Name: Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Aprende a evaluar el estado de polimerización de actina en tejidos cerebrales de roedores y humanos mediante un ensayo fluorométrico eficiente con faloidina marcada. Este método cuantitativo permite analizar dinámicas de F-actina en muestras ex vivo.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Neurológica de Nueva Zelanda (1835-PG), el Consejo de Investigación de Salud de Nueva Zelanda (#16-597) y el Departamento de Anatomía de la Universidad de Otago, Nueva Zelanda. Estamos en deuda con el Banco de Tejidos Neurológicos del Biobanco HCB-IDIBAPS (España) para tejidos cerebrales humanos. Agradecemos a Jiaxian Zhang por su ayuda en la grabación y edición del video.

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de conformidad con las normas del Comité de Ética en el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Otago (Protocolo de Ética No. AUP95/18 y AUP80/17) y legislatura de Nueva Zelanda. Los tejidos cerebrales humanos se obtuvieron del Banco de Tejidos Neurológicos del Biobanco del Hospital Clínic-IDIBAPS de Barcelona, España. Todos los protocolos de recolección de tejidos fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Clínic de Barcelona y se obtuvo el consentimiento informado de las familias.
1. Preparación de tampones y reactivos
<ol><li>Prepare los siguientes tampones para la homogeneización del tejido cerebral y la preparación de la fracción enriquecida de terminales sinápticos: Tampón de homogeneización: 5 mM HEPES, pH 7,4 suplementados con sacarosa de 0,32 M Tampón de resuspensión: 5 mM Tris, pH 7,4 suplementados con sacarosa de 0,32 M Tampón de lavado: 5 mM Tris, pH 8.1 Sacarosa de 1,2 M sacarosa de 1,0 M sacarosa de 0,85 M</li>
	<li>Agregue una mezcla casera o comercial de inhibidores de la proteasa y la fosfatasa. NOTA: Hemos utilizado la versión EDTA-libre de la mezcla completa del inhibidor de proteasa (1 tableta por el almacenador intermediario de 10 mL) y del cóctel iv del inhibidor de la fosfatasa (1:100; volumen: volumen).</li>
	<li>Prepare los siguientes tampones y reactivos para la fijación, permeabilización y unión de faloidina: Tampón Krebs: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0,1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10 mM glucosa, 20 mM HEPES, pH 7,4 KCl de 1 M 25% glutaraldehído (solución común) Tampón Krebs que contiene 0,1 % Tritón X-100 y 1 mg/mL naBH4 400x Alexa Fluor 647 Faloidina en DMSO Tampón Krebs que contiene sacarosa de 0,32 M Latrunculina A de 50 μM en DMSO (solución común) 1 M KCl (solución común) PRECAUCIÓN: La faloidina es tóxica (LD50 = 2 mg/kg) y debe manipularse con cuidado. La inhalación de glutaraldehído es tóxica y debe manipularse en una campana extractora de humos.</li>
	<li>Almacene los tampones a 4 °C y la faloidina y latrunculina A a -20 °C para su almacenamiento a largo plazo. Nota : no se recomienda el almacenamiento a largo plazo de búferes. El protocolo se puede pausar aquí.</li>
</ol>2. Homogeneización del tejido cerebral
<ol><li>Homogeneizar el tejido cerebral de rata criopreservado o recién diseccionado en 10 volúmenes de tampón de homogeneización en un tubo de vidrioPotter-Elvehjem y pestle en el hielo. NOTA: La homogeneización óptima se logra mediante 15-20 golpes del pestle a mano para los tejidos cerebrales. La homogeneización exitosa se puede confirmar por el flujo suave de la suspensión a través del tubo de vidrio. El protocolo se puede pausar aquí.</li>
	<li>Determinar la concentración de proteínas en el homogeneato utilizando un ensayo de Bradford31. NOTA: También se pueden utilizar ensayos alternativos caseros o comerciales para la estimación de proteínas.</li>
	<li>Diluir muestras de homogeneato en tampón Krebs a una concentración de 2-3 mg de proteína/mL en un volumen de 50 μL. NOTA: En algunos de nuestros experimentos, incubamos homogeneados con 2 μM de latrunculina A o DMSO (controles) a 37 °C durante 1 h. Para ello, los homogenados se resuspensan en 48 μL de tampón krebs, y se añaden 2 μL de latrunculina A de 50 μM o 2 μL de DMSO. Además para el inmunoblotting, se recoge una pequeña cantidad de muestra (10 μg) después de la incubación.</li>
	<li>Fijar las muestras de homogeneato (sección 5).</li>
</ol>3. Preparación de terminales nerviosas aisladas
<ol><li>Preparación de synaptosomes NOTA: También se pueden utilizar protocolos alternativos32,33 para sinaptosomas.<ol>
<li>Centrífuga cerebro homogeneado a 1.200 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Deseche el pellet, que es la fracción nuclear cruda.</li>
