Name: Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Aprende a realizar craneotomía para visualizar actividades neuronales en el hipocampo de ratones despiertos. Este protocolo permite imagen crónica in vivo con alta resolución espacial y temporal usando ventanas ópticas personalizadas.

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Nos gustaría agradecer a todos los miembros del Grupo de Bioingeniería Molecular de la Universidad de Westlake por toda la ayuda y la discusión útil. También agradecemos a Jinze Li y Jie-Min Jia de la Universidad de Westlake por la ayuda con la filmación del procedimiento quirúrgico.
Este trabajo fue apoyado por fondos adicionales de la Fundación de la Universidad de Westlake, la Beca de Joven Investigador BBRF 2020 y la subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China 32050410298 todo a K.D.P.

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<li>Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-endoscopic+system+for+functional+assessment+of+neural+circuits+in+deep+brain+regions%3A+Simultaneous+optical+and+electrical+recordings+of+auditory+responses+in+mouse%27s+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse's inferior colliculus.</a> Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se describe un método para la proyección de imagen a largo plazo de la región del hipocampo CA1 en ratones que se comportan. El método se basa en la implantación crónica de una ventana de imagen a medida, que también permite la administración dirigida de virus o fármacos directamente a las neuronas de interés. El actual protocolo consiste en cuatro porciones principales: i) ensamblar del implante de la proyección de imagen; ii) instalación de implantes de imágenes; iii) inyección de virus a través de implantes de imágenes; iv) imágenes funcionales en ratones que se comportan. A continuación describimos y analizamos los pasos críticos en el protocolo, la solución de problemas, las modificaciones y las limitaciones del método. También discutimos la importancia del método y sus posibles aplicaciones alternativas.
Hay varios pasos críticos en el protocolo descrito que son bastante importantes para la cirugía exitosa: (i) preparación de un implante de imágenes de alta calidad; (ii) condiciones quirúrgicas estériles; (iii) aspiración de la corteza; (iv) colocación precisa del implante de imagen; (v) inyección viral. Como indica el paso 1.6, el exceso de soldadura de estaño requeriría una craneotomía más grande y, por lo tanto, aumenta el riesgo de inflamación. También es muy importante utilizar una cantidad adecuada del pegamento óptico adhesivo al fijar el vidrio de la cubierta a la cánula de imagen, como se indica en el paso 1.11, ya que una cantidad insuficiente puede resultar en fugas de líquido cefalorraquídeo en la cánula de imagen y hacerla opaca. Por otro lado, el exceso de adhesivo óptico puede resultar en la disminución de la transparencia de la ventana de vidrio. La posible contaminación del implante de imágenes puede causar una proliferación activa del tejido conectivo debajo de la ventana óptica y/o inflamación grave, lo que llevará a la terminación temprana del experimento. Por lo tanto, el montaje y la preparación del implante de imágenes antes de la cirugía es casi tan importante como el procedimiento quirúrgico en sí.
Durante la cirugía, la parte de la corteza bajo craneotomía es ablada por la aspiración suave, que da lugar a la sangría inevitable. La sangre en el sitio quirúrgico reduce significativamente la visibilidad del tejido cerebral que debe extirparse. Esto complica la evaluación precisa de la profundidad requerida de la ablación tisular. El enrojecimiento cuidadoso del sitio quirúrgico con PBS cada vez antes de aplicar la succión para quitar la porción siguiente de tejido proporciona un mejor control de la profundidad. El tejido cerebral siempre debe extirparse en pequeñas porciones paso a paso confirmando la profundidad del tejido ablacional antes de proceder con más succión. Un control más fino de la succión también se puede lograr con una aguja roma más delgada. Sugerimos usar una aguja de 26 G, sin embargo, más pequeño de 26 G de diámetro es más propenso a la obstrucción. Además, por lo general se necesita mucha práctica para determinar la profundidad precisa de aspiración requerida para cada animal, ya que el color de la corteza, el cuerpo calloso y el hipocampo pueden variar de un ratón a otro(Figura 3).
La inserción y la fijación del implante de la proyección de imagen se deben hacer muy exacto para asegurar la posición más cercana posible de la ventana de la proyección de imagen a la superficie dorsal del hipocampo. El tamaño de la craneotomía preparada debe coincidir estrechamente con el implante y permitir su inserción sin resistencia significativa. Al mismo tiempo, no debe haber ninguna brecha visible entre el cráneo y el implante para garantizar el sellado adecuado y evitar la exposición al tejido cerebral. Se debe aplicar una presión suave y estable en la parte superior del implante durante su sellado al cráneo. Es casi inevitable tener sangre debajo de la ventana de imágenes durante la instalación del implante. Si el procedimiento quirúrgico se realiza correctamente, la ventana debe despejarse en 3-7 días, y la vasculatura cerebral se vuelve claramente visible. También es importante asegurarse de que el virus se inyecta correctamente debajo de la ventana. En el caso de una expresión fallida, el virus se puede reinyectar varias veces.
