Name: Protocolos de PCR digital de gotas con transcripción inversa de dos pasos para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprende a desarrollar ensayos multiplex de PCR digital en gotas para detectar y cuantificar SARS-CoV-2 con alta sensibilidad. Este protocolo detallado permite la detección simultánea de hasta cuatro objetivos genéticos en una sola muestra.

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Esta investigación fue financiada por el Megaproyecto de Control de Enfermedades Infecciosas del Ministerio de Salud de China, número de subvención 2017ZX10302301-005 y el Centro de Investigación Conjunta Sino-África, número de subvención SAJC201605.

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<li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701(2020).</li>
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<li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis%2C+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge%5BTitle%5D)+AND+%22medRxiv%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li>
<li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Hay pocos recursos disponibles sobre cómo desarrollar ensayos RT-ddPCR para la detección del SARS-CoV-2. Aunque no se utiliza en este artículo, las muestras estándar con copias conocidas se pueden utilizar para desarrollar y optimizar ensayos. Sin embargo, en este trabajo, las muestras de SARS-CoV-2 cultivadas en células Vero-E6 se enriquecieron en un fondo de ARN genómico humano y se utilizaron como muestras estándar para desarrollar los ensayos. Las secuencias adecuadas de cebadores y sondas son esenciales al desarroll...

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), una técnica bien reconocida, ha sufrido varias transformaciones desde su advenimiento para convertirse en una técnica poderosa capaz de proporcionar respuestas a la investigación de ácidos nucleicos. Estas transformaciones han sido una mejora constante de la vieja técnica. Estas transformaciones se pueden resumir en tres generaciones1. La primera generación es la PCR convencional que se basa en la electroforesis en gel para cuantificar y detectar objetivos amplificados. La segunda generación es la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) que puede detectar muestras en tiempo real y basarse en una curva estándar para cuantificar directamente los objetivos en una muestra. La tercera generación, la PCR digital (dPCR), puede realizar tanto la detección como la cuantificación absoluta de objetivos de ácidos nucleicos sin necesidad de una curva estándar. La dPCR también se ha mejorado aún más a partir de cámaras de reacción separadas por los pozos de una pared en emulsiones de aceite, agua y productos químicos estabilizadores dentro del mismo pozo, como se ve en laPCR digital 2 basada en gotas. En la PCR digital de gotas (ddPCR), una muestra se divide en miles de gotas de tamaño nanolitro que contienen objetivos individuales que luego se cuantificarán utilizando las estadísticas de Poisson 2,3,4. Esta técnica le da a ddPCR una ventaja en la cuantificación de objetivos poco abundantes en comparación con las otras generaciones de PCR.
Recientemente, múltiples aplicaciones han puesto de relieve la superioridad de la ddPCR sobre la qPCR comúnmente utilizada al detectar y cuantificar objetivos de baja abundancia 1,5,6. El SARS-CoV-2 no es una excepción a estas aplicaciones 7,8,9,10,11,12. Desde el brote de SARS-CoV-2, los científicos han estado trabajando en todos los frentes para encontrar soluciones sobre cómo diagnosticar el virus y detectarlo de manera eficiente. El estándar de oro actual sigue siendo qPCR13. Sin embargo, se ha demostrado que la RT-ddPCR es más precisa en la detección de objetivos de SARS-CoV-2 de baja abundancia tanto en muestras ambientales como clínicas en comparación con RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. La mayoría de los trabajos publicados de ddPCR del SARS-CoV-2 dependen de ensayos simples, y los multiplexores dependen de ensayos comerciales. Por lo tanto, se debe hacer más para explicar cómo desarrollar ensayos RT-dPCR multiplex para la detección del SARS-CoV-2.
En un diseño de ensayo adecuado, la multiplexación se puede utilizar para ahorrar costos, aumentar el rendimiento de la muestra y maximizar el número de objetivos que se pueden detectar con sensibilidad dentro de una muestra pequeña. Al multiplexar con ddPCR, se debe tener en cuenta cuántos fluoróforos se pueden detectar en un sistema en particular. Algunas plataformas ddPCR pueden admitir hasta tres canales, mientras que otras solo admiten dos canales. Por lo tanto, cuando se multiplexa con dos canales, uno tiene que usar diferentes enfoques, incluida la multiplexación de orden superior para detectar más de dos objetivos14,15,16. En este trabajo, se utiliza un sistema de detección ddPCR de dos colores para mostrar los pasos sobre cómo desarrollar diferentes ensayos RT-ddPCR del SARS-CoV-2 que se pueden adaptar para diferentes aplicaciones de investigación.