		<li>Centrífuga adicional el sobrenadante (S1) obtenido en el paso 3.1.1 a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Retire el sobrenadante (S2), que es la fracción citosólica soluble.</li>
		<li>Resuspend el pellet (P2) obtenido en el paso 3.1.3, que es la fracción sinaptosomal cruda en tampón de resuspensión. NOTA: El volumen de tampón de resuspensión depende de la cantidad de tejido inicial y la cantidad de pellet obtenido. Por ejemplo, al comenzar con 150-300 mg de tejidos cerebrales, el pellet obtenido se puede resuspended en 200 μL de tampón de resuspensión.</li>
		<li>Cargue los sinaptosomas crudos resuspended sobre un gradiente discontinuo de sacarosa hecho de volúmenes iguales de 0.85-1.0-1.2 M sacarosa. NOTA: Normalmente usamos 1 mL cada una de la solución de sacarosa (para tejido de 150-300 mg). Esto se puede cambiar según cantidades más grandes del tejido. Los gradientes discontinuos se pueden hacer usando una jeringa 25G presionada contra la pared interna del tubo ultracentrífuga y capas suaves de las capas de sacarosa.</li>
		<li>Centrífuga a 85.000 x g durante 2 h a 4 °C. NOTA: Debido a la alta velocidad de centrifugación, se requiere una ultracentrífuga capaz de crear un vacío para reducir el calentamiento.</li>
		<li>Recoger la fracción sinaptosomal en la interfaz entre 1,0 y 1,2 M de sacarosa utilizando una punta de pipeta de 200 μL.</li>
		<li>Lave la fracción sinaptosomal con tampón de lavado helado por centrifugación a 18.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. NOTA: Para el lavado, la fracción sinaptosomal obtenida en la interfase de sacarosa de 1,0 y 1,2 M se recoge en un tubo fresco de 1,5 mL, y se añade un volumen igual de tampón de lavado, asegurando la eliminación de la sacarosa alta del medio.</li>
		<li>Lavar de nuevo el pellet sinaptosomal con tampón de homogeneización helada a 12.000 g durante 10 minutos a 4 °C.</li>
		<li>Resuspend los sinaptosomas en tampón de homogeneización sobre hielo. Nota : el protocolo puede pausarse brevemente aquí.</li>
		<li>Determine la concentración de proteínas mediante un ensayo de Bradford.</li>
		<li>Resuspend los sinaptosomas en el tampón de Krebs a una concentración de 2-3 mg de proteína/mL en un volumen de 50 μL (47,5 μL si los sinaptosomas deben ser despolarizados por KCl; ver sección 4). NOTA: Para la resuspensión, la fracción sinaptosomal se gira primero a 12.000 x g durante 5 min a 4 °C y se elimina el sobrenadante (tampón). El pellet sinaptosomal se resuspende en el tampón Krebs mediante un pipeteo suave utilizando una punta de pipeta de 200 μL.</li>
		<li>Proceder con la despolarización (sección 4).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de synaptoneurosomes NOTA: También se pueden utilizar protocolos alternativos34,35 para sinaptoneurosomas.<ol>
<li>Pase el homogeneato cerebral a través de un filtro neto pre-humedeado de tamaño de poro de 100 μm en un portafiltros usando una jeringa de 1 mL. NOTA: La pre-humectación de todos los filtros es importante para evitar la pérdida de la muestra y debe hacerse utilizando un tampón de homogeneización. Para esto, el tampón de homogeneización se pasa a través de los filtros en el portafiltros utilizando una jeringa de 1 ml hasta que el tampón fluya hacia fuera.</li>
		<li>Recoja el filtrado (F1) en un tubo de 1,5 mL pre-refrigerado sobre hielo.</li>
		<li>Repetir el proceso (pasos 3.2.1 y 3.2.2) para la fracción F1 para obtener el segundo filtrado (F2).</li>
		<li>Pase el filtrado F2 a través de un filtro neto de 5 μm de tamaño de poro.</li>
		<li>Recoger el filtrado (F3) en un tubo pre-refrigerado de 1,5 mL sobre hielo.</li>
		<li>Filtrado de centrífuga F3 a 1.500 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Resuspend el pellet (sinaptoneurosomas) en tampón krebs sobre hielo a una concentración de 2-3 mg de proteína/mL en un volumen de 50 μL (47,5 μL si los sinaptosomas van a ser despolarizados por KCl; ver sección 4). Nota : el protocolo puede pausarse brevemente aquí.</li>
		<li>Estime la concentración de proteínas utilizando un ensayo de Bradford.</li>
		<li>Proceder con la despolarización (sección 4).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Despolarización mediada por KCl de terminales sinápticos aislados
<ol><li>Equilibrar sinaptosomas/sinaptoneurosomas a 37 °C durante 5-10 min.</li>
	<li>Estimular los sinaptosomas/sinaptoneurosomas añadiendo KCl para aumentarK+ extracelular a 50 mM durante 30 s a 37 °C y añadir el mismo volumen de tampón Krebs al respectivo conjunto de control no estimulado. NOTA: Por ejemplo, añadir 2,5 μL de 1 M KCl a los sinaptosomas resuspended en 47,5 μL de tampón Krebs; y añadir 2,5 μL de tampón Krebs al respectivo sinastosoma de control no estimulado. Para experimentos en los que un gran número de muestras están involucradas, proceda con no más de 2 muestras a la vez para que el tiempo de despolarización no exceda de 30 s.</li>