La complicación principal que encontramos en algunos casos es visibilidad reducida de la ventana de la proyección de imagen. Hay varias razones posibles de la calidad pobre de la proyección de imagen: i) inflamación en curso; ii) excrecencia del tejido conectivo en el vidrio; iii) gran espacio entre la ventana y el hipocampo. La inflamación es causada generalmente por la contaminación durante cirugía o por el implante no correctamente esterilizado de la proyección de imagen. Sugerimos autoclavar los instrumentos quirúrgicos antes y después de cada cirugía, desinfectar el área de la cirugía justo antes del procedimiento, y usar el equipo de protección personal limpio durante la cirugía. Los implantes por imágenes deben limpiarse después de ensamblarse, esterilizarse y almacenarse en condiciones estériles. La consecuencia del tejido conectivo en el vidrio del implante de la proyección de imagen puede ser debido a la contaminación mecánica en la superficie del cristal o al trauma excesivo del tejido cerebral durante la ablación de la corteza. Después de montar el implante, es importante confirmar que la superficie del vidrio está limpia y lisa. Además, todas las piezas de tejido cerebral dañado deben eliminarse cuidadosamente antes de insertar el implante de imágenes en la craneotomía. En ciertos casos, la brecha entre la ventana de vidrio y el hipocampo resulta en la acumulación de líquido cefalorraquídeo, lo que reduce la calidad de las imágenes. Por lo tanto, durante la instalación del implante, es crucial insertarlo todo el camino para garantizar un buen contacto entre el hipocampo y la ventana de vidrio. A veces, es difícil identificar la razón exacta de la ventana de imágenes opacas. Sugerimos realizar análisis post mortem para revelar condiciones debajo de la ventana óptica y ajustar correspondientemente cirugías subsecuentes.
El método tiene varias limitaciones fundamentales y técnicas que se deben tener en cuenta antes y durante la proyección de imagen in vivo. Una de las principales limitaciones es la ablación de la corteza. Parte de la corteza visual y sensorial se extirpa durante la cirugía. Si bien es difícil evaluar con precisión el impacto de la ablación de la corteza, ya que el tejido cerebral extirpado no se proyecta directamente sobre el hipocampo, varios estudios no demostraron un deterioro notable del aprendizaje dependiente del hipocampo u otras funciones relevantes del hipocampo15,16. Las limitaciones ópticas también deben ser consideradas, especialmente cuando se utilizan las altas lentes objetivas del NA. Por ejemplo, en este estudio, utilizamos una cánula de 1,75 mm de largo con un diámetro interior de 1,9 mm. La geometría de esta cánula no preservará el NA completo del objetivo de aire con NA más de ~ 0.5 o el objetivo de agua con NA más de ~ 0.6, ya que recortará algo de luz. Otra limitación, común para todos los implantes de imágenes cerebrales, es que parte del cerebro se está exponiendo, promoviendo así la pérdida de calor17,18. Sin embargo, la temperatura fisiológica del cerebro se puede restaurar fácilmente durante proyección de imagen por la perfusión de un almacenador intermediario caliente.
El método descrito se puede modificar o ajustar fácilmente para otras aplicaciones. Por ejemplo, la preparación se puede adaptar para la proyección de imagen del striatum7. Como el estriado se encuentra un poco más profundo que el hipocampo, la cánula de imágenes más larga se debe utilizar para ensamblar el implante de imágenes. Sugerimos usar la cánula de la proyección de imagen de 2.0 milímetros. Las coordenadas de la craneotomía deben ajustarse en consecuencia (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Además, la inyección de virus a través de cánula de infusión permite lograr la expresión de un transgén en una capa delgada de neuronas cuando se utiliza el serotipo AAV con diseminación restringida19,20. Es particularmente beneficioso para las imágenes de un fotón debido a la reducción de la fluorescencia fuera de foco de capas más profundas y, como resultado, la mejora de las imágenes de resolución unicelular. Además, la cánula de inyección también se puede utilizar durante la toma de imágenes funcionales para la administración de fármacos u otros productos químicos directamente sobre las neuronas en el fov(Figura 5B). En general, la cánula de infusión agrega funcionalidades útiles al implante de imágenes, mejorando la calidad de las imágenes debido a la expresión viral dirigida y permitiendo la estimulación farmacológica de las neuronas en el campo de visión. La placa de cabeza utilizada proporciona una estabilidad extraordinaria de los implantes de imágenes que minimizan los artefactos de movimiento, incluso en animales en movimiento activo en una cinta de correr. La placa de la cabeza es pequeña y ligera, causando molestias mínimas a los animales, y permanece estable durante varios meses después de la instalación. El implante de imagen también es compatible con imágenes multifotónicas15,16,21 y se puede combinar con micro-endoscopios22,23. Un implante similar de la proyección de imagen también fue utilizado para la proyección de imagen del multiphoton de las estructuras más profundas del hipocampo, incluyendo el radiatum del estrato, la laguna del estrato, y la convolución del cerebro dentada16,24,25,26,27. Sin embargo, dirigirse a las estructuras más profundas del hipocampo con AAV a través de la cánula de infusión puede requerir una mayor optimización del serotipo de AAV y el volumen19.
Creemos que el protocolo descrito facilitará los estudios que tienen como objetivo investigar la actividad neuronal con alta resolución espaciotemporal en el hipocampo de ratones que se comportan utilizando configuraciones de imagen de un fotón simples y asequibles.

