de ligandos a cada tubo de biomolécula objetivo. Luego, haga que el robot mezcle bien las soluciones. Para la adquisición de RMN, cargue la muestra en el espectrómetro.

Abra el software del espectrómetro, luego, seleccione el conjunto de parámetros y las secuencias de pulsos para experimentos basados en ligandos. Para todos los experimentos enumerados, seleccione la escultura de excitación como supresión de agua. Para la detección de flúor-19, seleccione experimentos 1D y T2.

Seleccione el ancho espectral a 220 partes por millón, la frecuencia de excitación a 140 partes por millón y el tiempo de análisis entre una y cinco horas. Para T2, el tiempo de CPMG debe alternar entre 5 y 100 milisegundos. Grabe los experimentos T1r y T2.

Registre la diferencia de transferencia de saturación como un pseudo 2D. Para procesar los dos espectros 1D individuales, utilice la función ProcStd del programa AU, con o sin la opción relax. El WaterLOGSY es un solo 1D que debe ser escalonado con un negativo para la señal de disolvente.

Para analizar los datos de detección de hidrógeno, siga las instrucciones de la herramienta de detección basada en fragmentos para almacenar los datos de RMN de resonancia magnética biomolecular de las campañas de detección, de modo que cada mezcla de detección tenga su directorio en el que un subdirectorio contiene los diferentes experimentos medidos en la muestra. Almacenar los espectros de referencia, teniendo todos los datos guardados de las muestras sin la diana biomolecular, pero con las mezclas y el compuesto único en diferentes directorios. Cree una ruta directa al directorio que contiene los datos adquiridos y seleccione el directorio RMN en el que todas las mezclas deben tener un directorio distinto.

Asegúrese de que los archivos CSV, pantalla de fragmentos, documento XML y BAC también se copian en el directorio RMN de los datos. Para utilizar la herramienta de filtrado basado en fragmentos para una muestra examinada, arrastre el símbolo del proyecto de cribado basado en fragmentos al centro de la ventana de análisis. El símbolo debería aparecer si los conjuntos de datos guardados anteriormente se copiaron en él.

La ventana de opciones de filtrado basada en fragmentos debería abrirse automáticamente. Seleccione un archivo de cóctel CSV que contenga los nombres de las mezclas, los nombres de cada fragmento y la división de cada fragmento en las mezclas. Defina una carpeta de espectros de ligando de referencia con todos los espectros medidos de los fragmentos individuales, y defina una carpeta de experimentos en blanco de referencia, que generalmente contiene los conjuntos de datos de las mezclas sin el objetivo investigado.

Para definir los espectros investigados y los colores de visualización de espectros, abra la ficha Tipos de espectros y establezca el tipo de especificación de acuerdo con los datos del proceso. En la pestaña Diseño de visualización, defina los espectros que se compararán según los tipos de especificación. A continuación, haga clic en Aceptar para iniciar el proyecto.

Mientras se procesan los datos, se abrirá una ventana separada con la tabla que resume todas las mezclas de cócteles y los ligandos de cada mezcla. Haga doble clic en una celda para abrir los conjuntos de datos respectivos. Antes de asignar aglutinantes, asegúrese de que los picos de referencia coincidan entre sí y tengan el mismo cambio químico.

Si se observan diferencias, abra la pestaña Proceso y use la opción de procesamiento en serie para corregirlas. Para el primer análisis de las mezclas de flúor-19, abra la pestaña Analizar y seleccione la función de integración. Asegúrese de que se defina una región de integración clara para la señal de flúor-19 correspondiente para cada fragmento de la mezcla.

Guarde las regiones de integración de exportación para exportar el archivo de integración para su uso futuro y guarde los archivos de integración utilizados en el directorio de instalación adecuado. Para los datos de flúor-19, abra un conjunto de datos con o sin el destino investigado y, en la pestaña Analizar, haga clic en Integrar y leer Importar regiones de integración para cargar el archivo de integración correspondiente en el espectro actual. A continuación, haga clic en Guardar y volver para localizar una lista de las regiones integradas en la ficha Integrales y copie esta información en una hoja de cálculo para el análisis posterior.

La estructura molecular o constitución de los ligandos en la biblioteca de fragmentos se analiza utilizando software de confianza molecular como se demuestra, y los resultados se presentan como una salida gráfica. Un color naranja indica que el fragmento exhibe una inconsistencia en la estructura o concentración. Los pozos de color verde indican que el fragmento es consistente.

En este análisis representativo, 103 fragmentos que contenían uno o varios grupos de flúor de la biblioteca interna se dividieron en cinco mezclas de 20 a 21 fragmentos por mezcla. Se midieron experimentos de relajación transversal de flúor-19 para cada mezcla que aplicó trenes de pulsos CPMG. Los umbrales son útiles para definir aglutinante, aglutinante débil o no aglutinante en la mezcla, como se observa en estos espectros típicos de proteína tirosina quinasa A y ARN de la proteína tiamina.

En este análisis representativo, el golpe uno mostró una disminución de T2 de aproximadamente el 50% y un cambio químico mayor o igual a seis hercios. El WaterLOGSY no exhibió un cambio significativo en la señal para ser contado como positivo. Sin embargo, como dos de cada tres experimentos fueron positivos, este fragmento se contó como un éxito.

Para el golpe dos, el T2 mostró una disminución de aproximadamente el 80% en la intensidad de la señal. También se observó un claro cambio de señal para el WaterLOGSY. El cambio químico no fue suficiente en este experimento, pero como los dos criterios anteriores eran positivos, todavía se contó como un éxito.

El objetivo final de tales métodos es desarrollar nuevos fármacos o inhibidores de alta afinidad de, por ejemplo, enzimas, y en esto, la química medicinal se hace cargo y sintetiza estas nuevas moléculas, pero la biología de la estructura, las técnicas que se aplican aquí pueden guiar la química medicinal y hacer que ese enfoque sea mucho más rápido.