Name: Generación y cultivo de organoides linguales derivados de células madre gustales de ratones adultos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprende a generar organoides linguales a partir de células madre gustales de ratones adultos mediante FACS y cultivo 3D. Este protocolo estandarizado permite estudiar el desarrollo y regeneración de células receptoras del gusto in vitro.

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Los autores desean agradecer al Dr. Peter Dempsey y Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) por proporcionar medios condicionados por WNR y discusiones valiosas. También agradecemos a los Recursos Compartidos de Tecnologías Celulares y Citometría de Flujo del Centro de Cáncer de la Universidad de Colorado, especialmente a Dmitry Baturin, por su experiencia en clasificación celular. Este trabajo fue financiado por: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, y NIH/NCI R21 CA236480 a LAB, y R21DC016131 y R21DC016131-02S1 a DG, y F32 DC015958 a EJG.

Todos los procedimientos con animales se realizaron en una instalación acreditada por AAALAC de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, la Ley de Bienestar Animal y la Política de Servicio de Salud Pública, y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado. Los ratones Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 utilizados en este protocolo son de The Jackson Laboratory, Stock No. 008875.
NOTA: Los siguientes pasos deben completarse antes de comenzar para garantizar una progresión suave y oportuna del protocolo: establecer el baño de agua a 37 ° C, configurar la centrífuga a 4 ° C, hacer soluciones enzimáticas de inyección y disociación de las soluciones de stock de 10 mg / ml de dispasa, colagenasa y elastasa (consulte la Tabla de materiales),eliminar el gel de matriz del congelador de -20 ° C (~ 750 μL necesario para una placa de 48 pozos) y descongelar sumergiendo el vial en hielo para en un al menos 3-4 h, tubos de microcentrífuga pre-recubrimiento en FBS sin diluir balanceándose suavemente a temperatura ambiente durante al menos 30 min (dos tubos de 2 ml para la recolección de tejidos, dos tubos de 1,5 ml para células disociadas y un tubo de 1,5 ml para la recolección de células individuales del clasificador celular; elimine el exceso de FBS antes de su uso).
1. Aislamiento del epitelio CVP
NOTA: Para obtener suficientes células LGR5+ para una placa completa de 48 pomos, recoja tres CVP Lgr5-EGFP en el mismo tubo y procese simultáneamente. Es importante destacar que cosecha y procesa el CVP de al menos un compañero de camada de tipo silvestre en paralelo en un tubo separado y utilícelo como un control de gating para establecer los parámetros de FACS (consulte Resultados representativos).
<ol><li>Eutanasiar a los ratones con asfixia por CO2 de acuerdo con las regulaciones de la IACUC, seguido de un método secundario aprobado como la toracotomía bilateral, la dislocación cervical, la decapitación o la exsanguinación.</li>
	<li>Use tijeras de disección estériles grandes para cortar las mejillas y romper la mandíbula. Levante la lengua y corte el frenillo lingual para separar la lengua del piso de la cavidad oral. Cortar la lengua y recogerla en solución salina tamponada con fosfato (dPBS) estéril y helada de Dulbecco con Ca2+ y Mg2+.</li>
	<li>Retire y deseche la lengua anterior cortando justo la parte anterior de la eminencia intermolar con una cuchilla de afeitar(Figura 1A,línea discontinua). Use una delicada toallita para tareas para eliminar el vello y el exceso de líquido de la lengua posterior.</li>
	<li>Llene 1 ml de jeringa con 200-300 μL de solución enzimática inyectable (concentración final: 2 mg/ml de colagenasa tipo I y 5 mg/ml de dispasa II en Ca2+/Mg2+que contenga dPBS, diluida a partir de soluciones madre de 10 mg/ml) e inserte una aguja de 30 G x 1/2 justo encima de la eminencia intermolar(Figura 1B,flecha negra)hasta justo antes de la CVP(Figura 1B, Figura 1B), caja negra). Inyecte la solución enzimática debajo y en los bordes laterales de la CVP entre el epitelio y los tejidos subyacentes (lámina propia, músculo). Retire la jeringa lenta y continuamente de la lengua a medida que se realiza la inyección.</li>