El hipocampo es una región clave del cerebro responsable del aprendizaje y la memoria1, así como de la navegación espacial2. La atrofia del hipocampo se asocia con trastornos neurológicos y psiquiátricos que implican pérdida de memoria y deterioro cognitivo3,4,5. En ratones, el hipocampo es un modelo muy bien establecido para estudiar el aprendizaje espacial, contextual y asociativo y la formación de la memoria en los niveles celular y de red4,5. Los estudios mecanicistas del aprendizaje y la memoria requieren la interrogación longitudinal de la estructura neuronal y la función en ratones que se comportan. Las imágenes de fluorescencia en combinación con sondas codificadas genéticamente6 proporcionan capacidades sin precedentes para registrar la dinámica de voltaje de membrana7,8,transitorios de calcio9,y cambios estructurales10 sobre grandes subconjuntos de neuronas por vía intravírica. Sin embargo, el acceso óptico al hipocampo en ratones está obstruido por la corteza, que puede alcanzar más de 1 mm de espesor. Aquí, se describe un procedimiento para el montaje de un dispositivo de imagen a medida y su implantación crónica en la cabeza del ratón para el acceso óptico a largo plazo a la subregión CA1 del hipocampo dorsal en ratones que se comportan. La cánula de infusión integrada en el implante de imagen permite la administración de virus o fármacos directamente sobre las neuronas en el campo de visión. La preparación descrita en combinación con microscopía de campo amplio permite la obtención de imágenes recurrentes de los grandes subconjuntos de neuronas en ratones que se comportan durante largos períodos de tiempo. Utilizamos esta preparación para expresar el calcio y el voltaje genético codificados indicadores en la región hippocampal CA1 vía la inyección apuntada del virus adeno-asociado recombinante (rAAV) para las grabaciones neuronales de la actividad en la resolución unicelular. También realizamos proyección de imagen longitudinal del calcio de los subconjuntos neuronales correspondientes en la alta resolución espaciotemporal en animales que se comportaban. Además, esta preparación es compatible con microscopía multifotónica y microendoscopia, ampliando así aún más la caja de herramientas de técnicas de imagen para estudiar las redes neuronales a nivel celular y subcelular en ratones que se comportan. Describimos los pasos críticos y el Troubleshooting del protocolo. También discutimos las posibles trampas y limitaciones del método.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Deckgl&auml; ser</td><td>72296-03</td><td></td></tr><tr><td>Dentadura postiza&nbsp; Resina base</td><td>ShangHai New Centery Dentel Material</td><td>N/A Tipo</td><td>I, autosolidificante</td></tr><tr><td>Cánula ficticia</td><td>RWD Life Science Co.,LTD</td><td>62102</td><td>OD 0.30mm</td></tr><tr><td>Cánula</td> guía <td>RWD Life Science Co.,LTD</td><td>62003</td><td>26G</td></tr><tr><td>Horquilla de cabeza</td><td>N/A</td><td>N/A</td> Placa de cabeza <td>hecha a medida</td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cánula</td> <td>de imagen hecha a medidaN/A</td><td>N/A</td><td>hecho a medida; OD 3 mm, ID 2,7 mm, altura 1,8 mm, cánula interna de acero inoxidable # 108</td></tr><tr><td></td><td>RWD Life Science Co., LTD</td><td>62203</td> <td>&nbsp; 0.30 * 0.14 (OD * ID, mm)</td></tr><tr><td>Kwik Sil</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>SuperBond C& B</td><td>SUN MEDICAL</td><td>N/A</td><td>SuperBond C& B kit</td></tr><tr><td>Kit Cinta de Correr</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Adhesivo</td></tr><tr><td>curado UV</td> a medida <td>NORLAND PRODUCTS</td><td>NOA 60</td><td></td></tr></tbody></table>

procedimiento de craneotomía para la visualización de las actividades neuronales en el hipocampo de comportarse ratones

