Name: Vitrificación De Ovocitos Maduros In Vitro Recogidos De Ovarios Adultos Y Prepúrromos En Ovejas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Aprende a vitrificar ovocitos maduros in vitro de ovejas adultas y prepúberes. Este protocolo estandariza la criopreservación para mejorar la supervivencia celular y la competencia desarrollal en biotecnología reproductiva ovina.

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Los autores no recibieron financiación específica para este trabajo. La profesora Maria Grazia Cappai y la Dra. Valeria Pasciu son agradecidas por la voz en off en video y por configurar el laboratorio durante la realización del video.

El protocolo animal y los procedimientos implementados que se describen a continuación están de acuerdo con las directrices éticas vigentes en la Universidad de Sassari, en cumplimiento de la Directiva 86/609/CE de la Unión Europea y la recomendación de la Comisión de las Comunidades Europeas 2007/526/CE.
1. Preparación de medios para la manipulación de ovocitos
<ol><li>Prepare el medio para el transporte de los ovarios recolectados complementando la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con 0,1 g/L de penicilina y 0,1 g/L de estreptomicina (PBS).</li>
	<li>Preparar el medio para la recolección y maduración de ovocitos diluyendo 9,5 g de Tissue Culture Medium (TCM) 199 en polvo con 1 L de agua Milli-Q suplementada con penicilina (0,1%) y estreptomicina (0,1%).<ol>
<li>Después de la dilución, filtre 100 mL de medio y guárdelo a 4 °C como Medio de Maduración (SMM) para ser utilizado durante una semana.</li>
		<li>Preparar el medio de recolección (CM) complementando los 900 mL restantes con 25 mM HEPES, 0,36 g/L de bicarbonato y 0,1% (p/v) de alcohol polivinílico (PVA) (pH 7,3, osmolalidad 290 mOsm/kg).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar el medio de maduración con SMM suplementado con 0,021 g/L de bicarbonato, 10% de suero de ovejas de celo tratado térmicamente, 1 UI/mL de FSH, 1 UI/mL de LH, 100 μL de cisteamina y 8 mg/mL de piruvato. NOTA: El medio de maduración en un volumen de 10 mL debe incubarse en condiciones estándar (en una atmósfera humidificada máxima a 39 °C en un 5% de CO2 en el aire) durante al menos 4 h antes de su uso.</li>
	<li>Preparar el medio base (BM) para la manipulación de ovocitos después de la maduración in vitro, consistente en PBS sinCa++ yMg++,complementado con suero fetal de terneros (FCS) al 20%.</li>
</ol>2. Recolección y maduración de ovocitos
<ol><li>Recuperar los ovocitos de ovarios juveniles (30-40 días de edad, peso corporal 6-10 kg) y adultos.</li>
	<li>Transporte los ovarios recogidos desde el matadero comercial hasta el laboratorio dentro de 1-2 h en PBS a 27 °C.</li>
	<li>Después del lavado en pbs medio fresco, cortar los ovarios en CM utilizando una micro-cuchilla para liberar el contenido del folículo.</li>
	<li>Bajo un examen estereomicroscopio con aumento de 60x, seleccione complejos cúmulo-ovocito (AOC) para la maduración in vitro eligiendo aquellos con 4-10 capas de células granulosa, ovocitos con un citoplasma uniforme, distribución homogénea de gotitas lipídicas en el citoplasma y con el diámetro externo de aproximadamente 90 μm (media).</li>
	<li>Lavar los AOC seleccionados tres veces en CM y finalmente transferirlos en medio de maduración. NOTA: Para los ovocitos juveniles, para mejorar la supervivencia después de la vitrificación, complementar el medio de maduración con 100 μM de trehalosa.</li>
	<li>Para la maduración in vitro, transferir 30-35 COCs en 600 μL de medio de maduración en placas de Petri de cuatro pocillos, recubiertas con 300 μL de aceite mineral e incubarlos durante 22 (ovocitos adultos)/24 (ovocitos juveniles) h en 5% de CO2 en el aire a 39 °C.</li>
	<li>Después de la maduración in vitro, denude los AOC de las células cumulus pipeteando suavemente. Después del examen bajo un estereomicroscopio con aumento de 60x, seleccione solo aquellos que muestren la extrusión en el primer cuerpo polar, y por lo tanto en la etapa de metafase II (MII), para la vitrificación.</li>
</ol>3. Procedimientos de recogida, congelación y descongelación del semen
<ol><li>Preparar el medio base para la criopreservación de semen consistente en extensor de ram (200 mM Tris; 70 mM de ácido cítrico; 55 mM de fructosa; pH 7,2, osmolalidad 300 mOsm/kg) suplementado con yema de huevo al 20% (v/v).</li>
	<li>Recoger el semen sólo durante la temporada de cría de ovejas (octubre-noviembre).</li>
