Microscopía de barrido con láser confocal de la dinámica del calcio en rodajas agudas de tejido pancreático de ratón

En combinación con imágenes de calcio de células vivas, la técnica de corte de tejido de páncreas agudo permite el estudio de ondas intercelulares y conectividad funcional multicelular con una alta resolución durante largos períodos de tiempo. Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, preserva la arquitectura del tejido y reduce el estrés enzimático y mecánico limitado, manteniendo un alto rendimiento de tejido. Al detectar cambios funcionales y morfológicos durante la progresión de la enfermedad, esta técnica ayuda a nuestra comprensión de las enfermedades relacionadas con el páncreas, como la diabetes.

Esta técnica de corte de tejido se puede aplicar a los tejidos cerebrales, pituitarios y suprarrenales con énfasis en la preservación del contacto intercelular, las interacciones paracrinas y la arquitectura del tejido. Para prepararse para la inyección de agarosa en el páncreas del ratón, llene una jeringa de cinco mililitros con agarosa líquida de 40 grados Celsius y equipe la jeringa con una aguja de calibre 30. Después de cubrir cuidadosamente la aguja con una tapa, coloque el extremo de la aguja de la jeringa hacia abajo, con todo el volumen de agarosa debajo de la superficie del agua, en un baño de agua de 40 grados centígrados.

Burbujear una botella de solución extracelular con carbógeno, continuamente sobre hielo, a 1,5 mililitros por minuto a presión barométrica y temperatura ambiente para asegurar la oxigenación y un pH de 7,4. Para realizar la inyección de agarosa, coloque un ratón adulto sacrificado bajo un microscopio estereoscópico y acceda al abdomen del ratón a través de la laparotomía. Mueva suavemente el intestino hacia el lado izquierdo para exponer el conducto biliar común y use fórceps para levantar ligeramente el extremo duodenal del conducto para localizar la papila de Vater.

Use un hemostático para sujetar el conducto biliar en la papila duodenal para evitar la fuga de la agarosa del conducto al duodeno y use unas pequeñas pinzas afiladas para alcanzar debajo del conducto biliar común para romper la membrana que une el conducto al tejido pancreático. Después de limpiar la mayor cantidad de grasa y tejido conectivo del conducto como sea posible, coloque el conducto perpendicularmente en las puntas de un par de pinzas más grandes y, presionando firmemente el émbolo de la jeringa, inyecte la agarosa líquida viscosa en el extremo proximal del conducto biliar común durante 20 a 30 segundos. Cuando el tejido se vuelva blanquecino y ligeramente distendido, retire la jeringa y vierta lentamente 20 mililitros de la solución extracelular helada burbujeada sobre el páncreas para enfriar el tejido y endurecer la agarosa.

Para adquirir rebanadas de tejido pancreático, use fórceps y tijeras finas y de corte duro para transferir suavemente el páncreas inyectado de agarosa a una placa de Petri de 100 milímetros que contiene 40 mililitros de solución extracelular helada. Gire el plato para enjuagar el tejido y transfiera el páncreas a un segundo plato de solución extracelular helada. Use las pinzas y las tijeras para cortar la sección blanquecina del páncreas bien inyectada en hasta seis piezas de 0,1 a 0,2 centímetros cúbicos y elimine cualquier tejido conectivo y graso restante de las piezas de tejido.

Coloque los bloques limpios en una placa de Petri inferior no pegajosa de 35 milímetros que contenga aproximadamente cinco mililitros de agarosa líquida de 40 grados centígrados e inmediatamente coloque la placa de Petri sobre hielo. Cuando la agarosa se haya endurecido, sostenga la placa de Petri boca abajo sobre la tapa de una placa de Petri de 100 milímetros y use la mitad de una hoja de afeitar para cortar cuidadosamente el margen entre la pared lateral de la placa de Petri y la agarosa para eliminar la agarosa del plato. Use la cuchilla de afeitar para cortar cubos individuales, cada uno con un bloque de tejido de agarosa, de la agarosa liberada y use pegamento de cianoacrilato para unir los bloques a la placa de muestra de un vibratomo.

Llene la cámara de corte del vibratomo con 150 mililitros de solución extracelular helada continuamente burbujeada con carbógeno. Enrosque la placa de muestra en el vibratomo y monte una nueva cuchilla de afeitar. Rodear la cámara con hielo y añadir dos cubitos de hielo de 10 mililitros de volumen hechos con solución extracelular suplementada con glucosa de seis milimolares.

Ajuste la cortadora a 0.05 a 1 milímetro por segundo y 70 hercios, luego comience a cortar para adquirir rodajas de agarosa de 140 micras de espesor con un área de superficie de 20 a 100 milímetros cuadrados. Use un pincel fino para transferir cuidadosamente cada rebanada a una placa de Petri de 100 milímetros llena de 40 milímetros de tampón HEPES complementado con glucosa de seis milimolares. Para la preparación de colorantes de calcio, disuelva 50 microgramos de colorante indicador de calcio permeable a las células, 7,5 microlitros de DMSO y 2,5 microlitros del poloxámero y 6,667 mililitros de HBS en un tubo de tapón de rosca de 15 mililitros.