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Las actividades neuronales de la proyección de imagen en la resolución unicelular en animales despiertos que se comportan es un acercamiento muy de gran alcance para la investigación de las funciones del circuito de los nervios en neurociencia de los sistemas. Sin embargo, la alta absorbancia y la dispersión de la luz en el tejido de mamíferos limitan las imágenes intravitales principalmente a las regiones cerebrales superficiales, dejando las áreas cerebrales profundas, como el hipocampo, fuera del alcance de la microscopía óptica. En este video, mostramos la preparación e implantación de la ventana de imágenes a medida para permitir la obtención de imágenes crónicas in vivo de la región del hipocampo dorsal CA1 en ratones que se comportan con la cabeza fija. La ventana hecha a medida se complementa con una cánula de infusión que permite la entrega dirigida de vectores virales y fármacos al área de imágenes. Combinando esta preparación con proyección de imagen de campo amplio, realizamos una grabación a largo plazo de la actividad neuronal usando un indicador fluorescente del calcio de subconjuntos grandes de neuronas en ratones que comportan durante varias semanas. También demostramos la aplicabilidad de esta preparación para la proyección de imagen del voltaje con la resolución del solo-punto. Los indicadores genéticamente codificados de alto rendimiento de la actividad neuronal y las cámaras CMOS científicas permitieron la visualización recurrente de detalles morfológicos subcelulares de neuronas individuales a alta resolución temporal. También discutimos las ventajas y las limitaciones potenciales del método descrito y de su compatibilidad con otras técnicas de proyección de imagen.