	<li>Obtener eyaculados por vagina artificial a partir de carneros adultos (de 2 a 5 años), mantenidos en un ambiente al aire libre y alimentados con una ración de mantenimiento de peso vivo. Mantenga los carneros aislados en corrales separados, pero con contacto visual entre sí.</li>
	<li>Repetir la recolección de semen una a la semana durante toda la temporada de reproducción para obtener al menos 8 eyaculados de cada macho.</li>
	<li>Transporte las muestras de semen al laboratorio a temperatura ambiental dentro de los 5 minutos posteriores a la recolección y procese inmediatamente. Agrupar los eyaculados de dos-tres carneros y evaluar la espectrofotometría de concentración de espermatozoides.</li>
	<li>Después de la agrupación, diluir los eyaculados hasta 400 x 106 espermatozoides/mL con medio base para la criopreservación de semen complementado con glicerol al 4%. Luego enfríe el semen diluido a 4 °C durante un período de 2 h y equilibre durante 20 min antes de congelarlo.</li>
	<li>Congele las muestras de semen en forma de pellets (0,25 mL) sobre hielo seco y luego sumerjalas en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Para descongelar, ponga el pellet en un halcón de vidrio esterilizado y sumérjalo en un baño de agua durante 20 s a 39 °C.</li>
</ol>4. Fertilización in vitro y cultivo de embriones
<ol><li>Preparar las existencias para la constitución del fluido oviductal sintético (SOF).<ol>
<li>Preparar Stock A: 99.4 mL de MilliQ-agua; 6,29 g de NaCl; 0,534 g de KCl; 0,161 g de KH2PO4; 0,182 g de MgSO4 ·7H2O; y 0,6 mL de Lactato sódico. Conservar a 4 °C durante un hasta 3 meses.</li>
		<li>Preparar Stock B: 10 mL de MilliQ-agua; 0,210 g de NaHCO3; y 2-3 g de Fenol Rojo. Conservar a 4 °C durante 1 mes.</li>
		<li>Preparar Stock C: 10 mL de MilliQ-agua; y 0,051 g de piruvato de sodio. Conservar a 4 °C durante 1 mes.</li>
		<li>Preparar Stock D: 10 mL de MilliQ-agua; y 0,262 g de CaCl2 2H2O. Mantener a 4 °C durante 1 mes.</li>
		<li>Preparar 10 mL de SOF consistentes en 7.630 mL de agua MilliQ, 1 mL de Stock A, 1 mL de Stock B, 0.07 mL de Stock C y 0.7 mL de stock D.</li>
		<li>Preparar medio de fecundación in vitro (FIV): SOF suplementado con 2% de suero estrooso de oveja tratado térmicamente, 10 μg/mL de heparina y 1 μg/mL de hipoutarina (osmolalidad 280-290 mOsm/kg). NOTA: El medio de FIV en un volumen de 10 mL debe incubarse en condiciones estándar (en una atmósfera humidificada máxima a 39 °C en 5% deCO2,5% deO2 y 90% deN2)al menos 4 h antes de su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfiera las alícuotas de semen congeladas/descongeladas en un tubo cónico de vidrio esterilizado por debajo de 1,5 mL de medio de FIV calentado y las incube durante 15 min a 39 °C en una atmósfera humidificada al 5% de CO2 en el aire.</li>
	<li>Después de la incubación, los espermatozoides móviles nadan hacia la porción apical de la columna líquida. Recoger la capa superior y observar para la evaluación de la motilidad de los espermatozoides. NOTA: Los parámetros de motilidad de los espermatozoides deben evaluarse utilizando un sistema de análisis de espermatozoides asistido por computadora (CASA) con los siguientes ajustes: 25 marcos adquiridos para evitar la superposición de la pista de espermatozoides, contraste mínimo 10, velocidad mínima de la trayectoria media 30 μm / s, y motilidad progresiva > 80% de recualidad. Este sistema tiene una configuración específica para la evaluación de espermatozoides ram. Para cada muestra, se cargan 5 μL de submuestra de suspensión de espermatozoides en una cámara de análisis precalentada con una profundidad de 10 μm. La motilidad de los espermatozoides se evalúa a 37 °C a 40x utilizando un microscopio de contraste de fase y se debe analizar un mínimo de 500 espermatozoides por submuestra en al menos cuatro campos microscópicos diferentes. Se evaluó el porcentaje de espermatozoides móviles totales y móviles progresivos. Para la FIV, el porcentaje de espermatozoides móviles progresivos debe ser ≥ del 30%.</li>
	<li>Diluir espermatozoides móviles derivados de swim-up a 1 x 106 espermatozoides/mL de concentración final y co-incubarlos con ovocitos MII en 300 μL de medio de FIV cubiertos con aceite mineral en placas de Petri de cuatro pozos.</li>
	<li>Después de 22 h transfiera los cigotos presuntos en las placas de Petri de cuatro pozos que contienen SOF complementado con la albúmina de suero bovino 0,4% y los aminoácidos esenciales y no esenciales en la concentración oviductal según lo divulgado por16 bajo aceite mineral y cultivarlos bajo condiciones estándar hasta la etapa del blastocyst.</li>