<table><tbody><tr><td>Extractor de ácidos nucleicos totalmente automático de 32 canales Purificador 32</td><td>Genfine Biotech</td><td>FHT101-32</td><td>Extractor automatizado para ARN</td></tr><tr><td>AutoDG Aceite para sondas</td><td>BioRad</td><td>12003017</td><td>QX200 AutoDG consumible</td></tr><tr><td>ddPCR Placas de 96 pocillos</td><td>BioRad</td><td>12003185</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix para sondas (sin dUTP)</td><td>BioRad</td><td>1863024</td><td>Fabricación de la mezcla maestra del ensayo ddPCR</td></tr><tr><td>Cartuchos DG32 AutoDG BioRad</td><td></td><td>1864108</td><td>QX200 Consumible AutoDG</td></tr><tr><td>Olla de baño de agua termostática electrónica</td><td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td><td>XMTD-8000</td><td>Inactivación térmica de muestras</td></tr><tr><td>FineMag Rapid Bead Virus Kit de extracción de ADN/ARN Genfine</td><td>Biotech</td><td>FMY502T5</td><td>Extracción de perlas magnéticas de muestras de ARN inactivado</td></tr><tr><td>Sellos térmicos</td> <td>de lámina perforableBioRad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta para el AutoDG</td><td>BioRad</td><td>1864120</td><td>QX200 AutoDG consumibles</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta Contenedores de residuos para el AutoDG BioRad</td><td></td><td>1864125</td><td>QX200 Consumible AutoDG</td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix (perfecto en tiempo real)</td><td>TaKaRa</td><td>RR036A</td><td>Generación de ADNc</td></tr><tr><td>PX1 Sellador de placas PCR</td><td>BioRad</td><td>1814000</td><td>Selle la placa de gotas de Software AutoDG</td></tr><tr><td>QuantaSoft 1.7 BioRad</td><td></td><td>10026368</td><td>Adquisición y análisis de datos</td></tr><tr><td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td><td>BioRad</td><td>N/A</td><td>Análisis de datos</td></tr><tr><td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td><td>BioRad</td><td>1864101</td><td>QX200 Consumible AutoDG</td></tr><tr><td>QX200 Lector de gotas BioRad</td><td></td><td>1864003</td><td>Lectura de gotas y adquisición de datos</td></tr><tr><td>T100 Termociclador</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>Amplificación de dianas (PCR) y generación de ADNc</td></tr></tbody></table>

protocolos de pcr digital de gotas con transcripción inversa de dos pasos para la detección y cuantificación del sars-cov-2

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

El diagnóstico de la actual pandemia de SARS-CoV-2 es una prioridad para todos los países del mundo. Actualmente, la PCR cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR) es el estándar de oro para el diagnóstico del SARS-CoV-2, ya que no hay una solución permanente disponible. Por muy efectiva que pueda ser esta técnica, han surgido investigaciones que muestran sus limitaciones en la detección y el diagnóstico, especialmente cuando se trata de objetivos poco abundantes. Por el contrario, se ha demostrado que la PCR digital por gotas (ddPCR), una tecnología emergente reciente con ventajas superiores a la qPCR, supera los desafíos de la RT-qPCR en el diagnóstico del SARS-CoV-2 a partir de muestras objetivo poco abundantes. Prospectivamente, en este artículo, las capacidades de RT-ddPCR se amplían aún más al mostrar los pasos sobre cómo desarrollar ensayos simplex, dúplex, mezcla de sonda triplex y cuádruples utilizando un sistema de detección de dos colores. Usando cebadores y sondas dirigidas a sitios específicos del genoma del SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 y RBD2), se demuestra que el desarrollo de estos ensayos es posible. Además, se proporcionan protocolos detallados paso a paso, notas y sugerencias sobre cómo mejorar el flujo de trabajo de ensayos y analizar datos. La adaptación de este flujo de trabajo en trabajos futuros garantizará que el número máximo de objetivos se pueda detectar con sensibilidad en una muestra pequeña, lo que mejorará significativamente el costo y el rendimiento de la muestra.