	<li>Incubar la lengua en dPBS estériles libres de Ca2+/Mg2+a temperatura ambiente durante exactamente 33 min.</li>
	<li>Haga pequeños cortes en el epitelio bilateralmente y justo antes de la CVP usando tijeras de disección extra finas, y pele suavemente el epitelio levantándolo con fórceps finas. Una vez que el epitelio de la zanja esté libre del tejido conectivo subyacente, colóquelo en un tubo de microcentrífuga vacío de 2 ml pre-recubierto con FBS. Realice el recorte epitelial antes o después de separar el epitelio CVP(Figura 1C,D).</li>
</ol>2. Disociación del epitelio CVP
NOTA: La disociación del epitelio CVP y el chapado se representan gráficamente en la Figura 2.
<ol><li>Añadir el cóctel enzimático de disociación (concentración final: 2 mg/mL de colagenasa tipo I, 2 mg/ml de elastasa y 5 mg/ml de dispasa II en Ca2+/Mg2+que contiene dPBS, diluido a partir de soluciones madre de 10 mg/ml) a los tubos que contienen epitelios CVP pelados (200 μL por CVP). Incubar en un baño de agua a 37 °C durante 45 min. Vórtice brevemente cada 15 min. NOTA: Precalentado 0.25% de Tripsina-EDTA en baño de agua a 37 °C durante los últimos 15 min de incubación del cóctel de enzimas.</li>
	<li>Después de la incubación, el vórtice (tres pulsos) luego tritura con una pipeta Pasteur de vidrio durante 1 min. Después de que las piezas de tejido se asienten, pipetee el sobrenadante que contiene la primera colección de células disociadas, en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml recubiertos de FBS correspondientes al genotipo. Procese las piezas de tejido restantes como se describe en el paso 2.3. abajo.<ol>
<li>Girar el sobrenadante durante 5 min a 370 x g y 4 °C a las células de pellets.</li>
		<li>Retire el sobrenadante resultante y resuspante el pellet celular en tampón de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) (1 mM EDTA, 25 mM HEPES (pH 7.0) y 1% FBS en Ca2+/ Mg2+-libre de PBS (50 μL por CVP)). Almacenar en hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mientras lleva a cabo los pasos 2.2.1 y 2.2.2, disociar las piezas de tejido restantes del paso 2.2 agregando tripsina-EDTA al 0,25% precalentadas (200 μL por CVP) a los tubos originales de microcentrífuga de 2 ml e incube en un baño de agua de 37 °C durante 30 min. Vórtice brevemente cada 10 min.</li>
	<li>Después de la incubación, vórtice el tubo que contiene piezas de tejido (tres pulsos) y luego triture con una pipeta Pasteur de vidrio durante 1 min. Después de que las piezas de tejido se asienten, pipetee el sobrenadante en los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contienen células del paso 2.2.2. Deseche los tubos que contienen las piezas de tejido restantes.<ol>
<li>Girar los tubos con células disociadas durante 5 min a 370 x g y 4 °C a células de pellets.</li>
		<li>Retire los gránulos de células sobrenadantes y resuspend en FACS Buffer (100 μL por CVP). Almacenar en hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pase las células a través de un filtro de malla de nylon de 30 μm y agregue DAPI(emisión de λ = 450 nm) a las mezclas celulares antes de FACS. Aislar células Lgr5-GFP+ vía FACS utilizando el canal de proteína fluorescente verde(excitación λ = 488 nm;emisión λ = 530 nm). Clasificar las células usando una boquilla de 100 μm en un tubo de microcentrífuga fresco recubierto de FBS de 1,5 ml que contenga 300 μL de Ca2+/ Mg2+ dPBS libre. Coloque las células sobre hielo hasta que se enchapar.</li>
</ol>3. Recubrimiento de células Lgr5-EGFP
<ol><li>Determine el volumen de suspensión celular LGR5+ recibido del citómetro de flujo.</li>
