Name: Evaluación de las métricas funcionales de la salud del músculo esquelético en microtejidos del músculo esquelético humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende a fabricar y analizar microtejidos musculares 3D humanos con la plataforma MyoTACTIC. Este método permite evaluar fuerza contractil y calcio de forma repetida y no invasiva para estudios longitudinales.

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Nos gustaría agradecer a Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli y Sadegh Davoudi por contribuir a la invención de la plataforma de cultivo MyoTACTIC y establecer los métodos de fabricación y análisis descritos en este documento. HL recibió fondos de un Programa de Capacitación del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) en Una Beca de Ingeniería y Emprendimiento Organ-on-a-Chip y una beca de posgrado Wildcat de la Universidad de Toronto. PMG es la Cátedra de Investigación de Canadá en Reparación Endógena y recibió apoyo para este estudio del Instituto de Medicina Regenerativa de Ontario, la Red de Células Madre y de Medicine by Design, un Programa de Excelencia en Investigación de Canadá First. Los diagramas esquemáticos se crearon con BioRender.com.

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+Muscle%3A+A+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
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<li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+price+of+innovation%3A+New+estimates+of+drug+development+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Health+Economics%22%5BJournal%5D)">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li>
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<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307(2018).</li>
<li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li>
<li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li>
<li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081(2020).</li>
<li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units%5BTitle%5D)+AND+%22Microsystems+%26+Nanoengineering%22%5BJournal%5D)">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems & Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li>
<li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li>
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<li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissue-engineered+skeletal+muscle%3A+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847(2018).</li>
<li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li>
<li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li>
<li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121(2020).</li>
<li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li>
<li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li>
<li>Prüller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574(2018).</li>
<li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li>
<li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li>
<li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918(2020).</li>
<li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+pathological+human+myoblasts%3A+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34(2011).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545(2018).</li>
<li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular & Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Este manuscrito describe métodos para fabricar y analizar un modelo de cultivo 3D hMMT que se puede aplicar a estudios de biología muscular básica, modelado de enfermedades o para pruebas de moléculas candidatas. La plataforma MyoTACTIC es rentable, fácil de fabricar y requiere un número relativamente pequeño de células para producir microtejidos musculares esqueléticos. Los hMMT formados dentro de la plataforma de cultivo MyoTACTIC están compuestos por miotubos alineados, multinucleados y estriados, y responden a los es...

El músculo esquelético es uno de los tejidos más abundantes en el cuerpo humano y apoya funciones clave del cuerpo como la locomoción, la homeostasis por calor y el metabolismo1. Históricamente, los modelos animales y los sistemas de cultivo celular bidimensional (2D) se han utilizado para estudiar procesos biológicos y patogénesis de enfermedades, así como para probar compuestos farmacológicos en el tratamiento de enfermedades del músculo esquelético2,3. Si bien los modelos animales han mejorado en gran medida nuestro conocimiento del músculo esquelético en la salud y en la enfermedad, su impacto traslacional se ha visto obstaculizado por los altos costos, las consideraciones éticas y las diferencias entre especies2,4. Al recurrir a los sistemas basados en células humanas para estudiar el músculo esquelético, los sistemas de cultivo celular 2D son favorables debido a su simplicidad. Sin embargo, hay una limitación. Este formato a menudo no logra recapitular las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular que ocurren naturalmente dentro del cuerpo5,6. En los últimos años, los modelos tridimensionales (3D) del músculo esquelético han surgido como una poderosa alternativa a los modelos animales completos y los sistemas de cultivo 2D convencionales al permitir el modelado de procesos fisiológica y patológicamente relevantes ex vivo7,8. De hecho, una gran cantidad de estudios han reportado estrategias para modelar el músculo esquelético humano en un formato de cultivo 3D bioartificial1. Una limitación para muchos de estos estudios es que la fuerza activa se cuantifica después de la eliminación de los tejidos musculares de las plataformas de cultivo y la unión a un transductor de fuerza, que es destructivo y, por lo tanto, se limita a servir como un ensayo de punto final9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Otros han diseñado sistemas de cultivo que permiten métodos no invasivos de medición de la fuerza activa, pero no todos son susceptibles de aplicaciones de prueba de moléculas de alto contenido7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Este protocolo describe un método detallado para fabricar microtejidos musculares humanos (hMMTs) en la plataforma microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) del músculo esquelético (MyoTACTIC); un dispositivo de placa de 96 pocillos que soporta la producción a granel de microtisones musculares esqueléticos30. El método de fabricación de placas MyoTACTIC permite la generación de una placa de cultivo de polidimetilsiloxano (PDMS) de 96 pocillos y todas las características correspondientes del pozo en un solo paso de fundición, por lo que cada pozo requiere un número relativamente pequeño de células para la formación de microtejivas. Los microtejidos formados dentro de MyoTACTIC contienen miotubos alineados, estriados y multinucleados que son reproducibles de pozo a pozo del dispositivo, y al madurar, pueden responder a estímulos químicos y eléctricos in situ30. Aquí, se describe y discute la técnica para fabricar un dispositivo de placa de cultivo MIOTÁCTICO PDMS a partir de una réplica de poliuretano (PU), un método optimizado para implementar células progenitoras miogénicas humanas inmortalizadas para fabricar hMMT, y la evaluación funcional de la generación de fuerza hMMT diseñada y las propiedades de manejo de calcio.