	<li>Termine la estimulación agregando glutaraldehído (sección 5).</li>
</ol>5. Fijación y tinción de faloidina de muestras
<ol><li>Añadir glutaraldehído a muestras homogenadas/sinaptosomales/sinaptoneurosomales a una concentración final de 2,5% durante 2-3 min a temperatura ambiente. NOTA: Añadimos 6 μL de solución de glutaraldehído al 25% para que la concentración final de glutaraldehído en las muestras de 50 μL (homogenados/sinaptosomas/sinaptoneurosomas) fuera de aprox. 2,5%. La fijación es crítica y debe ser rápida y por lo tanto inmediatamente después de agregar glutaraldehído, la muestra debe ser vigorosamente vórtice.</li>
	<li>Sedimentar las muestras a 20.000 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante. NOTA: Deseche el sobrenadante en una campana extractora de humos ya que el glutaraldehído es tóxico.</li>
	<li>Permeabilizar el pellet por resuspensión en 100 μL de tampón Krebs que contiene 0,1% Tritón X-100 y 1 mg/mL de NaHB4 durante 2-3 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sedimentar las muestras a 20.000 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el tampón de permeabilización.</li>
	<li>Lavar el pellet con 200 μL de tampón Krebs por centrifugación a 20.000 x g durante 5 min.</li>
	<li>Resuspend y manche el pellet con 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (correspondiente a 500 μU) en 100 μL de tampón Krebs durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. NOTA: Otras variedades de análogos fluorescentes de faloidina están disponibles comercialmente y se pueden reemplazar para el ensayo. La concentración de faloidina y el volumen total de la muestra de incubación pueden tener que modificarse de acuerdo con la cantidad y el tipo de tejido/muestra que se está probando y las condiciones óptimas deben estandarizarse en consecuencia.</li>
	<li>Centrifugar las muestras teñidas a 20.000 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire la faloidina sin enlazar (sobrenadante).</li>
	<li>Lavar la muestra con 200 μL de tampón Krebs por centrifugación a 20.000 x g durante 5 min.</li>
	<li>Resuspend en 200 μL de tampón Krebs que contiene sacarosa de 0,32 M. Nota : el protocolo puede pausarse brevemente aquí.</li>
</ol>6. Análisis fluorométrico y dispersión de luz
<ol><li>Dispense las muestras teñidas de faloidina Alexa Fluor 647 en una placa negra de 96 pozos.</li>
	<li>Mida la intensidad de fluorescencia a una longitud de onda de excitación de 645 nm y una longitud de onda de emisión de 670 nm en un lector de placas a temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfiera las muestras de la placa negra de 96 pozos a la placa transparente de 96 pozos utilizando puntas de pipeta de 200 μL.</li>
	<li>Mida la dispersión de luz a 540 nm para corregir cualquier pérdida que pueda haber ocurrido durante los pasos anteriores de fijación, permeabilización y tinción. NOTA: Las variaciones en el material biológico retenido en las muestras teñidas podrían ser más prominentes para cantidades más pequeñas de material de partida (ver Discusión).</li>
	<li>Incluya un conjunto de Alexa Fluor 647 Phalloidin en el tampón Krebs a diferentes concentraciones (0.05x, 0.1x, 0.25x, 0.35x, 0.75x, 0.5x y 1x correspondientes a 25, 50, 125, 175, 250, 375 y 500 μU) para cada lote del ensayo como una curva estándar. NOTA: Este es un paso opcional y no afecta a los resultados del ensayo, especialmente cuando los niveles de F-actina se expresan de manera relativa (Sección 7). El protocolo se puede pausar aquí.</li>
</ol>7. Análisis de datos
<ol><li>La cantidad de F-actina en las muestras es directamente proporcional a la intensidad de fluorescencia de la faloidina unida. Expresar en términos absolutos de unidades de enlace de faloidina calculadas a partir de la curva lineal del estándar de faloidina marcado. NOTA: Como ejemplo, véanse las figuras 2A-B, 3A, 4A-B y la figura complementaria 2.</li>
	<li>Exprese los niveles de F-actina como una fracción de las muestras de control. NOTA: Como ejemplo, consulte las figuras 5A-B.</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo aquí descrito, esencialmente adaptado de un estudio anterior30 con modificaciones, emplea una fallotoxina, faloidina etiquetada con una etiqueta fluorescente. Los análogos fluorescentes de faloidina se consideran el estándar de oro para la tinción de filamentos de actina en tejidos fijos47,48,49. De hecho, son las herramientas más antiguas para identificar específicamente los filamentos de actin...