	<li>En función del número de celdas obtenidas del clasificador, calcule el número de células por μL. Luego, determine el volumen necesario para obtener el número deseado de células para el recubrimiento (usamos 200 células por pozo de una placa de 48 pozos) y transfiera ese volumen total de células suspendidas a un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Gire el tubo durante 5 minutos a 370 x g y 4 °C a las células de pellet (el pellet puede no ser visible). Retire el sobrenadante y coloque el tubo sobre hielo.</li>
	<li>Resuspenda suavemente el pellet celular en la cantidad adecuada de gel de matriz (15 μL por pozo para placas de 48 pozos); pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para distribuir completamente las células en gel de matriz. Coloque 15 μL de gel de matriz/mezcla celular en el centro de cada pozo. Mantenga el tubo de la microcentrífuga sobre hielo en un tubo cónico de 50 ml durante el recubrimiento para evitar que el gel de matriz se gelifique. Continúe mezclando la mezcla de gel de matriz / célula a lo largo del revestimiento mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo cada tres pozos para garantizar una distribución uniforme de las células a través de los pozos.</li>
	<li>Coloque la placa en la incubadora (37 ° C, 5% de CO2,~ 95% de humedad) durante 10 minutos para permitir la gelificación del gel de matriz. Luego, agregue 300 μL de medios WENRAS + Y27632 a temperatura ambiente a cada pozo y devuelva la placa a la incubadora.</li>
</ol>4. Mantenimiento de organoides
NOTA: Los organoides se cultivan en medios organoides convencionales (WENR) que comprenden EGF recombinante y 50% de medios acondicionados que contienen Wnt3a, Noggin y R-spondin23. Los fármacos A8301 y SB202190 se agregan durante los primeros 6 días del período de cultivo para optimizar el crecimiento (WENRAS media) (Figura 5), luego se eliminan para promover la diferenciación (WENR media)20. Y27632 se agrega durante los primeros 2 días de cultivo para promover la supervivencia. Las condiciones de los medios en relación con la línea de tiempo de la cultura se presentan en la Figura 4.
<ol><li>Dos días después del chapado, retire los medios WENRAS + Y27632 de cada pozo utilizando una pipeta de 1 ml, asegurando que no haya contaminación cruzada. Agregue 300 μL de medios WENRAS por el lado del pozo para no interrumpir el gel de la matriz. Devuelva la placa a la incubadora.</li>
	<li>Cambiar los medios cada 2 días, utilizando los medios apropiados para la etapa de cultivo (Figura 4). Mantenga los organoides hasta el día 12, cuando los organoides estén listos para cosechar.</li>
</ol>5. Procesamiento de ARN
<ol><li>Recolección de organoides para ARN<ol>
<li>Coloque la placa de 48 pozos sobre hielo durante 30 minutos para despolimerizar el gel de matriz.</li>
		<li>Usando una pipeta de 1 ml, tire hacia arriba de los medios organoides; luego, a medida que el medio se devuelve al pozo, use la punta de la pipeta para rayar y romper aún más el gel de la matriz. Transfiera el contenido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, agrupando el contenido de tres pozos en un tubo. Centrifugar los tubos durante 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire la mayor cantidad posible de sobrenadante de medios sin eliminar ningún organoide; luego, vuelva a girar los tubos durante 5 minutos a 300 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire los medios restantes y resuspónda los organoides en tampón de lisis de 350 μL + β-mercaptoetanol (βME) (10 μL βME por tampón de lisis de 1 ml). Coloque las muestras en hielo para la extracción inmediata de ARN o guárdelo a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis cuantitativo de RT-PCR<ol>
<li>Mida la cantidad de ARN mediante espectrofotómetro. Transcribir inversamente el ARN utilizando un kit de síntesis de ADNc.</li>
		<li>Mezclar aDNc equivalente a ARN de 5 ng con cebadores de avance y retroceso prevalidados de 200 nM (Tabla 1) y Master Mix de PCR fluorescente. Ejecute la reacción qRT-PCR durante 40 ciclos a: 95 °C durante 15 s, luego a 60 °C durante 60 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Inmunohistoquímica