<table><tbody><tr><td>Solución salina al 0,9%, estéril</td><td>de la marca</td><td>de la casa 1010</td><td>10 mL alícuotas de la solución se fabrican y almacenan a 4 grados; C</td></tr><tr><td>25G Needle</td><td>BD, Medstore, Universidad de Toronto</td><td>2548-CABD305127</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 6-Aminocaproico, &ge; 99% (valoración), Polvo</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A2504-100G</td><td>Se genera una solución madre de 50 mg / mL disolviendo 5 mg de polvo de ácido 6-aminocaproico en 100 mL de agua destilada esterilizada en autoclave. La solución se filtra al vacío y se almacenan alícuotas de 10 mL a 4&deg; C</td></tr><tr><td>6,35 mm Tubo de diámetro interior</td><td>VWR</td><td>60985-528</td><td></td></tr><tr><td>AB1167 Línea celular de mioblastos</td><td>Institut de Myologie (París, Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Generador de forma de onda arbitraria</td><td>Rigol</td><td>DG1022Z</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de membrana basal (Geltrex)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14132-02</td><td>Almacenado como alícuotas de 50 &micro; L o 100 y micro; L a -80 grados; </td></tr><tr><td>C Cámara de vacío de sobremesa</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td>BNC a cable de clip</td><td></td><td></td><td>Aligator pedido a Amazon</td></tr><tr><td>Culture Plastics</td><td>Sarstedt</td><td></td><td>Incluye placas de cultivo, pipetas serológicas, etc</td></tr>. <tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td>- Aldrich</td><td>D8418-250ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, Polvo, Sin Calcio, Sin Magnesio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>21600069</tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Este es un DMEM con alto contenido de glucosa con L-glutamina y piruvato de sodio</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinógeno de Plasma Bovino Sigma</td><td>- Aldrich</td><td>F8630-5G</td><td>Se fabrican alícuotas que van desde 7 a 10 mg de polvo de fibrinógeno y se almacenan a -20 grados; C</td></tr><tr><td>Filtropur Filtro de jeringa, 0.22um Tamaño de poro</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Insulina Recombinante Humana</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>91077C</td><td>La solución madre es 100X y se elabora disolviendo 1 mg de insulina recombinante humana en 1 mL de DMEM y 1 &micro; L de NaOH 10N. La solución se filtra y se almacena como alícuotas de 1 mL a 4&deg; </td></tr><tr><td>C Software de adquisición de imágenes</td><td>Olympus</td><td>cellSens Dimension</td><td></td></tr><tr><td>Software de procesamiento de imágenes</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Oven</td><td>Microscopio Thermo Fisher Scientific</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Olympus</td><td>IX83</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Montaje de cámara</td><td>Labcam</td><td>Labcam para iPhone</td><td>Pedido en Amazon</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas Desechables de Plástico, 1cc</td><td>BD</td><td>2606-309659</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas Desechables de Plástico, 50cc</td><td>BD</td><td>2612-309653</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, Polvo, BioReactivo</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P2443-250G</td><td>Una solución madre al 5% de ácido plurónico se elabora disolviendo 5 g de ácido plurónico en polvo en 100 ml de agua destilada enfriada y esterilizada en autoclave. La solución se filtra al vacío y se almacenan alícuotas de 10 mL a 4&deg; C</td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td><td>Los</td> kits <td>de 4019862</td> Dow <td>también están disponibles en Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td></tr><tr><td>Molde negativo de poliuretano</td><td>Agente</td> desmoldante interno <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mann Release Technologies</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío de paletas rotativas</td><td>Edwards</td><td></td> A65401906 <td></td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>Almedic, Medstore, Universidad de Toronto</td><td>2586-M36-0100</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de un solo filo</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Célula muscular esquelética basal Se</td> generan alícuotas medianas <td>Promocell</td><td>C-23260</td><td>de 30 mL y se almacenan a 4°C.</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento de células musculares esqueléticas (listo para usar)</td><td>Promocell</td><td>C-23060</td><td>Las alícuotas de 42 mL se generan y almacenan a 4 °C.</td></tr><tr><td>Smartphone (iPhone)</td><td>Apple</td><td>SE</td><td></td></tr><tr><td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td><td>Welch</td><td>2546B-01</td><td></td></tr><tr><td>Bolsa de esterilización</td><td>Alliance</td><td>211-SCM2</td><td></td></tr><tr><td>Dedal</td><td>Igege</td><td></td><td>Pedido a</td></tr><tr><td>Amazon Trombina de plasma humano</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T6884-250UN</td><td>Se disuelven 100 unidades de trombina en 1 ml de una solución de BSA al 0,1%. 10 y micro; Las alícuotas L se preparan y almacenan a - 20°C.</td></tr><tr><td>Alambre de cobre recubierto de estaño</td><td>Arco</td><td>B8871K48</td><td>pedido a Amazon</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4 %</td> <td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,25 %</td> <td>Thermo FIsher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum Chamber 2</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42027-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de las métricas funcionales de la salud del músculo esquelético en microtejidos del músculo esquelético humano