La actina de la proteína citoesquelérea está implicada en funciones celulares múltiples, incluyendo la ayuda estructural, el transporte celular, la movilidad y la división celulares. La actina se produce en equilibrio en dos formas: actina globular monomérica (G-actina) y actina filamentosa polimerizada (F-actina). Los cambios rápidos en el estado de polimerización de la actina (interconversión entre sus formas G y F) dan lugar a un rápido montaje y desmontaje de filamentos y subyacen a sus funciones reguladoras en la fisiología celular. La actina forma el componente principal de la estructura citoesquelética neuronal e influye en una amplia gama de funciones neuronales1,2. Cabe destacar que el citoesqueleto de actina forma parte integral de la plataforma estructural de los terminales sinápticos. Como tal, es un determinante importante de la morfogénesis sináptica y la fisiología y juega un papel fundamental en el control del tamaño, número y morfología de las sinapsis3,4,5. En particular, la polimerización-despolimerización dinámica de actina es un determinante clave de la remodelación sináptica asociada con la plasticidad sináptica subyacente a los procesos de memoria y aprendizaje. De hecho, tanto las funciones presinápticas (como la liberación de neurotransmisores6,7,8,9,10)como las funciones postsinápticas (remodelación dinámica relacionada con la plasticidad11,12,13,14)dependen críticamente de los cambios dinámicos en el estado de polimerización del citoesqueleto de actina.
En condiciones fisiológicas, los niveles de F-actina se regulan de forma dinámica y rigurosa a través de una vía multimodal que implica la modificación postraduccional4,15,16, así como proteínas de unión a actina (ABP)4,17. Los ABP pueden influir en la dinámica de la actina a múltiples niveles (como iniciar o inhibir la polimerización, inducir la ramificación de filamentos, cortar los filamentos a piezas más pequeñas, promover la despolimerización y proteger contra la despolimerización), y a su vez están bajo un estricto control modulador sensible a diversas señales extra e intracelulares18,19,20. Tales controles regulatorios en múltiples niveles dictan una regulación estricta de la dinámica de la actina en el citoesqueleto sináptico, afinando los aspectos pre y postsinápticos de la fisiología neuronal tanto en los estados basales como inducidos por la actividad.
Dados los importantes papeles de la actina en la fisiología neuronal, no es sorprendente que varios estudios hayan proporcionado evidencia de alteraciones en la dinámica de la actina como eventos patógenos críticos relacionados con una amplia gama de trastornos neurológicos, incluyendo neurodegeneración, enfermedades psicológicas, así como dolencias del neurodesarrollo3,21,22,23, 24,25,26,27. A pesar de la riqueza de datos de investigación que apuntan a los papeles clave de la actina en la fisiología neuronal y la fisiopatología, sin embargo, todavía quedan lagunas significativas en la comprensión de la dinámica de la actina, particularmente en el citoesqueleto sináptico. Se necesitan más estudios de investigación para tener una mejor comprensión de la actina neuronal y sus alteraciones en condiciones patológicas. Una de las principales áreas de interés en este contexto es la evaluación del estado de polimerización de la actina. Hay kits comerciales a base de western blotting (kit bioquímico de ensayo G-Actin/F-Actin in vivo; Citoesqueleto SKU BK03728,29)y ensayos caseros para la evaluación de los niveles de F-actina6. Sin embargo, debido a que estos requieren el aislamiento bioquímico de la F-actina y la G-actina y porque su cuantificación posterior se basa en protocolos de immunoblotting, pueden ser lentos. En este documento se presenta un ensayo basado en espectroscopia de fluorescencia adaptado de un estudio previo30 con modificaciones que pueden ser utilizados para evaluar tanto los niveles basales de F-actina, así como los cambios dinámicos en su montaje-desmontaje. En particular, hemos modificado eficientemente el protocolo original que requiere muestras adecuadas para una cubeta de 1 mL al formato actual de placa de 96 pozos. Por lo tanto, el protocolo modificado ha reducido significativamente la cantidad de tejido/muestra necesaria para el ensayo. Además, proporcionamos evidencia de que el protocolo es adecuado no solo para homogeneados de tejido cerebral, sino también para fracciones subcelulares como terminales sinápticos aislados (sinaptosomas y sinaptoneurosomas). Por último, el ensayo se puede emplear para tejidos cerebrales de roedores recién disecados y muestras de cerebro humano post mortem almacenadas a largo plazo. Cabe destacar que, si bien el ensayo se presenta en un contexto neuronal, puede extenderse adecuadamente a otros tipos de células y procesos fisiológicos asociados con ellos.

