Activación 3D de todo el cerebro y mapeo de conectividad funcional en ratones utilizando imágenes de ultrasonido funcional transcraneal

La ecografía funcional es una nueva modalidad de neuroimagen que permite mapear el volumen sanguíneo cerebral en el cerebro de roedores vivos. Usando imágenes de ondas planas ultrarrápidas, podemos medir las respuestas hemodinámicas de todo el cerebro con una resolución y sensibilidad temporal especiales inigualables. Este protocolo explica cómo realizar imágenes de ultrasonido funcional transcraneal en ratones, tanto para experimentos con animales anestesiados como despiertos.

En comparación con otras técnicas de imagen funcional de todo el cerebro, como la RMF, el ultrasonido funcional proporciona una alta portabilidad, facilidad de uso y permite experimentos en sujetos despiertos y que se mueven libremente, evitando el sesgo de anestesia y permitiendo estudios de comportamiento. Hasta hace poco, las imágenes FUS solo se utilizaba en colaboración con expertos en ultrasonido. Ahora, esta tecnología está disponible para la amplia comunidad de neurociencias, gracias a los escáneres disponibles comercialmente y el software dedicado para imágenes cerebrales preclínicas, lo que hace que FUS sea bastante fácil de usar sin ningún fondo en ultrasonido.

Para una sesión de imágenes anestesiadas, aplique ungüento para los ojos del ratón para evitar cualquier daño corneal y afeite la cabeza del ratón con un temblor. Aplique un poco de crema depilatoria y enjuague después de un par de minutos. Repita esto hasta que el vello se elimine por completo.

Inserte alfileres subcutáneos en las extremidades para el registro del electrocardiograma y coloque gel de ultrasonido centrifugado en la cabeza. Para los experimentos con ratones despiertos, se requiere una cirugía preliminar para la fijación de la cabeza. Coloque el ratón anestesiado y un marco estereotáctico sobre una almohadilla térmica de 37 grados centígrados.

Aplique gel protector para los ojos y administre lidocaína por vía subcutánea debajo del cuero cabelludo con una aguja calibre 26, luego espere unos minutos. Haga una incisión después de la sutura sagital desde detrás del hueso occipital hasta el comienzo del hueso nasal, luego use tijeras quirúrgicas para extirpar la piel sobre ambos hemisferios. Limpie el cráneo con una solución de yodo al uno por ciento y retire el periostio restante.

Usando la placa de la cabeza como plantilla, marque dos orificios en el cráneo para colocar los tornillos de anclaje. Coloque la placa de la cabeza con los tornillos y use cemento dental para fijar los tornillos y la placa de la cabeza en la parte delantera y posterior del marco para mantener un buen agarre del implante. Retire al animal del marco estereotáctico después de que el cemento esté seco y revierta la anestesia mediante inyección subcutánea de un miligramo por kilogramo de atipamezole.

Administrar meloxicam profiláctico para el dolor postoperatorio. Coloque una tapa magnética impresa en 3D sobre la placa de la cabeza para protegerse y permita que el mouse se recupere durante cuatro a seis días antes del comienzo de la habituación a la jaula de la casa móvil. Coloque al animal en una jaula de recuperación en una almohadilla térmica durante unas horas, luego devuelva el ratón a su jaula de origen con compañeros de camada.

En los días cuatro y cinco después de la recuperación, sujete repetidamente el mouse a la jaula de la casa móvil y aumente gradualmente el tiempo fijo de la cabeza, a partir de cinco minutos y hasta 30 minutos. Aplique un poco de solución salina y gel de ultrasonido en la ventana de imágenes para habituar al ratón. Repita este proceso en el sexto día después de la recuperación.

Inicie el software y cree una sesión de experimento. Vaya al menú Mover sonda para ajustar la posición de la sonda de ultrasonido usando el teclado de navegación. Inicie la adquisición de vista en vivo y ajuste la posición de la sonda si es necesario a través de imágenes en tiempo real del volumen de sangre cerebral del animal, o CBV.

Alinee el cerebro en el centro de la imagen y, a continuación, optimice los parámetros de imagen para capturar la mayor relación señal/ruido. Abra la opción Angio 3D del software de adquisición. En el panel preestablecido, ajuste los parámetros de escaneo de la primera rebanada, la última rebanada y el tamaño del paso para escanear todo el cerebro y comenzar la adquisición.

Deje el software de adquisición abierto e inicie el software para el análisis y la visualización de datos, luego cargue el escaneo Angio 3D. Navegue por el volumen de adquisición utilizando el panel de tres vistas y seleccione la dirección de escaneo coronal, anteroposterior o postural anterior. Vaya al panel de registro cerebral y cargue la plantilla de referencia del mouse para el proceso de registro.

