Tinción e imágenes de alta resolución de modelos organoides y esferoides tridimensionales
27 de marzo de 2021
Aquí, proporcionamos protocolos detallados, robustos y complementarios para realizar imágenes de tinción y resolución subcelular de modelos de cultivo celular tridimensionales fijos que van desde 100 μm hasta varios milímetros, lo que permite la visualización de su morfología, composición de tipo celular e interacciones.
La caracterización del modelo 3D in vitro a resolución celular y subcelular es crucial para la explotación completa, pero puede ser un desafío. Por lo tanto, hemos proporcionado un protocolo complementario para la tinción y la resolución subcelular de imágenes de modelos 3D fijos in vitro que van desde 100 micrómetros hasta varios milímetros. Las estructuras 3D son radiales y deben manipularse cuidadosamente.
Antes de pipetear, verifique la ubicación de sus estructuras 3D dentro del tubo para evitar cualquier aspiración. Como hemos adaptado técnicas clásicas para la incrustación de estructuras pequeñas como organoides o esferoides, las instrucciones visualizadas pueden ayudar a los usuarios primerizos a realizar la tarea más fácilmente. Demostrando el procedimiento conmigo estará Laura Francols, una técnica de laboratorio de la Plataforma de Investigación de Patología.
Para preparar muestras para la tinción 3D de montaje completo, use una punta de pipeta de un mililitro precodificada con BSA para agregar una suspensión de estructura 3D de un mililitro a un tubo de 500 microlitros de PBS. Cuando las estructuras 3D se hayan asentado en el fondo del tubo, reemplace cuidadosamente el PBS con 500 microlitros de solución de bloqueo de permeabilización durante una incubación de una hora a temperatura ambiente con agitación horizontal suave a 30 a 50 revoluciones por minuto. Al final de la incubación, deje que las estructuras 3D sedimenten nuevamente antes de lavar cuidadosamente las estructuras 3D dos veces en un mililitro de 0.1% PBS suplementado con BSA durante tres minutos por lavado.
Después del último lavado, etiquete las estructuras 3D con 250 microlitros de anticuerpos primarios en PBS durante dos o tres días con una suave agitación horizontal a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, lavar la muestra con cinco lavados de tres minutos y dos de 15 minutos en un mililitro de BSA al 0,1% de PBS por lavado. Después del último lavado, etiquete las estructuras 3D con 250 microlitros del anticuerpo secundario apropiado en PBS durante 24 horas a cuatro grados centígrados con una suave agitación horizontal protegida de la luz.
Al día siguiente, etiquete las estructuras 3D con 250 microlitros de la concentración apropiada de Hoechst 3342 durante una incubación de dos horas a cuatro grados centígrados con una suave agitación horizontal. Al final de la incubación, lavar las estructuras 3D cinco veces durante tres minutos y dos veces durante 15 minutos en un mililitro de PBS por lavado como se demuestra. Después del último lavado, transfiera las estructuras 3D a una microplaca de poliestireno negro de 96 pocillos y agregue suavemente 200 microlitros de solución de limpieza a las estructuras, evitando burbujas.
Luego coloque la placa cubierta con papel de aluminio a cuatro grados centígrados durante al menos 48 horas. Para incrustar grandes modelos de cultivo celular 3D, use una punta de pipeta de un mililitro recubierta con BSA para transferir cuidadosamente las estructuras 3D a un tubo de vidrio de fondo plano con una tapa de botella forrada de PTFE. Después de que las estructuras se hayan asentado, reemplace cuidadosamente el PBS con etanol al 70% para una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, reemplace el etanol al 70% con un mililitro de solución Y de eosina lista para usar. Mueva el tubo y manche las estructuras durante al menos 30 minutos. Al final de la incubación, deshidratar las estructuras con tres lavados sucesivos de 30 minutos en un mililitro de etanol al 100% por lavado.
Después de la última deshidratación, limpie las estructuras 3D con tres lavados sucesivos de 30 minutos en un mililitro de xileno por lavado bajo una campana química. Después de la última inmersión en xileno, coloque un trozo de almohadilla de biopsia empapada en xileno en un compartimento de un casete de tejido microgemelo blanco y use una pipeta Pasteur de plástico de dos mililitros recubierta de BSA para transferir las estructuras 3D a la almohadilla. Cubra las estructuras 3D con otra almohadilla de biopsia empapada en xileno para mantener las estructuras 3D en su lugar y cierre el casete.