<ol><li>Recolección y fijación de los organoides<ol>
<li>Coloque la placa de 48 pozos sobre hielo durante 30 minutos para aflojar el gel de matriz.</li>
		<li>Retire los medios organoides y agregue 400 μL de PBS helado a cada pozo. Luego, retire el PBS y agregue 400 μL de solución de recuperación celular helada a cada pozo. Balancear suavemente a 4 °C durante 30 min.</li>
		<li>Cubra una punta de pipeta de 1 ml con 1% de BSA en PBS, y pipetee suavemente el contenido del pozo hacia arriba y hacia abajo para romper el gel de matriz. Transfiera los organoides a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml colocado sobre hielo.</li>
		<li>Enjuague cada pozo con 300 μL PBS + 1% BSA y transfiera los organoides restantes a los tubos correspondientes. Retire Cell Recovery Solution/PBS + BSA de cada tubo. Agregue 400 μL de PBS helado, luego repita con otro enjuague de PBS helado.</li>
		<li>Retire el PBS y fije los organoides con 300 μL de PFA al 4% en frío (en 0,1 M PB) durante 20 min, incubando a temperatura ambiente. Retire el PFA y enjuague los organoides con PBS helado de 400 μL.</li>
		<li>Eliminar PBS; luego, agregue 400 μL PBS + 1% BSA. Conservar a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tinción por inmunofluorescencia<ol>
<li>Enjuague los organoides en 500 μL PBS + 1% BSA. Luego, incube los organoides en solución bloqueadora (5% de suero normal de cabra o burro, 1% de albúmina sérica bovina, Tritón X 100 al 0,3% en 1x PBS pH 7.3) durante 2 h, balanceándose suavemente a temperatura ambiente.</li>
		<li>Añadir la solución de anticuerpos primarios (anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo) y escríerla suavemente durante 3 noches a 4 °C.</li>
		<li>Lave los organoides 4x durante 1 h con PBS de 500 μL + Tritón al 0,2%, balanceándose suavemente a temperatura ambiente. Añadir solución secundaria de anticuerpos (anticuerpos secundarios diluidos en solución bloqueante) y organoides de roca durante la noche, protegidos de la luz, a 4 °C.</li>
		<li>Lave los organoides 3x durante 1 h con PBS de 500 μL + Tritón al 0,2%, protegido de la luz y balanceándose suavemente a temperatura ambiente. Incubar con DAPI diluido 1:10.000 en PB de 0,1 M durante 20 min, balanceando y cubriendo a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar los organoides 3x durante 20 min con 0.1 M PB, balanceándolos suavemente y cubiertos a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montaje deslizante de organoides para microscopía confocal invertida. NOTA: Las imágenes paso a paso del proceso de montaje de diapositivas se muestran en la Figura 7.<ol>
<li>Cree un perímetro cuadrado de ~ 1 mm de espesor de 22 x 22 mm de arcilla de modelado no tóxica en un portaobjetos de microscopio.</li>
		<li>Retire 0,1 M pb del tubo de la microcentrífuga y resuspenda suavemente los organoides en el medio de montaje de 100 μL de su elección; luego, transfiera al centro del cuadrado de arcilla.</li>
		<li>Llene el cuadrado de arcilla hasta que el medio de montaje esté casi en la parte superior. Luego, coloque la cubierta cuadrada de 22 x 22 mm sobre arcilla y presione firmemente hacia abajo en los lados de la cubierta para sellar. Deje que se cure de acuerdo con las instrucciones del fabricante (aquí, a temperatura ambiente durante 1-2 días) y guárdelo a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí se informa que es un método eficiente y fácilmente repetible para cultivar, mantener y procesar organoides linguales derivados de células madre gustales de ratones adultos. Se encontró que el uso de tres CVP de ratones Lgr5-EGFP de 8 a 20 semanas de edad es suficiente para obtener ~ 10,000 células GFP+ para uso experimental, lo que resulta en 50 pomos chapados a una densidad de 200 células por pozo en placas de 48 pomos. La eliminación de los epitelios de zanja CVP se optimiza inyectando el epite...