Proyección de imagen in vivo de la actividad neuronal usando un indicador genético codificado del calcio. En promedio, la proyección de imagen in vivo comienza 3-4 semanas después de la implantación si se alcanza un nivel suficiente de expresión del transgene. En este momento, el edema cerebral y la hemorragia generalmente se resuelven completamente, y la vasculatura cerebral se puede observar fácilmente a través de la ventana óptica. Aquí se utilizó la preparación descrita para realizar las grabaciones repetidas de la actividad neuronal en la región del hipocampo dorsal CA1 en ratones que se comportan bajo microscopio de fluorescencia de campo amplio. Para registrar la actividad neuronal, utilizamos un indicador de calcio brillante codificado genéticamente, llamado NCaMP713,que exhibe una sensibilidad al calcio y una resolución temporal similares a la de GCaMP6s14. Para expresar el indicador NCaMP7 en el hipocampo, inyectamos el virus rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 usando una cánula de infusión e iniciamos la proyección de imagen de la longitud en 14 días después de la inyección. Para registrar la actividad neuronal, utilizamos una lente de objetivo de aire 10x NA 0.3 y una cámara Hamamatsu OrcaFusion sCMOS que permitió obtener imágenes a ~ 1.5x1.5 mm FOV a una frecuencia de hasta 100 Hz. La fluorescencia verde fue excitada por un LED de 470 nm disponible en el comercio utilizando un conjunto de filtros GFP estándar. La profundidad media de imagen alcanzada en el canal verde es de unos 50-120 μm, lo que permite registrar la actividad neuronal principalmente en el estrato oriens y el estrato piramidal. La profundidad de imagen en los canales del infrarrojo cercano puede ser de hasta 200 μm alcanzando las capas más profundas del hipocampo8. El tiempo medio de grabación por VO fue de 6-12 min, aunque es posible realizar sesiones de imagen mucho más largas ya que el NCaMP7 se caracteriza por una fotoestabilidad extremadamente alta y no se observó fototoxicidad detectable(Figura 6).
<img alt="Microscopía de fluorescencia, diagrama de actividad neuronal y gráfico de señales de calcio, que muestra el análisis neuronal." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: Registro de la actividad neuronal en las neuronas del hipocampo utilizando un indicador de calcio codificado genéticamente por fluorescencia verde. (A) Un campo de estudios seleccionado fotograbado bajo un microscopio de fluorescencia de campo ancho en el canal verde. (B) Los 15 ROIs correspondientes a las neuronas individuales mostradas en A y seleccionadas utilizando la proyección de desviación estándar de todo el registro. (C) Rastros representativos de fluorescencia de un solo ensayo de las 15 neuronas seleccionadas en B. (D) Una vista representativa de zoom de 2 rastros de calcio que se muestran en los cuadros de color correspondientes que se muestran en la barra de C. Scale, 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig06large.jpg" target="_blank">esta figura.</a>
Para obtener trazas de fluorescencia, las regiones de interés (ROIs) correspondientes a los somas neuronales se segmentaron manualmente y se analizaron mediante el software ImageJ. Antes de la corrección del movimiento del análisis de imagen, los procedimientos comunes de la poste-grabación en animales despiertos no eran requeridos pues los conjuntos de datos adquiridos no exhibieron los artefactos del movimiento debido a la alta estabilidad del implante de la proyección de imagen. En la Figura 6se presenta un registro óptico representativo de un solo ensayo de las actividades neuronales del hipocampo en un ratón que se comporta despierto. Se seleccionaron manualmente 15 ROI correspondientes a somas neuronales a partir del mismo campo de trabajo que se muestra en la Figura 6B,y las trazas de fluorescencia de un solo ensayo dentro de cada ROI se muestran en la Figura 6C. La Figura 6D muestra dos partes representativas de trazas de fluorescencia de dos ROIs diferentes. Realizamos 4 sesiones consecutivas de la proyección de imagen para el mismo FOV con intervalos de 3 días. Fue posible identificar e imagen de las mismas neuronas en ciertos FOVs durante al menos dos semanas (las sesiones de imágenes más largas no se realizaron para este estudio, sin embargo, la misma preparación se ha utilizado para hasta 6 meses de estudio por imágenes en ratonespreviamente 7; Figura 7). En este estudio, se utilizó el vector AAV/DJ-CAG, que fue impulsando una fuerte expresión del gen de interés incluso 21 días después de la entrega del virus(Figura Suplementaria 1). La expresión continua complicó la identificación a largo plazo de las mismas neuronas debido al aumento del fondo de fluorescencia y la aparición de nuevas neuronas que expresan el indicador de calcio. Por lo tanto, la selección del serotipo y del promotor de AAV para conducir la expresión génica de la blanco debe ser una de las consideraciones importantes durante diseño experimental particularmente si la proyección de imagen longitudinal del mismo subconjunto de neuronas se requiere. La calidad de la proyección de imagen permitió resolver dendritas próximas así como visualizar los vasos sanguíneos.