	<li>En 22-, 26- y 32- h post-inseminación, registre el número de ovocitos escindidos, mostrando dos blastómeros distintos, por la examinación bajo estereomicroscopio con la ampliación de 60x.</li>
	<li>Observe los embriones diariamente a partir del quinto al noveno día de cultivo y los blastocistos recién formados deben ser registrados por el examen bajo un estereomicroscopio con aumento de 60x.</li>
</ol>5. Vitrificación y calentamiento de ovocitos
NOTA: Realizar la vitrificación siguiendo el método de volumen mínimo esencial (MEV) utilizando criotopos dispositivo17.
<ol><li>Equilibrar un grupo de cinco ovocitos a 38,5 °C durante 2 min en BM. El uso de BM garantiza una baja concentración de calcio ([Ca2++] 2,2 mg/dL)10.</li>
	<li>Deshidratar los ovocitos con una exposición de 3 min a la solución de equilibrio que contiene 7,5% (v/v) sulfóxido de dimetilo (DMSO) y 7,5% (v/v) de etilenglicol (EG) en BM.</li>
	<li>Transferir los ovocitos a la solución de vitrificación que contiene 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG y 0,5 M de trehalosa en BM antes de cargarlos en un dispositivo de criotopo y sumergirlos directamente en nitrógeno líquido dentro de 30 s.</li>
	<li>Para calentar a una temperatura biológica, transfiera el contenido de cada dispositivo de vitrificación de nitrógeno líquido a gotas de 200 μL de trehalosa de 1,25 M en BM durante 1 min a 38,5 °C, y revuelva suavemente para facilitar la mezcla.</li>
	<li>Para promover la eliminación de los crioprotectores intracelulares, transfiera los ovocitos de forma gradual a 200 μL de gotas de disminución de soluciones de trehalosa (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M de trehalosa en BM) durante 30 s a 38,5 °C antes de equilibrarse durante 10 min a 38,5 °C en BM.</li>
</ol>6. Evaluación de la calidad de los ovocitos después del calentamiento
<ol><li>Después del calentamiento, incubar los ovocitos durante 6 h en PBS sinCa++ yMg++ más 20% fcs (BM) en 5%CO2 en aire a 38,5 °C. NOTA: La capacidad de los ovocitos para restaurar las características biológicas y estructurales después de la vitrificación está en relación con las especies y clases de ovocitos utilizados.</li>
	<li>Dado que la capacidad de los ovocitos para recuperar los daños de criopreservación depende del tiempo, evaluar la calidad de los ovocitos en diferentes puntos de tiempo de cultivo in vitro (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) después del calentamiento, para definir la ventana de tiempo óptima para la fertilización de ovocitos. NOTA: En el ovocito de oveja adulto, el tiempo óptimo es 4 h después del calentamiento; para el ovocitos prepúrromos, el tiempo óptimo es de 2 h después del calentamiento.</li>
</ol>7. Evaluación de la supervivencia de los ovocitos
<ol><li>Inmediatamente después del calentamiento y para cada punto de tiempo de cultivo post-calentamiento, evaluar morfológicamente los ovocitos utilizando un microscopio invertido con aumento de 100x. NOTA: Los ovocitos con alteraciones estructurales, como citoplasma débil, zona de daño pelúcida y/o membrana deben clasificarse como degenerados.</li>
	<li>Valide la evaluación de la integridad de la membrana usando una coloración fluorescente diferencial doble.</li>
	<li>Incubar los ovocitos en 2 mL de BM que contengan yoduro de propidio (PI; 10 μg/mL) y Hoechst 33342 (10 μg/mL) durante 5 min enCO2 al 5% en aire a 38,5 °C.</li>
	<li>Después de lavar tres veces en BM fresco, observe los ovocitos bajo un microscopio fluorescente utilizando un filtro de excitación de 350 nm y emisión de 460 nm para Hoechst 33342 y un filtro de excitación de 535 nm y emisión de 617 nm para PI. NOTA: Los ovocitos con una membrana intacta pueden ser reconocidos por la fluorescencia azul del ADN coloreado con Hoechst 33342. Los ovocitos con membranas dañadas muestran una fluorescencia roja debido a la tinción del ADN con IP.</li>
</ol>8. Evaluación de la actividad mitocondrial y de los niveles intracelulares del ROS por microscopia confocal de la exploración del laser
<ol><li>Prepare la sonda MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).<ol>
<li>Diluir el contenido de 1 vial (50 μg) con 1 mL de DMSO para obtener una solución de 1 mM. Mantenga el vial diluido en nitrógeno líquido.</li>
		<li>Diluya la solución 1 mM con DMSO para obtener la solución común de 100 μM y almacenarla a -80 °C en la oscuridad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare la sonda de diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (H2DCF-DA).<ol>
<li>Diluir elH2DCF-DA en polivinil pirrolina al 0,1% (PVA)/PBS para obtener la primera solución de 100 mM. Mantenga la solución a -80 °C en la oscuridad.</li>