En roedores, las papilas gustativas linguales se alojan en papilas fungiformes distribuidas anteriormente, papilas foliadas bilaterales posteriormente, así como una sola papila circunvalada (CVP) en la línea media posterodorsal de la lengua1. Cada papila gustativa está compuesta por 50-100 células receptoras del gusto (TRC) de corta duración y rápida renovación, que incluyen células de soporte tipo I similares a las gliales, células tipo II que detectan dulce, amargo y umami, y células tipo III que detectan agrias2,3,4. En el CVP de ratón, las células madre LGR5+ a lo largo de la lámina basal producen todos los tipos de TRC, así como las células epiteliales no gustales5. Al renovar el linaje del gusto, las células hijas LGR5 se especifican primero como células precursoras del gusto postmitótico (células tipo IV) que entran en una papila gustativa y son capaces de diferenciarse en cualquiera de los tres tipos deCVR 6. La rápida rotación de los TRP hace que el sistema de sabor sea susceptible a la interrupción por tratamientos médicos, incluida la radiación y ciertas terapias farmacológicas7,8,9,10,11,12,13. Por lo tanto, estudiar el sistema de sabor en el contexto de la regulación de las células madre del gusto y la diferenciación de la CVR es vital para comprender cómo mitigar o prevenir la disfunción del gusto.
Los ratones son un modelo tradicional para los estudios in vivo en la ciencia del gusto, ya que tienen un sistema de sabor organizado de manera similar a los humanos14,15,16. Sin embargo, los ratones no son ideales para estudios de alto rendimiento, ya que son costosos de mantener y requieren mucho tiempo para trabajar. Para superar esto, en los últimos años se han desarrollado métodos de cultivo de organoides in vitro. Los organoides del gusto se pueden generar a partir de tejido CVP nativo, un proceso en el que los organoides brotan a partir del epitelio CVP aislado de ratón cultivado ex vivo17. Estos organoides muestran un epitelio multicapa consistente con el sistema de sabor in vivo. Una forma más eficiente de generar organoides que no requiere cultivo cvP ex vivo fue desarrollada por Ren etal. en 201418. Adaptando los métodos y medios de cultivo desarrollados por primera vez para cultivar organoides intestinales, aislaron células progenitoras individuales de Lgr5-GFP+ de CVP de ratón y las enchaparon en gel de matriz19. Estas células individuales generan organoides linguales que proliferan durante los primeros 6 días de cultivo, comienzan a diferenciarse alrededor del día 8, y al final del período de cultivo contienen células epiteliales no gustales y los tres tipos deCVR 18,20. Hasta la fecha, se han publicado múltiples estudios que utilizan el sistema modelo de organoideslinguales 17,18,20,21,22; sin embargo, los métodos y las condiciones de cultivo utilizados para generar estos organoides varían entre las publicaciones (Tabla suplementaria 1). Por lo tanto, estos métodos se han ajustado y optimizado aquí para presentar un protocolo estandarizado detallado para el cultivo de organoides linguales derivados de LGR5+ progenitores de CVP de ratón adulto.
Los organoides linguales proporcionan un modelo único para estudiar los procesos biológicos celulares que impulsan el desarrollo y la renovación de las células gustales. A medida que las aplicaciones de los organoides linguales se expanden y más laboratorios avanzan hacia la utilización de modelos organoides in vitro, es importante que el campo se esfuerce por desarrollar y adoptar protocolos estandarizados para mejorar la reproducibilidad. El establecimiento de organoides linguales como una herramienta estándar dentro de la ciencia del gusto permitiría estudios de alto rendimiento que separan cómo las células madre individuales generan las células diferenciadas del sistema de sabor adulto. Además, los organoides linguales podrían emplearse para detectar rápidamente los medicamentos en busca de posibles impactos en la homeostasis del gusto, que luego podrían investigarse más a fondo en modelos animales. En última instancia, este enfoque mejorará los esfuerzos para diseñar terapias que mejoren la calidad de vida de los futuros receptores de medicamentos.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Burro anti Cabra IgG</td><td>Sondas</td><td>A11056, RRID: AB_142628</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Cabra anti Conejo Sondas Moleculares IgG</td><td></td><td>A11010, RRID:AB_2534077</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Cabra anti conejillo de indias IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11075, RRID:AB_2534119</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Burro anti Conejo Sondas Moleculares IgG</td><td></td><td>A31573, RRID:AB_2536183</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Cabra anti Rata Sondas Moleculares IgG</td><td></td><td>A21247, RRID:AB_141778</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>DAPI (para FACS)</td><td>Thermo Fischer</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (para inmunohistoquímica)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571, RRID:AB_2307445</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>Cabra anti-CAR4</td><td>R& D Systems</td><td>AF2414, RRID:AB_2070332</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Cobaya anti-KRT13</td><td>Acris Anticuerpos</td><td>BP5076, RRID:AB_979608</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Conejo anti-GUSTDUCIN</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-395, RRID:AB_673678</td><td>1:250</td></tr><tr><td>Conejo anti-NTPDASE2</td><td>CHUQ</td><td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Rata anti-KRT8</td><td>DSHB</td><td>TROMA-IS, RRID:</td> AB_531826 <td>1:100</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2D rocker</td><td>Benchmark Scientific Inc.