En un estudio de prueba de concepto, el rendimiento analítico de los ensayos multiplex se probó en muestras clínicas y de investigación19. El rendimiento de los ensayos multiplex fue superior al de una RT-PCR19. Dado que un número bajo de gotitas puede indicar un problema durante la generación de gotas, en este artículo se estableció un límite de 10,000 gotas por pocillo basado en datos empíricos.
Una buena separación entre gotas positivas y nega...

Este trabajo resume los pasos para desarrollar diferentes ensayos para la detección del SARS-CoV-2 utilizando un sistema ddPCR de dos colores. Los pasos son elaborados y se han incluido notas sobre cómo mejorar los ensayos y el rendimiento del experimento. Estos ensayos se pueden utilizar para múltiples aplicaciones RT-ddPCR del SARS-CoV-2.

Protocolos de PCR digital de gotas con transcripción inversa de dos pasos para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Estos protocolos se pueden utilizar para desarrollar ensayos internos de ddPCR multiplex para la detección del SARS-CoV-2 utilizando un sistema ddPCR de dos colores. Esto es útil para las personas que desean desarrollar sus propios kits para la detección del SARS-CoV-2 y otros patógenos. En comparación con la RT-qPCR estándar de oro, la RT-ddPCR se puede utilizar para cuantificar múltiples genes del SARS-CoV-2 sin la necesidad de una curva estándar.Dado que la ddPCR es una técnica emergente, la demostración visual es importante para ayudar a los usuarios actuales y futuros a comprender y desarrollar fácilmente ensayos multiplex para la detección del SARS-CoV-2 y otros patógenos. Para la síntesis de ADNc, agregue dos microlitros de mezcla maestra de transcripción inversa 5X, cinco microlitros de la muestra de ARN de interés y tres microlitros de agua doble destilada libre de RNasa en un tubo de PCR de 100 o 200 microlitros a un volumen final de 10 microlitros como solución, y coloque el tubo en hielo. Cuando se hayan agregado los reactivos, cargue la muestra en un termociclador y configure el instrumento para ejecutar una transcripción inversa a 37 grados centígrados durante 15 minutos, una inactivación térmica de la transcripción inversa durante 5 segundos a 85 grados centígrados y una retención infinita final a cuatro grados centígrados.Antes de realizar la PCR digital de gotas, agregue 19,8 microlitros de mezcla maestra recién preparada al número apropiado de pocillos de una placa de PCR digital de 96 pocillos libre de nucleasas. Agregue 2,2 microlitros de ADNc a cada pocillo de mezcla maestra a un volumen final de 22 microlitros de mezcla de reacción por pocillo y selle la placa con un sellador de placas de PCR desechable. Luego, haga un vórtice de la placa durante 15 a 30 segundos en centrífuga durante 10 a 15 segundos para recoger el contenido del pozo en el fondo de la placa.Para la generación automatizada de gotas en la pantalla táctil del generador automatizado de gotas, haga clic en configurar placa de muestra y seleccione las columnas en las que se encuentran las muestras en la placa de muestra. Haga clic en Aceptar y abra la puerta del generador de gotas automatizado. Cargue las placas de generación de muestras y gotas y los demás materiales necesarios para el experimento en las ubicaciones respectivas dentro del instrumento y cierre la puerta.Cuando la pantalla táctil se vuelva verde, lo que indica que todos los materiales se han cargado en sus posiciones correctas, seleccione aceite para las sondas y comience la generación de gotas. Espere a que la generación de gotas se ejecute hasta su finalización de acuerdo con el tiempo indicado en la pantalla. Cuando la pantalla diga Gotlets listos, abra la puerta para quitar la placa que contiene las gotas y use un sellador de placas durante cinco segundos a 180 grados centígrados para sellar la placa con un sello de lámina perforable.Dentro de los 30 minutos posteriores a la generación de gotas, coloque la placa de gotas sellada en un termociclador de pozo de 96 pozos profundos. Ajuste el volumen de muestra a 40 microlitros y la temperatura de la tapa a 105 grados centígrados. Luego, la PCR amplifica las gotitas.Para la lectura de gotas, después de la amplificación, transfiera la placa de 96 pocillos con ciclo térmico a un lector de gotas y abra el software que lo acompaña en una computadora conectada al lector de gotas. En el modo de configuración, seleccione Nuevo y haga doble clic en cualquier pozo para abrir el cuadro de diálogo del editor de pozos. Seleccione los pocillos a leer y