		<li>Diluir la primera solución en PVA/PBS al 0,1% para obtener la solución común de 100 μM. Guárdelo a -20 °C en la oscuridad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar el medio de montaje (MM): para 10 mL de MM, añadir 5 mL de glicerol, 5 mL de PBS y 250 mg de azida de sodio. Guárdelo a -20 °C hasta su uso.</li>
	<li>Incubar los ovocitos durante 30 min a 38,5 °C en BM con 500 nM MT-Red (solución madre: 100 μM en DMSO).</li>
	<li>Después de la incubación con sonda MT-Red, lavar los ovocitos tres veces en BM e incubar durante 20 min en el mismo medio que contiene 5 μM H2DCF-DA (solución madre: 100 μM en BM).</li>
	<li>Después de la exposición a las sondas, lave los ovocitos en BM y fije en glutaraldehído/PBS al 2,5% durante al menos 15 min.</li>
	<li>Después de la fijación, lave los ovocitos tres veces en BM y monte en diapositivas de vidrio en una gota de 4 μL de MM con 1 mg/mL Hoechst 33342 usando cojines de cera para evitar la compresión de muestras.</li>
	<li>Guarde las diapositivas a 4 °C en la oscuridad hasta la evaluación.</li>
	<li>Realizar el análisis de secciones inmunomarcadas con un microscopio de barrido láser confocal. El microscopio está equipado con láseres Ar/He/Ne, utilizando un objetivo de aceite 40/60x. Analizar las secciones por excitación secuencial.</li>
	<li>Para la evaluación mitocondrial, observe las muestras con un láser multifotón para detectar MT-Red (exposición: 579 nm; emisión: 599 nm).</li>
	<li>Utilice un rayo láser de iones de argón a 488 nm y el filtro B-2 A (exposición de 495 nm y emisión de 519 nm) para señalar la diclorofluoresceína (DCF)18.</li>
	<li>En cada ovocito individual, mida las intensidades de fluorescencia MT-Red y DCF en el plano ecuatorial19.</li>
	<li>Mantener los parámetros relacionados con la intensidad de fluorescencia en valores constantes durante todas las adquisiciones de imágenes (energía láser 26%, Ajustes secuenciales 1: Ganancia PMT1 649-PMT2 ganancia 482; Ajuste secuencial 2: Ganancia PMT1 625-PMT2 ganancia 589; desplazamiento 0; tamaño del agujero de alfiler: 68).</li>
	<li>Realizar análisis cuantitativos de la intensidad de fluorescencia utilizando el paquete de software de análisis de imágenes Leica LAS AF Lite, siguiendo los procedimientos estandarizados por20.</li>
	<li>Captura las imágenes una vez, moviéndose sobre el eje Z, hasta llegar al plano ecuatorial.</li>
	<li>Para cada foto, transformar a escala de grises y desactivar el canal 1 (relacionado con el azul hoechst) se apagó. A continuación, dibuje manualmente una región de interés (ROI) en un área circunscrita, es decir, alrededor del huso meiótico. NOTA: El software puede leer automáticamente el valor promedio de píxeles en el canal 2 (FITC), restando el valor del fondo de él.</li>
	<li>Registre los valores medios de los píxeles y envíelos para su análisis estadístico.</li>
</ol>9. Análisis estadísticos
<ol><li>Analizar las siguientes diferencias: tasas de supervivencia en ovocitos juveniles vs adultos, tasas de supervivencia y competencia de desarrollo en ovocitos juveniles tratados con trehalosa y ovocitos tratados con trehalosa, supervivencia y tasas de activación partenogenética y competencia de desarrollo de ovocitos adultos vitrificados con diferentes medios de concentración de calcio, tasas de fertilización y producción de embriones en ovocitos juveniles vitrificados con baja o alta concentración de calcio, fenotipos mitocondriales activos en ovocitos vitrificados juveniles durante diferentes puntos de tiempo del cultivo post-calentamiento y las tasas de activación partenogenética entre ovocitos vitrificados adultos y juveniles utilizando la prueba de chi cuadrado.</li>
	<li>Analizar la tasa de escisión y la producción de embriones en ovocitos adultos vitrificados durante diferentes puntos de tiempo de cultivo post-calentamiento, intensidad de fluorescencia de la actividad mitocondrial y niveles intracelulares ros en ovocitos vitrificados juveniles durante diferentes puntos de tiempo de cultivo post-calentamiento por ANOVA después del análisis de homogeneidad de varianza por la prueba de Levene. Utilice una prueba post-hoc de la prueba de Tukey para resaltar las diferencias entre los grupos.</li>
	<li>Realice el análisis estadístico usando el programa de software estadístico y considere una probabilidad de P < 0.05 para ser el nivel mínimo de significación. Todos los resultados se expresan como ± media de S.E.M.</li>
</ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