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Los modelos tridimensionales (3D) in vitro del músculo esquelético son un avance valioso en la investigación biomédica, ya que brindan la oportunidad de estudiar la reforma y la función del músculo esquelético en un formato escalable que es susceptible de manipulaciones experimentales. Los sistemas de cultivo muscular 3D son deseables, ya que permiten a los científicos estudiar el músculo esquelético ex vivo en el contexto de las células humanas. Los modelos 3D in vitro imitan de cerca aspectos de la estructura del tejido nativo del músculo esquelético adulto. Sin embargo, su aplicación universal está limitada por la disponibilidad de plataformas que son fáciles de fabricar, costosas y fáciles de usar, y producen cantidades relativamente altas de tejidos musculares esqueléticos humanos. Además, dado que el músculo esquelético desempeña un papel funcional importante que se ve afectado con el tiempo en muchos estados de enfermedad, una plataforma experimental para estudios de microtejidos es más práctica cuando las mediciones mínimamente invasivas de la fuerza transitoria y contráctil del calcio se pueden realizar directamente dentro de la propia plataforma. En este protocolo, se describe la fabricación de una plataforma de 96 pocillos conocida como 'MyoTACTIC', y la producción en masa de microtisones musculares esqueléticos humanos (hMMTs) en 3D. Además, se informan los métodos para una aplicación mínimamente invasiva de estimulación eléctrica que permite mediciones repetidas de la fuerza del músculo esquelético y el manejo del calcio de cada microtejido a lo largo del tiempo.