</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>Rotador 3D</td><td>Lab-Line Instruments</td><td>4630</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador/cronómetro de dígitos grandes</td><td>Centrífuga</td> de <td>S407992</td><td></td>Fisher Scientific</tr> Tanque de CO2 <tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>FormaTM Series 3 Water Jackeed Incubadora de CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>4110</td><td>184 L, inoxidable pulido Acero</td></tr><tr><td>Incucyte</td><td>Sartorius</td><td>Modelo: S3</td><td>Cancer Center Cell Technologies Recurso compartido, Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus</td></tr><tr><td>MoFlo XDP100</td><td>Cytomation Inc</td><td>Modelo: S13211997</td><td>&nbsp; Núcleo de citometría de flujo del centro de Gates, Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus</td></tr><tr><td>Agitador orbital</td> New <td>Brunswick Scientific</td><td>Excella E1</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>580BR</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>de precisión</td><td>51220073</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83 01</td><td>Sigma</td><td>SML0788-5MG Concentración de</td><td>stock 10 mM, final concentración 500 nM</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Concentración de existencias 50X, concentración final 1X</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750-060 Concentración de</td><td>existencias 1000X, concentración final 1X</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Concentración de existencias 100X, concentración final 1X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Concentración de existencias 100X, concentración final 1X</td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09-1MG</td><td>Concentración de existencias 500 &micro; g/mL, concentración final 50 ng/mL</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38 Concentración de</td><td>existencias 50 y micro; g/mL, concentración final 25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-acetil-L-cisteína</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>Concentración de existencias 0,5 M, concentración final 1</td></tr><tr><td>mM Nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>N0636-100g</td><td>Concentración de existencias 1 M, concentración final 1 mM</td></tr><tr><td>Pena/Estreptococo</td><td>Gibco</td><td>15140-122 Concentración de</td><td>existencias 100X, concentración final 1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>Concentración de stock 500X, concentración final 1X</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>R& D Systems</td><td>1264</td><td>Concentración de material 10 mM, concentración final 0,4 y micro; M</td></tr><tr><td>WRN Medios</td><td></td><td></td> acondicionados <td>recibidos de Dempsey Lab (AMC Organoide y Modelado de Tejidos Share Resource). Derivado de L-WRN (ATCC&reg; CRL-3276&trade;) celdas</td></tr><tr><td>Y27632 dicidocloruro 10ug</td><td>APExBIO</td><td>A3008-10 Concentración de</td><td>stock 10 mM, concentración final 10 y micro; M</td></tr><tr><td><fuerte>Otros</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Jeringa</td><td>BD Jeringa 309659</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol, mín. 98%</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>&beta;-mercaptoetanol</td></tr><tr><td>2,0 mL Tubos de microcentrífuga</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2700</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 48 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 pulgadas Pasteur Pipets</td><td>Fisherbrand</td><td>12-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino (BSA)</td><td>Sigma Life Science</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis RLT Tampón de lisis</td><td>QIAGEN</td><td>1015750</td><td></td></tr> solución <tr><td>de recuperación celular</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Cohan-Vannas Herramientas de</td><td>ciencia fina</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa de Clostridium histolyticum, tipo I</td><td>Sigma Life Science</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RGF BME, Tipo 2, Pathclear</td><td>R& D Systems</td><td>3533-005-02</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Dispasa II (proteasa neutra, grado II)</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Filtros desechables</td><td>Sysmex</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ libre)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato con Ca2+ & Mg2+&nbsp;</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td><td>Promega</td><td>V4231</td><td></td></tr><tr><td>Elastasa liofilizada</td><td>Worthington Bioquímica LS002292</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Bonn extrafinas Tijeras de ciencia</td><td>fina</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Solución Sigma</td><td>Life Science</td><td>H3537-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>iScript Kit de síntesis de ADNc</td><td>Bio-Rad</td><td>1706691</td><td></td></tr><tr><td>Arcilla para modelar, gris</td><td>Sargent Art</td><td>22-4084</td><td></td></tr><tr><td>Aguja</td><td>Jeringa BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PowerSYBR Mezcla maestra de PCR verde Applied</td><td>Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Safe-Lock 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Sodio</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sodio dibásico anhidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sodio monobásico anhidro</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio SuperFrost Plus</td> Tijeras quirúrgicas <td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>- Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Life Science</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VWR micro cubreobjetos VWR</td><td></td><td>48366067</td><td>22x22mm</td></tr></tbody></table>