Cuando todas las muestras hayan sido transferidas, coloque los casetes en un baño de parafina de 65 grados centígrados durante 30 minutos antes de colocar los casetes en un baño de parafina fresco de 65 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, agregue parafina líquida a un molde de incrustación calentado a 65 grados centígrados por muestra y coloque una muestra incrustada en parafina en cada molde. Agite suavemente los moldes hasta que todas las estructuras 3D caigan al fondo, y use pinzas finas calentadas a 65 grados centígrados para colocar las estructuras 3D en el centro de cada molde.
Enfríe el molde hasta que la parafina forme una capa sólida delgada, asegurando la estructura 3D en su lugar. Coloque un cassette de pañuelo de papel y agregue parafina caliente sobre el molde. Retire el molde cuando la parafina se haya solidificado completamente.
Para incrustar pequeños modelos de cultivo celular 3D, lave suavemente las estructuras 3D tres veces en un mililitro de TBS por lavado. Después del último lavado, retire la mayor cantidad de TBS posible sin tocar las estructuras y agregue dos gotas de reactivo dos de un kit de incrustación de parafina comercial. Mezclar suavemente dando golpecitos, y añadir dos gotas de reactivo una con golpeteo hasta que el gel se solidifique.
Use pinzas finas para transferir el gel del pocillo del casete preensamblado del kit y deshidrate la muestra incrustada en gel con incubaciones ascendentes de etanol y xileno de 30 minutos en una campana extractora, según se indique. Después de la última inmersión en xileno, coloque el casete en un baño de parafina de 65 grados centígrados durante la noche antes de usar pinzas finas para transferir la muestra incrustada en parafina al centro de un molde de parafina líquida cargado a 65 grados centígrados. Luego asegure la estructura 3D con una capa más de parafina como se demostró para los grandes modelos de cultivo celular 3D.
La tinción tridimensional de montaje completo y la microscopía confocal proporcionan información visual sobre la composición celular y la posición espacial de los modelos de cultivo 3D a un campo de profundidad de hasta 200 micras. La alta resolución que se puede obtener para estructuras 3D utilizando este protocolo permite la aplicación de algoritmos de segmentación celular y subcelular para la cuantificación del número celular y la detección de varios marcadores celulares dentro de diferentes subtipos celulares. El análisis de montajes completos 3D se puede aplicar a células visualizadas de hasta 200 micras de profundidad, independientemente de las estructuras completas.
Por el contrario, el análisis de secciones 2D puede proporcionar información sobre celdas de cualquier tamaño.
Descripción general
Este artículo presenta protocolos detallados para la tinción y el análisis por imágenes con resolución subcelular de modelos de cultivo celular tridimensional (3D) fijados in vitro, como organoides y esferoides. Los métodos permiten a los investigadores analizar cultivos 3D que van desde 100 µm hasta varios milímetros, facilitando la caracterización celular y subcelular esencial para el desarrollo, la modelización de enfermedades, el descubrimiento de fármacos y la medicina regenerativa. Los protocolos abarcan tanto la inmunomarcación en preparaciones completas con aclarado óptico para microscopía confocal como el inclusión en parafina para análisis histológico e inmunohistoquímico.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología celular
- Histología
- Técnicas de imagen
- Cultivo celular en 3D
Antecedentes
- Los modelos de cultivo celular 3D, incluidos organoides y esferoides, se utilizan cada vez más para modelar el desarrollo y las enfermedades, el cribado de fármacos y la medicina regenerativa.
- El análisis celular y subcelular detallado de estos modelos es técnicamente desafiante debido a su tamaño y complejidad.
- Se necesitan protocolos estandarizados y robustos para facilitar la obtención de imágenes reproducibles y de alta resolución de los cultivos 3D.
- Tanto los análisis de montaje completo como los basados en secciones proporcionan información complementaria sobre la composición celular y la organización espacial.
Objetivo del estudio
- Proporcionar protocolos detallados y paso a paso para la tinción y el análisis por imágenes de modelos de cultivo celular 3D in vitro fijados.
- Posibilitar el análisis celular y subcelular de alta resolución de organoides y esferoides con distintos tamaños y morfologías.
- Facilitar la preparación reproducible de muestras para análisis completos, tanto en montaje completo como en inclusión en parafina.
Métodos Utilizados
- Recolección y manipulación cuidadosas de estructuras 3D para prevenir daños.
- Inmunomarcado en montaje completo: permeabilización, bloqueo, incubación con anticuerpos primarios y secundarios, tinción nuclear y aclarado óptico.