<table><tbody><tr><td>Tubo de policarbonato de pared gruesa abierto de 3,5 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>para centrifugación en gradiente (preparación de sinaptosomas)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td>Antígeno específico de F-actina</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra &nbsp; b-actina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-47778</td><td>Para la evaluación de los niveles totales de actina por inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Anticuerpo contra GAPDH</td><td>Abcam</td><td>Ab181602</td><td>Para la evaluación de los niveles de GAPDH por inmunotransferencia</td></tr><tr><td>Bio-Rad Ensayo de proteínas Concentrado de reactivo de colorante Bio-Rad</td><td></td><td>5000006</td><td>Estimación de proteínas basada en Bradford</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Componente tampón Krebs</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, sin EDTA Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Sigma-Aldrich 4693159001</td><td></td><td>Para la inhibición de la actividad endógena de la proteasa durante la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Corning de 96 pocillos Poliestireno transparente de fondo plano</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>Para mediciones de dispersión de luz</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Componente tampón Krebs</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Disolvente para faloidina y latrunculina A</td></tr><tr><td>Escáner plano fluorescente (Odyssey Infrared Scanner)</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>Para la detección de señales inmunorreactivas</td><td></td> en inmunoblots</tr><tr><td>Solución de glutaraldehído (25% en agua) Grado II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>Fijador</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Ingrediente tampón para la preparación de muestras y componente tampón Krebs</td></tr><tr><td>Latrindulina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5163</td><td>Despolimerizador de filamentos de actina</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Krebs componente tampón</td></tr><tr><td>Microplacas Filtro de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>membrana Mitex 5 mm</td><td>Millipore</td><td>LSWP01300</td><td>Preparación de sinaptoneurosomas</td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell Placa</td><td>Negra Thermo Fisher Scientific</td><td>237105</td><td>Para mediciones fluorométricas</td></tr><tr><td>Filtro de red de nylon 100 mm</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td>Preparación de sinaptoneurosomas Cóctel de</td></tr><tr><td>inhibidores de fosfatasa IV</td><td>Abcam</td><td>ab201115</td><td>Para la inhibición de la actividad endógena de la fosfatasa durante la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Krebs componente tampón y para la despolarización de terminales sinápticas</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico ((KH2PO4 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Componente tampón Krebs</td></tr><tr><td>Borohidruro de sodio (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71320</td><td>Componente del tampón de permeabilización</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL944</td><td></td> <td>Componente tampón Krebs</td></tr><tr><td>Hidrogenocarbonato de sodio (NaHCO3)</td><td>LabServ (Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL900</td><td>Componente tampón Krebs</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Dispositivos</td><td></td> moleculares <td>Para mediciones fluorométricas</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/8600/60</td><td>Ingrediente tampón para la preparación de muestras</td></tr><tr><td>Swimnex Portafiltros</td><td>Millipore</td><td>Sx0001300</td><td>Preparación de sinaptoneurosomas</td></tr><tr><td>Molinillo de tejidos 5 mL Potter-Elvehjem</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>358034</td><td>Para la homogeneización de tejidos</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Componente de tampón de permeabilización</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>Ingrediente tampón para la preparación de muestras</td></tr></tbody></table>