<img alt="Gráfico de imágenes de fluorescencia de microscopía que ilustra el crecimiento celular a lo largo del tiempo, día 25-34, con marcadores." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig07v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> Figura 7:Secuencia de imágenes de cuatro FOVs diferentes del área del hipocampo rastreados durante 12 días. El animal fue implantado con la ventana el día 0 y fue inyectado con el virus rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 el día 7. Las puntas de flecha indican la neurona rastreada dentro del fov. Barras de escala: 80 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Proyección de imagen in vivo de la actividad neuronal usando un sensor genético codificado del voltaje. En este estudio, también utilizamos un nuevo sensor de voltaje codificado genéticamente, llamado SomArchon7,que permite obtener imágenes de voltaje con resolución de pico único unicelular en animales que se comportan7,8. Para expresar SomArchon, inyectamos el virus de rAAV/DJ-CAG-SomArchon usando una cánula de la infusión y realizamos proyección de imagen del voltaje en un ratón de comportamiento cabeza-fijo varios días después de la inyección. Para registrar la actividad neuronal, utilizamos una lente objetivo 40x NA 0.8 y una cámara Hamamatsu OrcaFusion sCMOS que nos permitió obtener imágenes de FOV de 150x40 μm a una velocidad de adquisición de hasta 830 Hz. La proteína GFP, que una parte de la construcción de SomArchon para facilitar la visualización de la expresión en el rango visible del espectro, se puede visualizar fácilmente en el canal verde (excitación LED a 470/20 nm, emisión 525/50 nm) para localizar células de interés para la obtención de imágenes de voltaje. Las grabaciones ópticas de voltaje se realizaron en el canal de infrarrojo cercano (excitación láser 637 nm a 3,4 W/mm2,emisión 665 nm de paso largo) con 4 x 4 binning a una velocidad de adquisición de 830 Hz. Se registró la actividad espontánea de una neurona del hipocampo en un ratón despierto con una SNR media de 7 por potencial de acción(Figura 8). 
<img alt="Imagen de microscopio con gráficos de relación señal-ruido, analizando la resolución temporal en la actividad neuronal." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig08.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> Figura 8: Registro de la actividad neuronal en las neuronas del hipocampo utilizando un indicador de voltaje codificado genéticamente por fluorescencia de infrarrojo cercano SomArchon. (A) Un campo de estudios seleccionado foto fotomente fotoda bajo microscopio de fluorescencia de campo amplio en el canal infrarrojo cercano. (B) Traza de fluorescencia de prueba única de la neurona en A. (C) Una vista representativa de zoom de la traza de voltaje en la caja correspondiente que se muestra en B. Barra de escala: 25 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig08large.jpg" target="_blank">esta figura.</a>
histología Después de que se realiza el estudio de imágenes funcionales, el análisis post mortem se utiliza para confirmar la colocación correcta del implante, el área de expresión del virus y la localización de una proteína de interés en las neuronas con imágenes. Para la verificación histológica de la expresión del virus y la colocación del implante, se examinaron las secciones coronales del cerebro fijo de PFA bajo un microscopio de fluorescencia de campo amplio(Figura 9A, C). Se utilizó un microscopio confocal para adquirir imágenes de alta resolución de neuronas individuales que expresan el indicador de calcio, así como el indicador de voltaje(Figura 9B,D). La coloración de DAPI fue utilizada para visualizar la morfología total de la rebanada del cerebro. Además, las rebanadas cerebrales se pueden evaluar mediante inmunohistoquímica para verificar la astrogliosis o gliosis causada por la implantación de ventanas y la expresión viral. Nuestros estudios previos demostraron que el procedimiento no inducía gliosis notable7.
<img alt="Microscopía de corte cerebral; configuración de ventanas ópticas; imágenes de neuronas fluorescentes; Análisis de neuroanatomía." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig09.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> Figura 9: Verificaciónhistológica de la posición de la ventana óptica y la expresión del virus. (A) Una imagen fluorescente representativa de la rebanada cerebral de la sección coronal que muestra la colocación de la ventana óptica desde un ratón que expresa NCaMP. Barra de escala: 1 mm.(B)Imagen confocal representativa de neuronas que expresan los indicadores NCaMP7. Barra de escala: 25 μm.(C)Una imagen representativa de fluorescencia de la rebanada cerebral de la sección coronal que muestra la colocación de la ventana óptica de un ratón que expresa SomArchon. Barra de escala: 1 mm.(D)Imagen confocal representativa de neuronas que expresan los indicadores de SomArchon. Barra de escala: 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria 1:Análisis cuantitativo de la intensidad relativa de fluorescencia junto con el tiempo de expresión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este artículo demuestra la preparación de una ventana de encargo de la proyección de imagen complementada con la cánula de la infusión y su implantación sobre la región CA1 del hipocampo en ratones.

Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Oye, chicos, mi nombre es Wang Yangdong, y soy del laboratorio de bioingeniería molecular Dr.Kiryl Piatkevich en la Universidad de Westlake. Hoy, voy a mostrarles el procedimiento para obtener imágenes de las actividades neuronales del hipocampo en ratones, in vivo. Encienda la máquina de soldadura y címela hasta la temperatura requerida.Ajuste la posición de la cánula de la proyección de imagen y de la cánula de la inyección usando las manos que ayudan como se muestra en la figura. Usando la jeringa con la aguja, aplique una pequeña cantidad de tipo apropiado de fundente sobre los puntos de conexión entre la imagen y la cánula de inyección durante cinco segundos, y luego retire la gotita. Monte lata de soldadura y aplíquela al punto de conexión tratado con el fundente.Evite el exceso de soldadura de lata, ya que requerirá un cráneo más grande innecesario para hacer durante la cirugía. Espere a que la lata de soldadura se enfríe. Por lo general, tarda varios segundos.Confirme que la cánula de inyección no está bloqueada insertando la cánula ficticia desde ambas direcciones. Aplique adhesivo óptico de curado UV en la parte inferior de la cánula de imágenes con un palillo de dientes o una aguja de jeringa de calibre 26. Use una pinza fina para colocar cuidadosamente un vaso de cubierta del tamaño correspondiente a la cánula de imágenes.Cure el adhesivo durante al menos una hora mediante iluminación UV de una lámpara UV de mano estándar. Anestesiar el ratón con isoflurano según el procedimiento aprobado por el IACUC. Coloque el ratón en un marco estereotáxico sobre una almohadilla de calentamiento de cirugía.Asegure la cabeza con barras para los oídos. Empuje ligeramente la cabeza en todas las direcciones para asegurarse de que la cabeza esté firmemente asegurada. Aplique ungüento para los ojos para evitar que los ojos del animal se sequen durante la cirugía.Use una recortadora o crema depilatoria para eliminar el pelaje desde la parte posterior del cuello hasta los ojos. Esterilice el sitio quirúrgico con betadina seguida de etanol al 70% tres veces antes de hacer una incisión. Retire la piel sobre la parte superior del cráneo, comenzando con el corte horizontal alrededor de la base de la cabeza, seguido de dos cortes en la dirección rostral, casi llegando a los párpados.A continuación, dos cortes oblicuos que convergen en la línea media. Con dos hisopos de algodón estériles, retraer el tejido de conexión, así como la musculatura de la parte posterior del cuello a los bordes del cráneo. Aplique una gota de solución de lidocaína en la superficie del periostio durante dos minutos para evitar un dolor excesivo.Raspe suavemente toda el área expuesta del cráneo con un bisturí para crear una superficie seca y áspera. Coloque la punta de la aguja en el Lambda para ver si la coordenada AP es cero para confirmar que la posición de la cabeza es vertical, así como si la coordenada ML es cero, para confirmar que la cabeza está posicionada horizontalmente. Si no es así, ajuste las perillas correspondientes en la estación estereotáxica hasta que las coordenadas AP y ML estén dentro de 0,1 milímetros.Mueva la punta de la aguja para encontrar los puntos correspondientes para la craneotomía y marque sus posiciones en el cráneo, utilizando un marcador fino. Dibuje un círculo basado en cuatro puntos marcados, así como el contorno del área de la cánula de inyección en el lado de la cánula del círculo. Utilice un taladro neumático a la velocidad de 10,000 rondas por minuto para perforar suavemente a lo largo del contorno marcado en el cráneo.Perfore el cráneo hasta que quede una capa muy delgada de hueso, que generalmente comienza a moverse bajo un toque suave en el centro. Aplique una gota de PBS estéril en el centro de la craneotomía. Levante el colgajo óseo del cráneo con las órceps de punta muy delgada o dos agujas de calibre 26 que se acercan desde los lados opuestos.Aplique PBS seguido de aspiraciones suaves, a través de una aguja roma de calibre 26 varias veces para limpiar la superficie de la duramadre. Aplique una succión suave para ablacionar la corteza, así como el Cuerpo Calloso por encima del hipocampo. La corteza es a menudo más amarilla que el Cuerpo Calloso.Y el Cuerpo Calloso suele ser más ancho que el hipocampo. Además, el Cuerpo Calloso es realmente fácil de distinguir por las fibras neuronales que van en las direcciones vertical y horizontal cuando se observa desde la parte superior. El sangrado en este punto afectará la visibilidad del tejido cerebral en la craneotomía.Aplique PBS, seguido de una succión suave, mientras aspira la corteza para deshacerse de la sangre, Corpus Callosum se puede reconocer por la dirección de las fibras blancas como se muestra esquemáticamente en el diagrama. Retire las fibras de Cuerpo Calloso capa por capa aplicando una succión suave en un movimiento circular. Pbs se aplica constantemente para deshacerse de la acumulación de sangre por encima del tejido cerebral expuesto.Inserte suavemente el implante en la craneotomía. Presione firmemente la parte superior del implante con la aguja en forma de L para colocar la ventana óptica del implante lo más cerca posible de la superficie expuesta del hipocampo. Aplique repetidamente PBS en la cicatriz alrededor del implante, seguido de succión para extraer la sangre tanto como sea posible durante la inserción del implante.Aplique una capa delgada de sello rápido entre el implante y el cráneo para evitar que el cemento dental penetre debajo del cráneo. Una vez que el sello rápido se cura, aplique super enlace uniformemente en la superficie del cráneo, la superficie del sello rápido y la superficie del implante. Una vez que el súper enlace se cura, aplique la resina de base de la dentadura por encima del súper enlace, así como la piel alrededor de la incisión realizada al comienzo de la cirugía.Después de que la resina de la base de la dentadura se cure, coloque la placa de la cabeza en la resina alrededor del implante y haga que se concentre con la cánula de la proyección de imagen. Aplique más resina de base de dentadura alrededor y por encima de la placa de la cabeza para fijar su posición. Deja que se cure durante varios minutos.Evite construir una gruesa capa de cemento alrededor de la cánula para garantizar un mejor acceso a la ventana de imágenes es la lente objetivo. Diluya la resina de base de la dentadura para disminuir su viscosidad, lo que le permite llenar las cavidades que son difíciles de alcanzar con un aplicador. Coloque suavemente una cinta de goma aislada sobre la ventana para protegerla de una posible contaminación de las bandas de animales.Agregue la solución de culata de colorante Fast Green a la solución de virus diluirla al título deseado en la proporción de uno a nueve, en un tubo de PCR. Retire 600 nano litros de la solución del virus, retire la cánula ficticia e inserte la cánula interna conéctelo a la jeringa de inyección en la cánula guía. Infundir el virus a la velocidad de 15 nano litros por minuto, durante 10 minutos en total.Mantenga la cánula interna conectada durante 10 minutos para permitir que el virus se propague debajo de la ventana. Retire suavemente la cánula interna de la cánula guía y recapitulala con la cánula ficticia. Induzca el ratón con isoflurano al 4% durante unos minutos.Fije su placa de la cabeza a la horquilla de la cabeza, y luego fije la horquilla de la cabeza a la cinta de correr. Utilice una lente de objetivo de bajo aumento para encontrar la mejor vista de filtro para obtener imágenes funcionales. Luego, cambie a una lente objetivo más alta para registrar las actividades neuronales a resolución unicelular.Para las imágenes de calcio, el fluorescente verde fue excitado por un LED de 470 nanómetros disponible en el mercado utilizando un sentido de filtro GFP estándar. Para obtener trazas fluorescentes, las regiones de interés, correspondientes a la masa celular neuronal se segmentaron manualmente y se analizaron mediante el software ImageJ. Para la proyección de imagen del voltaje usando una lente 40 X las grabaciones ópticas del voltaje fueron realizadas en el canal infrarrojo cercano en las tarifas de adquisición de 830 Hertz.La grabación neuronal espontánea de la actividad duró continuamente hasta 25.000 fotogramas. Aquí, se describe un método para la proyección de imagen a largo plazo del hipocampo como una región A1 en ratones que se comportan. El método se basa en la implantación crónica.Ahora la ventana de imágenes a medida, que también permite la administración dirigida de virus o fármacos directamente a las neuronas de interés. Creemos que el protocolo descrito facilitará los estudios que tienen como objetivo investigar la actividad neuronal con alta resolución temporal espacial en el hipocampo de ratones que se comportan utilizando simples y asequibles 1-fotón configuración de imágenes.