La criopreservación de ovocitos en animales domésticos puede permitir no sólo la conservación a largo plazo de los recursos genéticos femeninos, sino también avanzar en el desarrollo de biotecnologías embrionarias. Por lo tanto, el desarrollo de un método estándar para la vitrificación de ovocitos beneficiaría tanto al ganado como al sector de la investigación. En este protocolo, un método completo para la vitrificación adulta del oocyte de las ovejas se presenta y podría representar un punto de partida sólido para el de...

El almacenamiento a largo plazo de los gametos femeninos puede ofrecer una amplia gama de aplicaciones, como la mejora de la cría de animales domésticos mediante programas de selección genética, la contribución a la preservación de la biodiversidad a través del programa de conservación de especies silvestres ex situ, y el impulso de la investigación y las aplicaciones biotecnológicas in vitro gracias a la disponibilidad de ovocitos almacenados para ser incorporados en la producción de embriones in vitro o en los programas de trasplante nuclear1,2,3. La vitrificación de ovocitos juveniles también aumentaría la ganancia genética al acortar el intervalo de generación en los programas de cría4. La vitrificación por enfriamiento y calentamiento ultrarrápido de ovocitos se considera actualmente un enfoque estándar para la criopreservación de ovocitos de ganado5. En los rumiantes, antes de la vitrificación, los ovocitos suelen madurar in vitro, después de la recuperación de folículos obtenidos de ovarios derivados demataderos 2. Los ovarios adultos, y especialmente los ovarios prepúrromos4,6,pueden suministrar un número prácticamente ilimitado de ovocitos que se criopreservan.
En el ganado vacuno, después de la vitrificación y calentamiento de los ovocitos, los rendimientos de blastocistos en >10% han sido comúnmente reportados por varios laboratorios durante la última década3. Sin embargo, en los pequeños rumiantes la vitrificación de ovocitos todavía se considera relativamente nueva tanto para ovocitos juveniles como para adultos, y queda por establecer un método estándar para la vitrificación de ovocitos ovinos2,5. A pesar de los avances recientes, el ovocito vitrificado y calentado presenta de hecho varias alteraciones funcionales y estructurales que limitan su potencial de desarrollo7,8,9. Por lo tanto, pocos artículos han reportado el desarrollo de blastocistos al 10% o más en ovocitos de oveja vitrificados /calentados2. Se han investigado varios enfoques para reducir las alteraciones antes mencionadas: optimización de la composición de las soluciones de vitrificación y descongelación10,11; experimentar con el uso de diferentes crio-dispositivos8,12,13; y la aplicación de tratamientos específicos durante la maduración in vitro (GIV)4,14,15 y/o durante el tiempo de recuperación después del calentamiento6.
Aquí describimos un protocolo para la vitrificación de ovocitos de oveja recogidos de donantes juveniles y adultos y madurados in vitro antes de la criopreservación. El protocolo incluye todos los procedimientos desde la maduración in vitro de ovocitos hasta la vitrificación, el calentamiento y el período de cultivo post-calentamiento.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Diacetato de diclorofluorescina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-6883</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina fracción bovina V, libre de proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bisbenzimida H 33342 triclorhidrato (Hoechst 33342)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2 2H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Leica Microsystems GmbH,Wetzlar</td><td>TCS SP5 DMI 6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Cryotop Kitazato</td><td>Medical Biological Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9768</td><td></td></tr><tr><td>D- (-) Fructosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Trehalosa deshidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Fosfato tamponado solución salina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Yema de huevo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3556</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol (EG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Ácido glutámico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5638</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hypoutarine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1384</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Diaphot, Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3534</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3784</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284</td><td></td></tr><tr><td>L-Ácido Aspártico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4534</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Cistina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8786</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6420</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9511</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7383</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1512</td><td></td></tr><tr><td>L-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1137</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2893</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O6503</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenilalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5030</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4655</td><td></td></tr><tr><td>L-Serina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5511</td><td></td></tr><tr><td>L-tirosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>L-valina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6504</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Makler Cámara de recuento</td><td>Sefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Rojo CM-H2XRos</td><td>ThermoFisher</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Suero de ternero recién nacido inactivado por calor (FCS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Fenol Rojo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol polivinílico (87-90% hidrolizado, peso mol medio 30.000-70.000)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Suero de oveja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2202</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Jarabe de solución de dl-lactato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de Clases de Esperma</td><td>Microptic S.L.</td><td>S.C.A. v 3.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Software estadístico Minitab 18.1</td><td>2017 Microscopio</td> estereoscópico Minitab <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olimpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7146</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15,456-3</td><td></td></tr></tbody></table>