un ensayo basado en espectroscopia de fluorescencia eficiente en el tiempo para evaluar el estado de polimerización de actina en roedores y tejidos cerebrales humanos

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

La actina, el componente principal del citoesqueleto, desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la estructura y la función neuronales. Bajo estados fisiológicos, la actina se produce en equilibrio en sus dos formas: globular monomérica (G-actina) y filamentosa polimerizada (F-actina). En los terminales sinápticos, el citoesqueleto de actina forma la base para las funciones críticas pre y post-sinápticas. Además, los cambios dinámicos en el estado de polimerización de la actina (interconversión entre las formas globulares y filamentosas de actina) están estrechamente relacionados con las alteraciones relacionadas con la plasticidad en la estructura y función sináptica. Se presenta aquí una metodología basada en fluorescencia modificada para evaluar el estado de polimerización de la actina en condiciones ex vivo. El ensayo emplea faloidina marcada fluorescentemente, una fallotoxina que se une específicamente a los filamentos de actina (F-actina), proporcionando una medida directa de actina filamentosa polimerizada. Como prueba de principio, proporcionamos pruebas de la idoneidad del ensayo tanto en roedores como en homogeneados de tejido cerebral humano post mortem. Usando la latrunculina A (una droga que despolimeriza los filamentos de la actina), confirmamos la utilidad del análisis en alteraciones de la supervisión en niveles de la F-actina. Además, extendemos el ensayo a fracciones bioquímicas de terminales sinápticos aislados en los que confirmamos un aumento de la polimerización de actina tras la estimulación por despolarización con altoK+extracelular.