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Investigación

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Neurociencia

Este video y el protocolo de demostrar cómo la implantación de una cubierta de cristal ventana craneal en los roedores. Estas preparaciones se pueden utilizar para la crónica en vivo de dos fotones de imágenes de la corteza cerebral en escalas de tiempo de meses. También puede ser utilizado para otros tipos de imágenes, incluyendo imágenes ópticas señal intrínseca.

Un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas

Hemos desarrollado un hipocampo desplegada in vitro que conserva CA1-CA3 variedad de neuronas. En combinación con la matriz de micro-electrodo de penetración, la actividad neural puede ser monitoreado en ambas las orientaciones longitudinales y transversales. Este método proporciona ventajas sobre las preparaciones de cortes de hipocampo como la propagación en todo el hipocampo se pueden grabar simultáneamente.

Actividad neural propagación en una preparación del hipocampo Desplegado con un penetrante Micro-electrodo de matriz

Este protocolo presenta un método para crear una gran craneotomía unilateral sobre las regiones temporal y parietal de la corteza cerebral de ratón. Esto es especialmente útil para la formación de imágenes en tiempo real sobre un área expansiva de un hemisferio cortical.

Un procedimiento de craneotomía lateral grande para el campo amplio de mesoescala imágenes ópticas de la actividad cerebral

Mientras que las imágenes multifotónicas solo son efectivas a profundidades limitadas de la superficie del tejido, es posible lograr imágenes con una resolución de 3 μm a cualquier profundidad a través de pCLE. Aquí, presentamos un protocolo para realizar imágenes de pCLE para medir la dinámica microvascular en el hipocampo de ratones ictales y salvajes.

Endomicroscopía preclínica de barrido láser confocal acoplada a fibras (pCLE) in vivo de capilares del hipocampo en ratones despiertos

Este protocolo describe la grabación de potenciales de campo local con caña múltiples sondas de silicona lineal. La conversión de las señales mediante análisis de densidad de fuente actual permite la reconstrucción de la actividad eléctrica local en el hipocampo del ratón. Con esta técnica, se pueden estudiar las oscilaciones del cerebro espacialmente restringida libremente mover ratones.

Grabación espacial restringido a oscilaciones en el hipocampo de ratones de comportarse

Este método describe una preparación crónica que permite el acceso óptico al hipocampo de ratones vivos. Esta preparación se puede utilizar para realizar imágenes ópticas longitudinales de plasticidad estructural neuronal y plasticidad celular evocada por la actividad durante un período de varias semanas.

Imágenes longitudinales de dos fotones del hipocampo dorsal CA1 en ratones vivos

Utilizamos electrodos de grabación y estimulación en rodajas longitudinales del cerebro del hipocampo y electrodos de registro y estimulación posicionados longitudinalmente en el hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciales postsinápticos extracelulares y demostrar plasticidad sináptica a largo plazo a lo largo del interlamellar longitudinal CA1.

Investigación de la plasticidad sináptica a largo plazo en Interlamellar Hippocampus CA1 por grabación de campo electrofisiológica

El protocolo actual demuestra un método simple para el rastreo de las proyecciones de glutamato del área tegmental ventral (VTA) al hipocampo. La fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA se combinó con el registro de CA1 para demostrar cómo los terminales de glutamato VTA modulan la tasa de disparo piramidal putativa CA1 in vivo.

Trazado anatómico y funcional combinado in vivo de terminales de glutamato del área tegmental ventral en el hipocampo

Presentamos un protocolo para preparar rodajas agudas del hipocampo dorsal-intermedio de ratones. Comparamos esta preparación transversal con el corte coronal en términos de calidad de las grabaciones y preservación de las características morfológicas de las neuronas grabadas.

Preparación de rodajas agudas del hipocampo dorsal para la grabación de células enteras y la reconstrucción neuronal en el dentate gyrus de ratones adultos

Este artículo describe un método para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el hipocampo de ratón CA1 utilizando cirugía controlada con precisión y microscopía de dos fotones.

In vivo Imágenes crónicas de dos fotones de microglia en el hipocampo del ratón

Aquí, presentamos dos protocolos para el registro de microelectrocorticografía de alta densidad (μEcoG) en ratas y ratones, incluidos los métodos quirúrgicos, de implantación y de registro. Los registros de μECoG se realizan en combinación con el registro de politrodos laminares en la corteza auditiva de la rata o con la manipulación optogenética de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial del ratón.

Investigaciones multiescala del procesamiento cortical mediante la integración de politrodos laminares y optogenética con microelectrocorticografía en roedores

Aprende a realizar craneotomía para visualizar actividades neuronales en el hipocampo de ratones despiertos. Este protocolo permite imagen crónica in vivo con alta resolución espacial y temporal usando ventanas ópticas personalizadas.

Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones

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