vitrificación de ovocitos maduros in vitro recogidos de ovarios adultos y prepúrromos en ovejas

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

En el ganado, los sistemas de producción de embriones in vitro se pueden desarrollar y mantener gracias a la gran cantidad de ovarios y ovocitos que se pueden obtener fácilmente de un matadero. Los ovarios adultos siempre llevan varios folículos antrales, mientras que en los donantes prepúerales los números máximos de ovocitos están disponibles a las 4 semanas de edad, cuando los ovarios tienen un número máximo de folículos antrales. Así, los corderos de 4 semanas de edad se consideran buenos donantes, incluso si la competencia de desarrollo de los ovocitos prepúrromos es menor en comparación con su contraparte adulta. 
La investigación básica y las aplicaciones comerciales se verían impulsadas por la posibilidad de criopreservar con éxito ovocitos vitrificados obtenidos de donantes adultos y prepúterrales. La vitrificación de los ovocitos recogidos de donantes prepúrromos también permitiría acortar el intervalo de generación y, por lo tanto, aumentar la ganancia genética en los programas de cría. Sin embargo, la pérdida de potencial de desarrollo después de la criopreservación hace que los ovocitos de mamíferos sean probablemente uno de los tipos celulares más difíciles de criopreservar. Entre las técnicas de criopreservación disponibles, la vitrificación se aplica ampliamente a los ovocitos animales y humanos. A pesar de los avances recientes en la técnica, las exposiciones a altas concentraciones de agentes crioprotectores, así como lesiones escalofriantes y estrés osmótico todavía inducen varias alteraciones estructurales y moleculares y reducen el potencial de desarrollo de los ovocitos de mamíferos. Aquí, se describe un protocolo para la vitrificación de ovocitos de oveja recogidos de donantes juveniles y adultos y madurados in vitro antes de la criopreservación. El protocolo incluye todos los procedimientos desde la maduración in vitro de ovocitos hasta la vitrificación, el calentamiento y el período de incubación post-calentamiento. Los ovocitos vitrificados en la etapa de MII de hecho pueden ser fertilizados después del calentamiento, pero necesitan tiempo extra antes de la fertilización para restaurar el daño debido a los procedimientos de criopreservación y para aumentar su potencial de desarrollo. Por lo tanto, las condiciones de cultivo posteriores al calentamiento y el momento son pasos cruciales para la restauración del potencial de desarrollo de ovocitos, especialmente cuando los ovocitos se recolectan de donantes juveniles.

La criotolerance de los ovocitos de donantes juveniles es menor en comparación con los adultos. El primer efecto observado es una menor tasa de supervivencia post-calentamiento en comparación con los ovocitos adultos(Figura 1A;χ2 prueba P&lt;0,001). Los ovocitos juveniles mostraron una menor integridad de la membrana después del calentamiento (Figura 1B). El uso de trehalosa en el medio de maduración tenía como objetivo verificar si este azúcar podría...

El protocolo tiene como objetivo proporcionar un método estándar para la vitrificación de ovocitos de ovejas adultas y juveniles. Incluye todos los pasos desde la preparación de los medios de maduración in vitro hasta el cultivo post-calentamiento. Los ovocitos se vitrifican en la etapa de MII utilizando Cryotop para asegurar el volumen mínimo esencial.

Vitrificación De Ovocitos Maduros In Vitro Recogidos De Ovarios Adultos Y Prepúrromos En Ovejas