Linealidad del ensayo para la evaluación de los niveles de F-actina En primer lugar, se comprobó una curva estándar para el aumento lineal de la fluorescencia de Alexa Fluor 647 Phalloidin, que se repitió para cada conjunto de experimentos (Figura 1). Para investigar el rango lineal del ensayo, se procesaron diferentes cantidades de homogenados cerebrales de roedores(Figuras 2A y 2B)y sujetos humanos post mortem(Figur...

Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

La actina es el componente principal del citoesqueleto y regula críticamente varios aspectos de la morfología y fisiología celulares, incluso en las neuronas. La actina se produce en equilibrio entre sus dos formas, G-actina globular monomérica o F-actina filamentosa polimérica. El estado de polimerización de la actina está rigurosamente regulado a múltiples niveles tanto por proteínas de unión a actina, como por su propia regulación post-traslacional.En los contactos sinápticos interneuronales, las alteraciones dinámicas en los niveles de F-actina son un evento regulador clave, controlando la señalización y la plasticidad tanto en terminales sinápticos pre como post. No es sorprendente que la disfunción de la actina esté relacionada con varios estados neuropatológicos. Los avances recientes han llevado a una gran cantidad de conocimientos de actina en fisiología neuronal y fisiopatología.Sin embargo, todavía se desconoce mucho y hay que centrarse en ello. En este sentido, los análogos fluorescentes de faloidina han demostrado ser una herramienta importante en la investigación de actina. Esta falotoxina se une específicamente a la actina filamentar, y por lo tanto se puede utilizar como una medida directa de las cantidades de F-actina, y su alteración en los estados fisiopatológicos.Este estudio presenta un ensayo fluorométrico rápido y eficiente para la evaluación del estado de polimerización de actina en muestras biológicas ex vivo, como homogenados al por mayor y terminales sinápticos aislados bioquímicamente de tejidos cerebrales. Cabe destacar que el ensayo se puede aplicar a otros tipos de células y tejidos y a su fenómeno fisiológico asociado. Para las recetas de los tampones utilizados en este estudio, por favor refiérase al texto detallado.Las muestras de tejido cerebral de ratas o sujetos humanos se homogeneizaron en un tubo de vidrio Potter-Elvehjem y pestle en el hielo en 10 volúmenes de tampón de homogeneización. Para la preparación del synaptosome, el homogenado fue hecho girar primero en una velocidad lenta y entonces en una velocidad más alta para obtener la fracción mitocondrial synaptosomal cruda. Los synaptosomes enriquecidos de esta fracción cruda fueron obtenidos siguiendo un gradiente discontinuo de la sacarosa.Para la preparación synaptoneurosomal, los homogenados fueron pasados secuencialmente a través de dos 100 micrones y un filtro de 5 micras. La estimación de la proteína fue realizada usando el reactivo de Bradford y las muestras fueron diluidas en almacenador intermediario de Krebs en una concentración de dos a tres miligramos por la proteína del mL en un volumen final de 50 microlitros. El estímulo de terminales sinápticos aislados, synaptosomes o synaptoneurosomes, fue realizado por un breve aumento de 30 segundos en potasio extracelular en 37 grados.Para ello, se añadió un cloruro molar de potasio a las muestras a una concentración final de 15 milimolares. Los homogenados son fragmentos sinápticos no estimulados y despolarizados se fijaron con glutaraldehído al 2,5%, mediante la adición del volumen requerido de solución común de glutaraldehído al 25%. Las muestras se incubaron durante dos, tres minutos a temperatura ambiente.El fijador fue quitado por la centrifugación en 20.000 G por cinco minutos. A continuación, se procedió a la permeabilización por reuspensión en tampón Krebs que contenía 0,1%Triton X-100 y 1 mg por mL de borohidruro sódico durante dos a tres minutos a temperatura ambiente. El tampón de permeabilización se eliminó nuevamente por centrifugación y el pellet se lavó superficialmente con tampón Krebs y se resuspendó en tampón Krebs que contenía 1X Alexa Fluor 647 faloidina, correspondiente a 500 micro unidades de faloidina.Se permitió que la unión procediera durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Exceso de faloidina no enlazada se eliminó de las muestras por centrifugación a 20,000 G durante cinco minutos, y las pastillas se lavaron superficialmente con tampón de Krebs, y se resuspendieron de nuevo en el tampón de Krebs que contenía 0,32 molaresas para mantener la flotabilidad de sinaptosomas o sinaptoneurosomas. Las muestras fluorescentes encuadernadas del phalloidin fueron dispensadas en una placa negra de 96 pozos para la lectura fluorométrica en un lector de la placa.Las longitudes de onda de excitación y emisión se fijaron en 645 nanómetros y 670 nanómetros respectivamente. Para cada conjunto de experimentos incluimos diferentes cantidades de alexa fluor 647 faloidina en el tampón Krebs que contiene 0,32 molaresa. Para tener en cuenta cualquier pérdida de muestras durante los pasos de lavado, las muestras se transfirieron del negro a la placa transparente de 96 pozos.La captura de las muestras se examinó a 440 nanómetros. La retención de faloidina fluorescente es directamente proporcional a la cantidad de filamentos de actina o niveles de F-actina en las muestras. La linearidad del atascamiento del phalloidin fue observada en la gama de 50 a 200 proteínas del microgramo.Como prueba de principio, también probamos la eficacia de nuestro ensayo en modelos para la despolimerización de F-actina utilizando la interrupción farmacológica de los filamentos de actina por latrunculina A, así como la estimulación de la formación de F-actina por KCl mediada por la estimulación de terminales sinápticos aislados. La emisión de fluorescencia de faloidina unida se puede expresar como cualquiera de las unidades de faloidina unida generada a partir de la curva lineal estándar y son relativas a las muestras de control. Para la Figura 4, los niveles de F-actina se expresan como micro unidades de faloidina unida.Por otro lado, para la Figura 5 los niveles de F-actina en los fragmentos sinápticos despolarizados se expresan en relación con el control de muestras no despolarizadas. Se describe un ensayo robusto, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento para el análisis de filamentos de actina, o F-actina, y sus alteraciones en los estados fisiológicos y fisiopatológicos adecuados para un formato de placa de 96 pozos. El ensayo es mucho más rápido que los protocolos alternativos existentes y puede servir como una herramienta esencial en estudios relacionados con la actina, ya sea solo o en combinación con ensayos existentes basados en inmunohistoquímica y western blotting.