generación y cultivo de organoides linguales derivados de células madre gustales de ratones adultos

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

El sentido del gusto está mediado por las papilas gustativas en la lengua, que se componen de células receptoras del gusto (TRC) que se renuevan rápidamente. Esta rotación continua es impulsada por células progenitoras locales y hace que la función gustal sea propensa a la interrupción por una multitud de tratamientos médicos, lo que a su vez afecta gravemente la calidad de vida. Por lo tanto, estudiar este proceso en el contexto del tratamiento farmacológico es vital para comprender si y cómo se ven afectadas la función progenitora del gusto y la producción de CVR. Dadas las preocupaciones éticas y la disponibilidad limitada de tejido gustativo humano, los modelos de ratón, que tienen un sistema de sabor similar al de los humanos, se utilizan comúnmente. En comparación con los métodos in vivo, que consumen mucho tiempo, son costosos y no susceptibles de estudios de alto rendimiento, los organoides linguales murinos pueden permitir que los experimentos se ejecuten rápidamente con muchas réplicas y menos ratones. Aquí, se han adaptado protocolos publicados anteriormente y se presenta un método estandarizado para generar organoides del gusto a partir de células progenitoras del gusto aisladas de la papila circunvalada (CVP) de ratones adultos. Las células progenitoras gustales en el CVP expresan LGR5 y se pueden aislar a través de la clasificación celular activada por fluorescencia EGFP (FACS) de ratones portadores de un alelo Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. Las células clasificadas se enchan en un sistema de cultivo 3D basado en gel de matriz y se cultivan durante 12 días. Los organoides se expanden durante los primeros 6 días del período de cultivo a través de la proliferación y luego entran en una fase de diferenciación, durante la cual generan los tres tipos de células gustales junto con las células epiteliales no gustales. Los organoides se pueden cosechar al madurar en el día 12 o en cualquier momento durante el proceso de crecimiento para la expresión de ARN y el análisis inmunohistoquímico. La estandarización de los métodos de cultivo para la producción de organoides linguales a partir de células madre adultas mejorará la reproducibilidad y hará avanzar los organoides linguales como una poderosa herramienta de detección de drogas en la lucha para ayudar a los pacientes que experimentan disfunción del gusto.

Los ratones tienen un CVP, ubicado posteriormente en la lengua, del cual se pueden aislar células madre LGR5+ (Figura 1A,caja negra). La inyección de una solución enzimática debajo y alrededor de la CVP(Figura 1B)da como resultado una ligera hinchazón del epitelio y la digestión del tejido conectivo. Se logra una digestión suficiente después de una incubación de 33 minutos, lo que permite una fácil separación del epitelio CVP del teji...

El protocolo presenta un método para cultivar y procesar organoides linguales derivados de células madre gustales aisladas de la papila gustal posterior de ratones adultos.

Generación y cultivo de organoides linguales derivados de células madre gustales de ratones adultos

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Los organoides son una poderosa tecnología in vitro utilizada para la detección de drogas y la comprensión de los procesos biológicos. Por lo tanto, la generación de organoides que modelan la lengua es crucial para estudiar el desarrollo y la regeneración de las células gusta gustativos. Los estudios tradicionales de sabor in vivo pueden ser costosos y llevar mucho tiempo.Este protocolo organoide ofrece una alternativa estandarizada y reproducible que minimiza esos desafíos al tiempo que permite experimentos de mayor rendimiento. Después de sacrificar a un ratón adulto, use tijeras de disección estériles grandes para cortar las mejillas y romper la mandíbula. Luego, levante la lengua y corte el frenillo lingual para separar la lengua del piso de la cavidad oral.Cortar la lengua y recogerla en dPBS estéril helado con calcio y magnesio. Bajo un microscopio de disección, retire y deseche la lengua anterior cortando justo la parte anterior de la eminencia inter malar con una cuchilla de afeitar. Luego use una delicada toallita de tareas para eliminar el vello y el exceso de líquido de la lengua posterior.A continuación, llene una jeringa de un mililitro con 200 a 300 microlitros de sol

generation-culture-lingual-organoids-derived-from-adult-mouse-taste

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

El objetivo fue desarrollar un protocolo reproducible para aislar y mantener a largo plazo de cultivos de células humanas las papilas fungiformes gusto. Las células de las papilas fungiformes humana obtenidas por biopsia se mantuvieron con éxito en la cultura durante más de ocho pasos (12 meses) sin pérdida de viabilidad.