Use una pipeta para mezclar bien la solución durante 20 segundos antes de sumergir el tubo en una cámara de baño ultrasónica y el vórtice, cada uno durante 30 segundos. A continuación, alícuota 3.333 mililitros de la solución de colorante indicador de calcio resultante en una placa de Petri de 5 mililitros por cada 10 rebanadas de tejido que se etiquetarán. Para la carga de tinte, use un pincel suave y delgado para transferir hasta 10 rodajas de tejido a cada plato de solución de tinte y coloque los platos en un agitador orbital durante 50 minutos a temperatura ambiente y 40 revoluciones por minuto protegidos de la luz.

Al final de la incubación, transfiera hasta 20 rodajas teñidas a placas de Petri individuales de 60 mililitros llenas de HBS sin colorantes. Para las imágenes de calcio por microscopía confocal, seleccione un aumento de 20 o 25 veces y establezca el modo de adquisición en imágenes de lapso de tiempo, el agujero de alfiler de 100 a 200 micras y la excitación y emisión del fluoróforo utilizado en el experimento. Monte la cámara de grabación y el sistema de perfusión en la etapa de temperatura controlada del microscopio y coloque la entrada y la salida en los bordes lejanos de la cámara de grabación.

Establezca las tasas de entrada y salida a uno o dos mililitros por minuto. Ajuste la temperatura del sistema de profusión a 37 grados centígrados e inicie la profusión con la solución no estimulante. Para registrar la dinámica del calcio del tejido, coloque una sola rebanada de tejido en la cámara de grabación e inmovilice el tejido con un peso de platino en forma de U con una malla de nylon tensa.

Utilice la opción de campo brillante para localizar la estructura de interés y utilice imágenes en vivo para posicionar las estructuras estudiadas en el campo de visión. Para optimizar la relación señal-ruido, ajuste la potencia del láser, la amplificación del detector y el binning de promedio de línea mientras mantiene la potencia del láser mínima. Ajuste el plano focal a 15 micras por debajo de la superficie cortada para evitar la grabación de células potencialmente dañadas y adquirir las imágenes.

Ajuste de la frecuencia de muestreo a uno o dos hercios para permitir la detección inicial de oscilaciones individuales y grabar una imagen de alta resolución. Si está disponible, use un gráfico en línea para obtener retroalimentación instantánea sobre la respuesta de preparación, sobre la iluminación, el fotoblanqueo y la deriva mecánica. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, guarde los datos para su posterior análisis.

Aquí se puede observar un ejemplo de una rebanada de tejido óptima en la que el tinte indicador de calcio permeable a la célula se cargó con éxito en la rebanada de tejido pancreático. En contraste, estas rodajas de tejido no son óptimas para la obtención de imágenes debido a una penetración fallida del tinte, la falta de células de los islotes o una abundancia de tejido necrótico en la superficie de las muestras. Las imágenes de alta resolución de una rebanada de tejido pancreático se pueden usar para delinear distintas regiones del tejido pancreático, como los islotes de Langerhans, el tejido acinar o el conducto pancreático.

Los estímulos se pueden utilizar para discriminar funcionalmente entre diferentes células de los islotes o entre las células de los islotes y las células no islotes. Por ejemplo, las células beta generalmente responden a una estimulación de glucosa de pulso cuadrado exhibiendo un aumento transitorio en el calcio intracelular seguido de una rápida oscilación del calcio en una meseta sostenida. En contraste, las células no beta responden con oscilaciones más rápidas e irregulares.

También se puede medir un retraso en el inicio del aumento de calcio intracelular después de la estimulación, así como la heterogeneidad y los retrasos entre las células individuales. Los mismos parámetros se pueden utilizar para describir la fase de desactivación. Aquí se puede observar una presentación esquemática de la duración, frecuencia y porcentaje de la oscilación del calcio intracelular del tiempo activo.

Cuando se toman imágenes a tasas de adquisición superiores a 10 hercios, se pueden reconocer claramente las ondas de calcio que se propagan repetidamente a través del islote. Pinte el conducto biliar común lo más cerca posible del duodeno para evitar ocluir accidentalmente la rama que ingresa al páncreas. Además, no deje de deprimir el émbolo durante la inyección porque la agarosa se endurecerá inmediatamente en la aguja.

La técnica de corte agudo de tejido pancreático de ratón también se puede utilizar con el método de pinza de parche para estudiar las corrientes de los canales iónicos y la citosis de acceso, así como los estudios de inmunohistoquímica y los estudios de secretaría.