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Este video muestra el procedimiento para teñir fluorescentemente neuronas corticales de rata para microscopía. Se dirige a las proteínas F-actina y dendríticas para analizar la integridad estructural y calcular la densidad de F-actina, que es crucial para estudiar la función y la salud neuronal.

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Se presenta un alto contenido de código abierto instrumento de análisis (HCA) que utiliza imágenes de vida de fluorescencia automatizado (Flim) para ensayar las interacciones proteína utilizando Förster transferencia de energía resonante (FRET) lecturas basadas. La adquisición de datos para este instrumento openFLIM-HCA es controlado por el software escrito en μManager y se lleva a cabo el análisis de datos en FLIMfit.

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Presentado aquí es un método de tubo de rodillo modificado para cultivo e intermitente proyección de imagen de alta resolución del cerebro de roedor rodajas durante muchas semanas con reposicionamiento preciso en photoetched cubreobjetos. Viabilidad neuronal y la morfología de la rebanada se mantienen bien. Se proporcionan aplicaciones de este sistema totalmente cerrado con virus para la expresión específica de tipo celular.

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Describimos cómo técnicas de micro - y Fotomanipulación como FRAP y fotoactivación permiten la determinación de los parámetros de motilidad y la dinámica espacio-temporal de las proteínas a migración de las células. Lecturas experimentales incluyen la dinámica subcelular y facturación de los reguladores de la motilidad o subyacente del citoesqueleto de actina.

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Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos (Video) | JoVE Journal

Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

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