establezca el experimento en cuantificación absoluta, supermezcla a supermezcla de PCR digital de gotas para sondas.Apunte un tipo al canal 1 desconocido y el tipo dos al canal 2 desconocido. Asigne los nombres de muestra según el diseño de la placa y haga clic en aplicar y aceptar. Después de guardar la plantilla, haga clic en Ejecutar.Cuando el software se lo solicite, seleccione el color FAM/HEX. Al final de la adquisición de datos, retire la placa del lector. Antes de analizar los datos, verifique los datos de todos los pozos para obtener el número total de gotas.Y establezca un límite para aceptar un número mínimo de gotitas que se contarán como resultados positivos o negativos. Para el análisis de ensayos símplex y dúplex, haga doble clic en el archivo QLP que se va a analizar y seleccione Analizar. Utilice las herramientas de amplitud 1D y umbral de amplitud 2D para distinguir entre las gotas positivas y negativas para cada pocillo en el canal correcto, utilizando el control de plantilla de nodo y las muestras de control positivo como guía.A continuación, exporte los resultados como un archivo CSV para un análisis adicional. Para un ensayo de mezcla de sonda triplex, abra el archivo QLP y seleccione los pocillos que se analizarán en la pestaña del editor de placas. Establezca el tipo de experimento en cuantificación directa y el ensayo en mezcla de sonda triplex, e introduzca el nombre del objetivo.A continuación, haga clic en Aplicar. Utilice las herramientas de gráficos para asignar colores específicos a diferentes clústeres de destino según las sugerencias emergentes de la ventana seleccionada para asignar clústeres. Cuando se hayan asignado todos los colores objetivo, los datos de cuantificación se mostrarán en la ventana de datos del pozo.Exporte los datos como un archivo CSV para el análisis posterior. Para un ensayo cuádruplex, establezca el tipo de experimento en cuantificación directa y el ensayo en múltiplex de amplitud. Introduzca el nombre de destino y haga clic en Aplicar.Utilice las herramientas de gráficos para asignar colores específicos a diferentes clústeres de destino según las sugerencias emergentes de la ventana seleccionada para asignar clústeres. Cuando se hayan asignado todos los colores objetivo, los datos de cuantificación se mostrarán en la ventana de datos del pozo. Exporte los datos como un archivo CSV para un análisis adicional.Como se observó en este análisis representativo del gradiente de temperatura, las temperaturas más altas de rodillas no pudieron distinguir claramente las gotas positivas de las negativas cuando se realizó un ensayo dúplex. Sin embargo, con una disminución en la temperatura de rodillas, se logró una separación óptima entre gotas positivas y negativas. Utilizando un sistema de detección de PCR digital de gotas RT de dos colores, es posible detectar uno, dos, tres y cuatro objetivos de SARS-CoV-2 dentro de una sola muestra.Se puede usar una muestra de control sin plantilla para localizar gotas negativas para ayudar a establecer el umbral negativo en ensayos simplex. En los ensayos dúplex, el análisis se puede realizar en canales individuales o en la amplitud 2D. Aunque el análisis de datos de ensayos multiplex de orden superior no es sencillo, estos ensayos son útiles, ya que permiten evaluar hasta ocho grupos de gotas en ensayos de mezcla de sonda triplex y hasta 16 grupos de gotas para ensayos basados en amplitud cuádruplex.Dependiendo del ensayo que se vaya a desarrollar, asegúrese de que se agreguen las concentraciones correctas de cebador y sonda a la mezcla maestra. Usando este procedimiento, se pueden alternar los objetivos para desarrollar nuevos ensayos de RT-ddPCR. Estos ensayos se pueden utilizar para diferentes propósitos de investigación o para el diagnóstico de enfermedades infecciosas emergentes.Desde su desarrollo, esta técnica se ha utilizado para la determinación precisa de copias de ácidos nucleicos virales en diferentes estándares, el cuerpo humano y muestras ambientales.

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Investigación

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Biología

Este video muestra un método cuantitativo para detectar infecciones virales utilizando PCR con transcripción inversa en tiempo real. El paso de transcripción inversa convierte el ARN en ADNc, que luego se amplifica a través de ciclos de PCR. La presencia de ARN viral en la muestra se confirma mediante el análisis de las curvas de amplificación y disociación del ADN obtenidas de la PCR.

