El establecimiento y la utilización de modelos de xenoinjerto derivados del paciente de metástasis del sistema nervioso central

El desarrollo de nuevas terapias para la metástasis del SNC se ha visto obstaculizado por la falta de buenos modelos preclínicos. Nuestros modelos de xenoinjertos derivados del paciente recapitulan la metástasis del SNC mejor que los modelos de línea celular utilizados históricamente. Al utilizar diferentes rutas de inoculación tumoral, puede estudiar diferentes aspectos de la cascada metastásica.

Cada ruta tiene ventajas que se pueden aprovechar para su estudio. Demostrando el procedimiento estará Ben Yi Tew, un becario postdoctoral de mi laboratorio. Para la implantación del flanco subcutáneo de tumores PDX criopreservados, descongele rápidamente el tejido tumoral criopreservado en un baño de agua de 37 grados centígrados.

Luego, enjuáguelo en cinco mililitros de DPBS en una placa de cultivo de tejidos. Luego, después de confirmar la anestesia en un ratón NOG hembra de tres a ocho semanas de edad, haga una incisión de 0.5 a un centímetro en el flanco izquierdo o derecho e inserte una pieza de 2x2x2 milímetros del tejido tumoral profundamente en el bolsillo. Después de cerrar la incisión, permita que el ratón se recupere de la anestesia con monitoreo hasta que sea ambulatorio.

Una vez que el tumor comienza a crecer, mida el tumor tres veces por semana con un calibrador. En el criterio de valoración experimental apropiado, identificar metástasis a través de una necropsia y confirmar la presencia de tumores dentro del órgano diana mediante un análisis histológico. Coloque el tumor PDX resecado en DMEM sobre hielo.

Lave el tumor en cinco mililitros de DPBS en una placa de cultivo de tejidos y retire las regiones necróticas si las hay. Corte el tumor en trozos pequeños de dos a cuatro milímetros de longitud y transfiera los pedazos a un tubo que contenga solución de disociación. Usando el programa apropiado en un disociador, disocie mecánicamente el tejido y filtre la suspensión celular resultante a través de un filtro celular de 70 micrómetros.

Use 20 mililitros de DMEM para lavar las células restantes del filtro y centrifugar la suspensión celular disociada. Luego, resuspenda las células y DPBS para contar y ajuste las células a una concentración de cinco a 10 veces 10 a la cuarta celda por uno o dos microlitros de DPBS. Para preparar el área quirúrgica, afeite el pelaje de la cabeza del ratón para exponer el cuero cabelludo.

Luego, coloque el mouse en un marco estereotáxico, asegurando firmemente la cabeza del mouse con barras para los oídos. Asegúrese de administrar también un analgésico adecuado. Desinfecte el cuero cabelludo con tres exfoliantes alternados de povidona yodada y etanol al 70%.

Haga una incisión longitudinal de cinco a siete milímetros para exponer el cráneo y retraer el cuero cabelludo. Raspa el periostio con fórceps para localizar el bregma. Coloque la aguja del marco estereotáctico en la parte superior del bregma y restablezca las coordenadas a cero.

Mueva el brazo un milímetro hacia atrás y un milímetro lateral a la derecha de la línea media, y marque esta ubicación con un marcador permanente. Luego, perfore un pequeño orificio de rebaba en el cráneo en el lugar marcado, teniendo cuidado de no perforar el cerebro. Cargue una jeringa Hamilton calibre 26 de cinco microlitros con uno o dos microlitros de células y conecte la jeringa al brazo estereotáxico.

Inserte lentamente la aguja dos milímetros en el cerebro y comience a inyectar células a la velocidad deseada. Cuando se hayan entregado todas las células, retraiga lentamente la aguja, llene el orificio con cera ósea y cierre la incisión. Coloque el ratón de nuevo en su jaula con monitoreo hasta la recuperación de la anestesia.

Después de la eutanasia del animal en el punto final experimental apropiado, confirme la presencia de tumores en el cerebro a través de un análisis histológico. Para implantar tumores PDX mediante inyección intracardíaca, prepare las células tumorales como se demostró y coloque el ratón receptor anestesiado en posición supina. Afeite el pelaje en el pecho del animal y desinfecte la piel expuesta con povidona yodada y etanol al 70%.

Extraiga de 0.5 a 10 veces 10 a la quinta células tumorales y hasta 100 microlitros de DPBS en una jeringa equipada con una aguja de calibre 28. Localice el sitio de inyección ligeramente a la izquierda del esternón a medio camino entre la muesca esternal y el proceso xifoides. Luego, inserte la aguja verticalmente en el ratón en el lugar de la inyección.

Una vez que se observa el reflujo, lo que indica una entrada exitosa de la aguja en el ventrículo izquierdo, dispense lentamente la suspensión tumoral en el ventrículo izquierdo sin mover la aguja. Cuando se hayan liberado todas las células, retraiga lenta y verticalmente la aguja y aplique un trozo de gasa estéril en el lugar de la inyección durante aproximadamente un minuto hasta que se detenga el sangrado. Permita que el ratón se recupere en una almohadilla térmica con monitoreo hasta que sea ambulatorio.

En el criterio de valoración experimental apropiado, identificar metástasis a través de una necropsia y confirmar la presencia de tumores dentro del órgano diana mediante un análisis histológico. A pesar de las diferencias en el microambiente tumoral, los tumores PDX demuestran morfologías similares que contienen células con núcleos pequeños y citoplasma escaso, independientemente del sitio de implantación. En este análisis, la inyección intracardíaca de células de melanoma humano resultó en metástasis de las células tumorales al cerebro del ratón, mientras que la inyección intracardíaca de metástasis cerebrales de células tumorales de cáncer de pulmón de células pequeñas humanas resultó en metástasis en la cavidad abdominal y el hígado del ratón.

Estos protocolos permiten la creación de estudios preclínicos para probar nuevos tratamientos y combinaciones de tratamientos, y pueden ayudar a estudiar los procesos biológicos y la metástasis tumoral.