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

El mantenimiento de la viabilidad potencial de los ovocitos después del almacenamiento a largo plazo representa una herramienta de gran oportunidad, ya que mejoraría la cría de animales domésticos mediante programas de selección genética, contribuiría a preservar la biodiversidad a través de la conservación de especies silvestres y aumentaría la investigación en biotecnología. La vitrificación de ovocitos juveniles fue mucho más corta en el intervalo de generación en los programas de cría. La vitrifacción por enfriamiento y calentamiento ultrarápido se considera un enfoque estándar en la preservación de ovocitos de ganado.Sin embargo, en el ganado ovino este procedimiento todavía se considera relativamente nuevo y falta un método estándar. En este vídeo, describimos un protocolo para la vitrificación de ovocitos de ovejas, recogidos de donantes juveniles y adultos, y madurado in vitro a antes de la criopreservación. El protocolo incluye todos los procedimientos de maduración in vitro, vitrificación, calentamiento y cultivo post-calentamiento.Tras recuperar el complejo ovocitos Cumulus, donde se maduró in vitro durante 24 horas en estática una condición que incluye para ovocitos juveniles, la suplementación con cien micromolares de trehalosa en medio de maduración. Después de la maduración in vitro, los ovocitos fueron denudados de las células cumulus mecánicamente pipeteando suavemente y examinados bajo microscopio estéreo, con la ampliación de 60x. La selección de los ovocitos a someter en los procedimientos de vitrificación representan el primer paso importante para garantizar la aplicación exitosa de este procedimiento.Sólo aquellos con el citoplasma uniforme, con distribución homogénea de gotitas lipídicas, integridad de todo Emma amplio y continuo pivotal en el espacio, zona compacta pelúcida el diámetro exterior de unos 19 micrómetros y mostrando la extrusión del primer cuerpo polar, y por lo tanto en el M2, etapa deben ser seleccionados. La vitrificación se realizó utilizando el método de volumen mínimo esencial, con un dispositivo Cryotops. Después de la selección, un grupo de cinco ovocitos juveniles fueron condicionados a 38,5 grados centígrados en medio base durante dos minutos.Los ovocitos fueron entonces deshidratados por la exposición de tres minutos a una solución de la calibración. La carga del ovocito en el dispositivo de vitrificación utilizado es un paso importante y crítico. Cryotop utiliza una tira de polipropileno unida a un soporte.En este método, los ovocitos en la solución de vitrificación, menos de 0 punto mililitro se cargan rápidamente con un capilar de vidrio en la parte superior de la tira de película. Luego se debe eliminar la solución, dejando atrás una capa lo suficientemente delgada como para cubrir las células que se van a criopreservar. Antes de ser cargado en el dispositivo Cryotop y sumergido directamente en nitrógeno líquido dentro de 30 segundos.Para una temperatura biológica interior cálida, el contenido de cada dispositivo de vitrificación se transfirió de nitrógeno líquido a 200 gotas de microlitro de solución de trehalosa decreciente. Los ovocitos se transfirieron al conjunto, arrastrando los ovocitos con una pipeta fina y de vidrio, para promover la eliminación de los crioprotectores intracelulares. Finalmente, los ovocitos fueron pre-criados en un medio base en incubadora en dióxido de carbono al 5%.Inmediatamente después del calentamiento, y para cada punto de tiempo de la cultura post-calentamiento, los ovocitos fueron evaluados morfológicamente usando un microscopio invertido con aumento de 100x. La tolerancia al crio de los ovocitos de donantes juveniles es menor en comparación con los alterados con menor integridad de la membrana después del calentamiento. El uso de trehalosa en medio de maduración indujo en ovocitos juveniles una mayor integridad de la membrana, aumentando las tasas de supervivencia después de la vitrificación.Sin embargo la hendidura, la fertilización, y los índices de desarrollo de ovocitos juveniles no fueron aumentados por la suplementación de la trehalosa. El uso de medios con concentración de calcio igual a 2,2 miligramos decilitro para la vitrificación de ovocitos juveniles, debería tener mayores tasas de fecundación en comparación con los ovocitos vitrificados con concentración de calcio, pero no se encontraron diferencias que permitieran la producción. Mediante la comparación de la cultura post-calentamiento en diferentes duraciones, se demostró que después de cuatro horas de cultivo de ovocitos recogidos de los dos mayores son capaces de recuperar los enlaces energéticos y la configuración microtubular, y para restaurar la competencia de desarrollo con mayor escisión y blastocitos residuos.La actividad mitocondrial era más alta en ovocitos juveniles calientes vitrificados después de cuatro horas de cultura del poste-calentamiento, comparada a otros puntos del tiempo. La distribución mitocondrial de la separación también cambió durante seis horas de cultura del poste que calentaba. Por otra parte, los niveles intracelulares reactivos de la especie del oxígeno eran perceptiblemente más bajos en ovocitos juveniles en dos horas de cultura de poste-calentamiento comparadas a 0, 4, y 6 horas.Sin embargo, y en contraste con lo encontrado en otros ovocitos, las tasas de activación partenogenética espontánea aumentaron durante el cultivo post-calentamiento en ovocitos juveniles. Una de las principales ventajas del método propuesto es que incluye todos los pasos desde la recolección de ovocitos hasta la maduración in vitro, la vitrificación y el calentamiento. Además, incluye un período de cultivo post-calentamiento para permitir la recuperación de ovocitos de los daños incurridos durante el procedimiento de vitrificación.Elegir el momento óptimo para la fertilización es un desafío, y puede afectar el resultado del programa de vitrificación. También debe considerarse que, a diferencia de la congelación lenta, la vitrificación es una técnica manual y, por lo tanto, depende del operador. Por esta razón, un desafío importante es la necesidad de técnicos e investigadores calificados que tengan en cuenta el efecto del operador en la evaluación del resultado del programa de vitrificación.Otros estudios de nuestro laboratorio permitirán en el intento de estandarizar el procedimiento de vitrificación de ovocitos y la selección, y en una mejor adaptación de la composición de los medios a las necesidades del ovocito juvenil. Un desprecio sobre el uso de la cultura y el carácter y antioxidante que ofrecemos oportunidades prometedoras.

vitrification-vitro-matured-oocytes-collected-from-adult-prepubertal

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este manuscrito describe un enfoque experimental para caracterizar morfológicamente y bioquímicamente ovocitos de caballo. Específicamente, el presente trabajo ilustra cómo recolectar ovocitos de caballo inmaduros y maduros mediante recogida de óvulos guiada por ultrasonido (OPU) y cómo investigar la segregación de cromosomas, morfología de huso, acetilación de histonas globales y expresión de mRNA.

