Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

La actina es el componente principal del citoesqueleto y regula críticamente varios aspectos de la morfología y fisiología celulares, incluso en las neuronas. La actina se produce en equilibrio entre sus dos formas, G-actina globular monomérica o F-actina filamentosa polimérica. El estado de polimerización de la actina está rigurosamente regulado a múltiples niveles tanto por proteínas de unión a actina, como por su propia regulación post-traslacional.

En los contactos sinápticos interneuronales, las alteraciones dinámicas en los niveles de F-actina son un evento regulador clave, controlando la señalización y la plasticidad tanto en terminales sinápticos pre como post. No es sorprendente que la disfunción de la actina esté relacionada con varios estados neuropatológicos. Los avances recientes han llevado a una gran cantidad de conocimientos de actina en fisiología neuronal y fisiopatología.

Sin embargo, todavía se desconoce mucho y hay que centrarse en ello. En este sentido, los análogos fluorescentes de faloidina han demostrado ser una herramienta importante en la investigación de actina. Esta falotoxina se une específicamente a la actina filamentar, y por lo tanto se puede utilizar como una medida directa de las cantidades de F-actina, y su alteración en los estados fisiopatológicos.

Este estudio presenta un ensayo fluorométrico rápido y eficiente para la evaluación del estado de polimerización de actina en muestras biológicas ex vivo, como homogenados al por mayor y terminales sinápticos aislados bioquímicamente de tejidos cerebrales. Cabe destacar que el ensayo se puede aplicar a otros tipos de células y tejidos y a su fenómeno fisiológico asociado. Para las recetas de los tampones utilizados en este estudio, por favor refiérase al texto detallado.

Las muestras de tejido cerebral de ratas o sujetos humanos se homogeneizaron en un tubo de vidrio Potter-Elvehjem y pestle en el hielo en 10 volúmenes de tampón de homogeneización. Para la preparación del synaptosome, el homogenado fue hecho girar primero en una velocidad lenta y entonces en una velocidad más alta para obtener la fracción mitocondrial synaptosomal cruda. Los synaptosomes enriquecidos de esta fracción cruda fueron obtenidos siguiendo un gradiente discontinuo de la sacarosa.

Para la preparación synaptoneurosomal, los homogenados fueron pasados secuencialmente a través de dos 100 micrones y un filtro de 5 micras. La estimación de la proteína fue realizada usando el reactivo de Bradford y las muestras fueron diluidas en almacenador intermediario de Krebs en una concentración de dos a tres miligramos por la proteína del mL en un volumen final de 50 microlitros. El estímulo de terminales sinápticos aislados, synaptosomes o synaptoneurosomes, fue realizado por un breve aumento de 30 segundos en potasio extracelular en 37 grados.

Para ello, se añadió un cloruro molar de potasio a las muestras a una concentración final de 15 milimolares. Los homogenados son fragmentos sinápticos no estimulados y despolarizados se fijaron con glutaraldehído al 2,5%, mediante la adición del volumen requerido de solución común de glutaraldehído al 25%. Las muestras se incubaron durante dos, tres minutos a temperatura ambiente.

El fijador fue quitado por la centrifugación en 20.000 G por cinco minutos. A continuación, se procedió a la permeabilización por reuspensión en tampón Krebs que contenía 0,1%Triton X-100 y 1 mg por mL de borohidruro sódico durante dos a tres minutos a temperatura ambiente. El tampón de permeabilización se eliminó nuevamente por centrifugación y el pellet se lavó superficialmente con tampón Krebs y se resuspendó en tampón Krebs que contenía 1X Alexa Fluor 647 faloidina, correspondiente a 500 micro unidades de faloidina.

Se permitió que la unión procediera durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Exceso de faloidina no enlazada se eliminó de las muestras por centrifugación a 20,000 G durante cinco minutos, y las pastillas se lavaron superficialmente con tampón de Krebs, y se resuspendieron de nuevo en el tampón de Krebs que contenía 0,32 molaresas para mantener la flotabilidad de sinaptosomas o sinaptoneurosomas. Las muestras fluorescentes encuadernadas del phalloidin fueron dispensadas en una placa negra de 96 pozos para la lectura fluorométrica en un lector de la placa.

Las longitudes de onda de excitación y emisión se fijaron en 645 nanómetros y 670 nanómetros respectivamente. Para cada conjunto de experimentos incluimos diferentes cantidades de alexa fluor 647 faloidina en el tampón Krebs que contiene 0,32 molaresa. Para tener en cuenta cualquier pérdida de muestras durante los pasos de lavado, las muestras se transfirieron del negro a la placa transparente de 96 pozos.

La captura de las muestras se examinó a 440 nanómetros. La retención de faloidina fluorescente es directamente proporcional a la cantidad de filamentos de actina o niveles de F-actina en las muestras. La linearidad del atascamiento del phalloidin fue observada en la gama de 50 a 200 proteínas del microgramo.

Como prueba de principio, también probamos la eficacia de nuestro ensayo en modelos para la despolimerización de F-actina utilizando la interrupción farmacológica de los filamentos de actina por latrunculina A, así como la estimulación de la formación de F-actina por KCl mediada por la estimulación de terminales sinápticos aislados. La emisión de fluorescencia de faloidina unida se puede expresar como cualquiera de las unidades de faloidina unida generada a partir de la curva lineal estándar y son relativas a las muestras de control. Para la Figura 4, los niveles de F-actina se expresan como micro unidades de faloidina unida.

Por otro lado, para la Figura 5 los niveles de F-actina en los fragmentos sinápticos despolarizados se expresan en relación con el control de muestras no despolarizadas. Se describe un ensayo robusto, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento para el análisis de filamentos de actina, o F-actina, y sus alteraciones en los estados fisiológicos y fisiopatológicos adecuados para un formato de placa de 96 pozos. El ensayo es mucho más rápido que los protocolos alternativos existentes y puede servir como una herramienta esencial en estudios relacionados con la actina, ya sea solo o en combinación con ensayos existentes basados en inmunohistoquímica y western blotting.