Aislamiento y cultivo de células humanas las papilas fungiformes gusto

En este video, describimos el aislamiento de células epiteliales de una lengua murina. Estas células pueden cultivarse posteriormente para dar lugar a colonias celulares.

Aislamiento y cultivo de células epiteliales de lengua murina: un procedimiento para aislar y cultivar células epiteliales de lengua a partir de un modelo de ratón

En este video, describimos el aislamiento del epitelio de las papilas circunvaladas (CVP) de una lengua murina.

Aislamiento del epitelio de papilas circunvaladas (CVP) de un modelo de ratón: un procedimiento enzimático para separar el epitelio de CVP de la lengua de ratón

Los cultivos derivados de células madre albergan un tremendo potencial para modelar enfermedades infecciosas. Aquí se describe el cultivo de organoides gástricos de ratón y humanos derivados de células madre adultas. Los organoides se microinyectan con el patógeno gástrico Helicobacter pylori.

Organoides como Modelo para Enfermedades Infecciosas: Cultura de Derechos Humanos y organoides estomacales murinos y microinyección de Helicobacter Pylori

Este documento describe métodos para la preparación de tejidos, tinción y análisis de papilas gustativas completas fungiformes, circunvaladas y del paladar que producen consistentemente papilas gustativas enteras e intactas (incluidas las fibras nerviosas que las inervan) y mantienen las relaciones entre las estructuras dentro de las papilas gustativas y la papila circundante.

Tinción, visualización y análisis de papilas gustativas fungiformes, circunvaladas y del paladar

Hemos desarrollado un protocolo generalizado para disociar una gran cantidad de células individuales de alta calidad del epitelio y el meténquima / tejido conectivo de lenguas de ratón embrionarias y adultas.

Disociación Celular Del Epitelio De La Lengua Y El Meténquima / Tejido Conectivo De Los Ratones Embrionarios-Día 12.5 Y 8-Semana-Viejo

El método de cultivo de órganos tipo Trowell se ha utilizado para desentrañar redes de señalización complejas que gobiernan el desarrollo de los dientes y, más recientemente, para estudiar la regulación involucrada en las células madre del incisivo de ratón en continuo crecimiento. Los modelos animales de reporteros fluorescentes y los métodos de imágenes en vivo facilitan los análisis en profundidad de las células madre dentales y su microambiente de nicho específico.

Uso del cultivo de órganos tipo Trowell para estudiar la regulación de las células madre dentales

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de queratinocitos orales derivados del paladar del ratón adulto. También se informa de un método de evaluación mediante inmunotinción.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos orales primarios del paladar del ratón adulto

Este protocolo describe los pasos clave para generar y caracterizar organoides 3D oralesesofágicos murinos que representan lesiones de carcinoma de células escamosas normales, preneoplásicas y escamosas inducidas a través de carcinogénesis química.

Modelado del carcinoma de células escamosas oral-esofágico en organoides 3D

Aquí se proporciona un método reproducible para examinar la neurogénesis adulta usando un ensayo de neurosphere derivado de todo el cerebro o ya sea del telencephalic, tectal o regiones del cerebelo del cerebro adulto de pez cebra. Además, se describe el procedimiento para manipular la expresión génica en neuroesferas de pez cebra.

Aislamiento y cultivo de neuroesferas derivada de cerebro de adultos de pez cebra

Aprende a generar organoides linguales a partir de células madre gustales de ratones adultos mediante FACS y cultivo 3D. Este protocolo estandarizado permite estudiar el desarrollo y regeneración de células receptoras del gusto in vitro.

Generación y cultivo de organoides linguales derivados de células madre gustales de ratones adultos

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