Análisis de la segregación cromosómica, acetilación de histonas y morfología de huso en ovocitos de caballo

Aquí se presentan dos protocolos para la encapsulación de ovocitos porcinos en condiciones de cultivo 3D. En el primero, los complejos cúmulos-oocitos (COC) se encapsulan en perlas de fibrina-alginato. En el segundo, se encierran con partículas fluoradas de etileno propileno propileno (microbiorreos). Ambos sistemas garantizan condiciones óptimas para mantener su organización 3D.

Hidrogeles de Alginato degradados proteolíticamente y microbiorreactores hidrófobos para encapsulación de oocitos porcinos

Este manuscrito describe un protocolo para la vitrificación de volumen mínimo de ovocitos de gato inmaduros con medios de laboratorio en soportes comerciales. Cubre cada paso desde el aislamiento de ovocitos desde las gónadas ex vivo hasta la vitrificación y el calentamiento.

Vitrificación de Volumen Mínimo de Ovocitos Felinos Inmaduros

Describimos los procedimientos para el aislamiento de ovocitos en crecimiento de los folículos ováricos en las primeras etapas de desarrollo, así como la instalación de un sistema de cultivo in vitro que puede apoyar el crecimiento y la diferenciación hasta la etapa completamente adulta.

Estrategia de cultivo In Vitro para ovocitos del folículo antral temprano en el ganado bovino

La criopreservación de ovocitos es reconocida por varias sociedades científicas internacionales como el estándar de oro para la preservación de la fertilidad en mujeres pospúrdicas. Las estrategias clínicas y de laboratorio adecuadas garantizan la máxima eficacia, eficiencia y seguridad de los tratamientos de preservación de la fertilidad.

Preservación de la fertilidad a través de la vitrificación de ovocitos: perspectivas clínicas y de laboratorio

Se presenta un protocolo para la vitrificación de tejido ovárico, como método de criopreservación alternativo al ampliamente utilizado protocolo de congelación lenta.

Vitrificación del tejido de la corteza ovárica para lograr un estado vítreo de agregación

Aquí, presentamos el protocolo Espátula Montevideo para vitrificar embriones de preimplantación de ratones y ovejas, que consiste en una espátula casera y utiliza soluciones caseras. Los embriones se equilibran rápidamente en dos soluciones crioprotectoras de concentración creciente, se cargan en la espátula, se sumergen en nitrógeno líquido y finalmente se sellan con una pajita de 0,5 ml.

Espátula Montevideo Dispositivo para la vitrificación de embriones de mamíferos

Este protocolo describe métodos estandarizados para aislar y procesar líquido folicular, células somáticas y ovocitos inmaduros de procedimientos de FIV, lo que permite análisis moleculares y celulares de alta calidad. Estos enfoques apoyan la investigación traslacional sobre la fertilidad, el envejecimiento reproductivo y la disfunción ovárica utilizando materiales que normalmente se desechan en la atención clínica.

Recolección de líquido folicular humano, células somáticas foliculares y ovocitos inmaduros de individuos sometidos a fertilización in vitro

Describimos métodos de manipulación de ovocitos inmaduros de Xenopus laevis, maduración in vitro de ovocitos a óvulos e inyección intracitoplasmática de espermatozoides. Este protocolo permite la degradación de algunas proteínas maternas y la sobreexpresión de genes de interés en la fertilización, por lo que es valioso para estudiar el papel de factores específicos en el desarrollo embrionario temprano.

La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

En ensayos de colonias in vitro para la detección de auto-renovación y diferenciación de células progenitoras aisladas de páncreas murinos adultos estén concebidas. En estos ensayos, los progenitores de páncreas dan lugar a colonias de células en el espacio de 3 dimensiones en un medio semi-sólido que contiene metilcelulosa. Se describen protocolos para la manipulación de células individuales y caracterización de las colonias individuales.

Los ensayos in vitro de colonias para la caracterización de células progenitoras Tri-potentes Aislado de los murinos adultos Páncreas

Aprende a vitrificar ovocitos maduros in vitro de ovejas adultas y prepúberes. Este protocolo estandariza la criopreservación para mejorar la supervivencia celular y la competencia desarrollal en biotecnología reproductiva ovina.

Vitrificación De Ovocitos Maduros In Vitro Recogidos De Ovarios Adultos Y Prepúrromos En Ovejas

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