- Inclusión en parafina: deshidratación, tinción con eosina, aclarado con xileno, inclusión en moldes de parafina y seccionado para tinción histológica/inmunohistoquímica.
- Microscopía confocal para imágenes 3D con profundidad de hasta 200 µm y aplicación de algoritmos de segmentación para análisis cuantitativo.
Resultados Principales
- Los protocolos permiten una tinción y visualización robustas de modelos de cultivo celular en 3D con tamaños que van desde 100 µm hasta varios milímetros.
- La tinción en montaje completo combinada con microscopía confocal proporciona una visualización de alta resolución de la composición celular y la disposición espacial hasta una profundidad de 200 µm.
- El incluido en parafina y el corte histológico permiten un análisis detallado de células en estructuras de cualquier tamaño.
- Los métodos permiten la cuantificación del número de células y la detección de marcadores celulares específicos dentro de subtipos.
Conclusiones
- Los protocolos descritos ofrecen enfoques confiables y complementarios para la caracterización celular y subcelular de modelos 3D in vitro.
- Estos métodos son ampliamente aplicables a diversos organoides y esferoides, independientemente de su origen o condiciones de cultivo.
- La adopción de estos protocolos puede mejorar la reproducibilidad y la profundidad del análisis en la investigación de cultivos celulares 3D.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La tinción e imagen de alta resolución de modelos tridimensionales de organoides y esferoides aborda un cuello de botella crítico en la investigación básica y traslacional al permitir la caracterización celular y subcelular en sistemas complejos in vitro. Estos protocolos respaldan la confianza predictiva en los modelos de enfermedades y en las líneas de descubrimiento de fármacos al proporcionar datos robustos y reproducibles sobre la composición celular y la organización espacial. Su amplia aplicabilidad en diversos modelos tridimensionales mejora la estandarización general del portafolio y la toma de decisiones ajustada al riesgo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite una minuciosa exploración de la arquitectura celular y la expresión de marcadores en modelos tridimensionales relevantes para la enfermedad.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante la visualización de relaciones espaciales y subtipos celulares dentro de organoides y esferoides.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos mediante segmentación cuantitativa y detección de marcadores con resolución subcelular.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara sistemas biológicos 3D validados para ensayos fenotípicos y cribado de compuestos posteriores.
- Normaliza los protocolos de tinción y adquisición de imágenes para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad cuantitativa entre experimentos.
- Permite obtener imágenes de alto contenido adecuadas para cribado escalable y reutilización de la plataforma.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona hallazgos in vitro con estrategias traslacionales de biomarcadores al permitir la detección multiplex de marcadores en contextos tridimensionales.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al facilitar un análisis celular y subcelular robusto.
- Reduce el riesgo traslacional al garantizar la caracterización del sistema relevante para la enfermedad antes de los estudios in vivo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Estos protocolos se integran en el continuo de descubrimiento desde la prueba inicial de hipótesis hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, apoyando tanto análisis de montaje completo como basados en secciones para una caracterización integral del modelo.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la visualización de la composición celular y la organización espacial.
- Selección: Proporciona modelos tridimensionales reproducibles y listos para ensayos, con resultados cuantitativos de imágenes para la evaluación de compuestos.
- Análisis: Ofrece mediciones de alta resolución y datos de segmentación para comparar condiciones experimentales y detectar marcadores celulares.
- Investigación Traducional: Apoya la alineación de biomarcadores y la continuidad preclínica mediante el análisis multiplexado en sistemas relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un flujo de trabajo estandarizado y ampliamente aplicable para diversos modelos de organoides y esferoides en programas de I+D.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor Científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la caracterización de modelos 3D.
- Valor Operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los flujos de trabajo de tinción e imagen.
- Valor Estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción (go/no-go) y la eficiencia del capital al proporcionar datos celulares sólidos desde las primeras etapas del proceso.
- Impacto en el Portafolio: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos basándose en datos de alto contenido obtenidos de modelos 3D.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de cultivos celulares tridimensionales y técnicas avanzadas de imagen.
- Exige acceso a microscopía confocal e infraestructura para análisis de imágenes con resolución subcelular.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de tinción y de adquisición de imágenes para garantizar la reproducibilidad.
- Adaptable a una amplia variedad de modelos de organoides y esferoides con diferentes morfologías y orígenes.
- Es fundamental manipular con cuidado y seguir estrictamente el protocolo para preservar la integridad de la estructura tridimensional.