Registre el escaneo en Allen Mouse Common Coordinates Framework utilizando los modos de registro totalmente automático o manual. Compruebe el resultado observando la superposición del escaneo Angio 3D y la plantilla de referencia, o mirando la superposición del escaneo y el Atlas de referencia de Allen utilizando el panel administrador de Atlas. Guarde el registro como un archivo BPS.

En el software del estudio ICO, asegúrese de que la exploración angiográfica y su archivo BPS estén cargados. Vaya al panel de navegación cerebral. En el panel Atlas Manager, navegue por el ratón Allen Brain Atlas con el navegador de árbol padre hijo.

Busque las regiones anatómicas específicas y selecciónelas para superponerlas al escaneo en las tres vistas. Visualice las regiones objetivo en el panel de tres vistas y elija un plano de imagen que se superponga a las regiones objetivo para el experimento estableciendo manualmente dos marcadores en la posición coronal que incluye la región de interés. Haga clic en Sistema de posicionamiento cerebral, o BPS, para extraer las coordenadas motoras resultantes que corresponden a la posición de la sonda para obtener una imagen del plano objetivo.

Verifique la vista previa de la imagen que se calcula a partir de la angio exploración. En el software de escaneo ICO, ingrese al panel de posicionamiento de la sonda y haga clic en ingresar coordenadas BPS, luego aplique las coordenadas extraídas, haciendo que la sonda se mueva y se alinee en el plano de imagen objetivo. Realice una adquisición de vista en vivo y compruebe que el plano de imagen actual corresponde a la predicción.

Predefina la secuencia de estimulación, incluido el tiempo de estimulación, el tiempo de estimulación del interés y el número de repeticiones. Ejecute una secuencia FUS 3D definiendo el tiempo total de adquisición, el número de posiciones y el tiempo muerto entre posiciones. Para la estimulación automática sincronizada con el sistema de adquisición a través de la entrada TTL, seleccione la opción trig in antes de iniciar la adquisición.

Abra la adquisición en el software ICO studio e ingrese al menú del mapa de activación, luego complete el campo del patrón de activación con una hora de inicio y finalización y calcule el mapa de activación. Ajuste los parámetros de visualización para la visualización y exporte el mapa de activación como un archivo H5 para el análisis sin conexión. Ejecute una secuencia FUS 3D definiendo el tiempo total de adquisición, el número de posiciones del plano de imagen y el tiempo muerto entre posiciones.

Guarde la adquisición y cárgándola en el software de estudio ICO. Si es necesario, cargue el archivo BPS y el marco de coordinación de Allen Mouse Brain. En el Administrador del Atlas, seleccione las regiones del Atlas como regiones de interés.

Ingrese al menú de conductividad funcional y seleccione las regiones deseadas y el administrador de ROI. Visualice los resultados como matriz de conectividad o mapa de correlación basado en semillas, luego seleccione y ajuste los filtros de ancho de banda como desee y exporte los resultados de correlación para el análisis estadístico. Este protocolo se utilizó para la cuantificación 3D de las variaciones hemodinámicas cerebrales transcranialmente en el cerebro del ratón.

La estimulación del bigote fue seleccionada como un ejemplo de estimulación sensorial de la respuesta evocada. La activación significativa se determinó con una resolución de un modelo lineal general, o GLM, utilizando la función de respuesta hemodinámica predeterminada del ratón. El tiempo total de prueba fue de 760 segundos, con una línea de base de 60 segundos, una estimulación de 80 segundos y un tiempo de recuperación de 60 segundos repetido cinco veces.

Usando un curso de tiempo sabio de vóxel de la corteza somatosensorial primaria contralateral, la región del campo de barril, o S1BF, reveló un aumento del 15 al 20% del CBV en comparación con la línea de base. El mismo paradigma se aplicó en un ratón de comportamiento fijo de cabeza en la jaula de la casa móvil utilizando el preset despierto de ICO scan. El mapa de activación después de un experimento de estimulación de bigotes múltiples se muestra aquí.

La activación significativa se determinó con la resolución de un GLM utilizando una función de respuesta hemodinámica predeterminada del ratón. Las correlaciones temporales han normalizado las fluctuaciones espontáneas de cbV de baja frecuencia entre las regiones cerebrales 3D en un ratón anestesiado con ketamina xilazina se muestran aquí. El análisis basado en semillas y el hipocampo dorsal revelaron la conductividad interhemisférica significativa entre el hipocampo derecho e izquierdo, así como regiones retro del hipocampo más profundas y cortesías piriformes.

Una región de semilla seleccionada en el S1BF también dio como resultado un patrón de correlación simétrica. El punto crítico para experimentos exitosos es la preparación animal, en particular el nivel de anestesia para experimentos con animales anestesiados y la protección de un cráneo en experimentos en animales despiertos. Si US nos permitió estudiar funciones cerebrales importantes en animales despiertos que se ocupan de cuestiones fundamentales sobre el sueño, el aprendizaje o el comportamiento, pero también la modulación farmacológica de la conectividad funcional para el descubrimiento de fármacos.