PCR cuantitativa con transcripción inversa en tiempo real para el diagnóstico de infecciones virales

Un proyecto de ciencia ciudadana fue diseñado para reclutar residentes de San Diego para recolectar muestras ambientales para el SARS-CoV-2. Se creó una plataforma multilingüe basada en la web para el envío de datos utilizando una interfaz de dispositivo móvil fácil de usar. Un sistema de gestión de la información de laboratorio facilitó la recolección de miles de muestras geográficamente diversas con seguimiento de resultados en tiempo real.

Hisopado del medio ambiente urbano - Una tubería para el muestreo y la detección del SARS-CoV-2 de los embalses ambientales

El protocolo describe un método de diagnóstico de SARS-CoV-2 que utiliza la automatización de código abierto para realizar pruebas moleculares RT-qPCR de muestras de saliva. Este enfoque escalable se puede aplicar a la vigilancia clínica de la salud pública, así como para aumentar la capacidad de los laboratorios universitarios más pequeños.

Estrategia eficiente de diagnóstico de saliva por PCR con transcriptasa inversa cuantitativa del SARS-CoV-2 utilizando robots pipeteadores de código abierto

Este protocolo describe el método detallado de PCR digital de gotas (dd-PCR) para la cuantificación precisa de los niveles de ARN circular (circRNA) en células utilizando cebadores divergentes.

Cuantificación de ARN circulares mediante PCR digital de gotas

Este protocolo tiene como objetivo cuantificar el ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire para ser utilizado en estudios epidemiológicos basados en aguas residuales y evaluar el riesgo de exposición al SARS-CoV-2 en aerosoles interiores y exteriores. Este protocolo también describe un enfoque de secuenciación de plantilla larga de amplicón en mosaico para la caracterización del genoma completo del SARS-CoV-2.

Cuantificación y caracterización del genoma completo del ARN del SARS-CoV-2 en muestras de aguas residuales y aire

Aquí proporcionamos un protocolo completo para estandarizar e implementar el método de detección del virus SARS-CoV-2 en muestras humanas mediante amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa (RT-LAMP). Este método, realizado en 60 minutos, podría adaptarse a cualquier laboratorio o punto de atención a un bajo costo y utilizando equipos económicos.

Detección del virus SARS-CoV-2 mediante amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa

Presentamos dos kits internos de RT-qPCR de un solo paso basados en sondas para virus respiratorios comunes. El primer ensayo es para SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 y H3N2) e influenza B. El segundo es para SARS-Cov-2 (N) y MERS (UpE y ORF1a). Estos ensayos se pueden implementar con éxito en cualquier laboratorio especializado.

Desarrollo de ensayos multiplex de RT-qPCR en tiempo real para la detección de SARS-CoV-2, influenza A/B y MERS-CoV

La cuantificación precisa de las copias del genoma del vector de virus adenoasociados (AAV) es fundamental, pero aún no se ha establecido un protocolo estandarizado. Este protocolo describe un método validado para preparar muestras purificadas de AAV y realizar una reacción en cadena de la polimerasa (dd_PCR) digital para cuantificar de forma fiable el título del genoma viral.

Cuantificación de genomas virales adenoasociados en muestras de vectores purificadas mediante reacción en cadena de la polimerasa por gotas digitales

Un método de bajo costo, de alto rendimiento para la detección simultánea de hasta 43 blancos moleculares se describe. Las solicitudes de MPCR / RLB son la tipificación de microorganismos y la detección de múltiples patógenos de muestras clínicas.

Multiplex PCR y Blot Línea ensayo de hibridación reversa (MPCR / RLB)

El kit de detección de Mycoplasma LookOut PCR utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se ha establecido como el método de elección para la mayor sensibilidad en la detección de contaminación por Mycoplasma, Acholeplasma y Ureaplasma en cultivos celulares y cultivo celular otros derivados biológicos.

PCR optimizado basado en la detección de Mycoplasma

Aprende a desarrollar ensayos multiplex de PCR digital en gotas para detectar y cuantificar SARS-CoV-2 con alta sensibilidad. Este protocolo detallado permite la detección simultánea de hasta cuatro objetivos genéticos en una sola muestra.

Protocolos de PCR digital de gotas con transcripción inversa de dos pasos para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2

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