Aquí se describen métodos para fundir una plataforma de cultivo MyoTACTIC basada en PDMS de 96 pocillos desde un molde de PU, fabricar matrices de tejidos de réplica de hMMT y analizar dos aspectos de la función de hMMT dentro de la generación de fuerza del dispositivo de cultivo y el manejo de calcio. La Figura 1 ofrece una visión general esquemática de la preparación de los pocillos de cultivo MyoTACTIC antes de la siembra de hMMT. PDMS es un polímero a base de silicona ampliamente utiliza...

Este manuscrito describe un protocolo detallado para producir matrices de microtejidos 3D del músculo esquelético humano y ensayos de función in situ mínimamente invasivos aguas abajo, incluidos análisis de fuerza contráctil y manejo de calcio.

Evaluación de las métricas funcionales de la salud del músculo esquelético en microtejidos del músculo esquelético humano

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Nuestro protocolo describe métodos detallados para fabricar y analizar un cultivo de microtis del músculo esquelético humano en 3D. Los microtejidos musculares se pueden aplicar a estudios de biología muscular básica, modelado de enfermedades o para pruebas de moléculas candidatas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación in situ de la fuerza contráctil y los transitorios de calcio.Debido a esto, puede realizar estudios longitudinales de la función del tejido muscular. Demostrando el procedimiento estarán Brennen Musgrave y Heta Lad, estudiantes graduados de mi laboratorio. Dos o tres horas antes de la siembra celular, coloque una porción de placa táctica suave de seis pozos en una placa de cultivo celular de 10 centímetros.Prepare bien cada cultivo miotáctico individual agregando 100 microlitros de una solución F-127 5% plurónica. Use la tapa para cubrir los pozos y aplique una película de parafina para sellar el plato. Centrifugar el plato a 1, 550 veces G durante un minuto en una centrífuga equipada con un adaptador de plato giratorio.Guarde el plato de cultivo a cuatro grados centígrados hasta que las células estén listas para la siembra. Luego desconge

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Myo-mecánico Análisis de músculo esquelético aislado

Este protocolo describe el uso de palancas de silicio microescala como superficies de cultivo flexibles para la medición de la contractilidad de las células musculares in vitro. La contracción celular hace que la flexión en voladizo, que se puede medir, grabada, y se convierte en lecturas de fuerza, proporcionando un sistema no invasivo y escalable para la medición de la función contráctil in vitro.

Utilización de microescala silicio voladizos para evaluar la función contráctil celular In Vitro

Este protocolo describe un método robusto, reproducible y simple de aislamiento y cultivo de células de mioblastos progenitoras del músculo esquelético de adultos y personas de edad avanzada. Los músculos que se usan aquí incluyen los músculos del pie y de la pierna. Este enfoque permite el aislamiento de una población enriquecida de mioblastos primarios para los estudios funcionales.

Preparación y cultivo de células precursoras miogénica / mioblastos primarios de músculo esquelético de los seres humanos adultos y envejecidos

Medición de la función contráctil del músculo esquelético roedor es una útil herramienta que puede utilizarse para seguir la progresión de la enfermedad, así como eficacia de la intervención terapéutica. Describimos aquí la evaluación no invasiva, de en vivo de los músculos dorsiflexores que puede repetirse en el tiempo en el mismo ratón.

Evaluación no invasiva de la función muscular de los dorsiflexores en ratones

Este informe técnico describe una variación de la técnica modificada de Bergstrom para la biopsia del musculus tibialis anterior que limita el daño de la fibra.

Colección de biopsias de músculo esquelético del Compartimiento Superior del Musculus Humano Tibialis Anterior para la Evaluación Mecánica

La cuantificación de la fuerza máxima extensora de la rodilla es imprescindible para comprender las adaptaciones funcionales al envejecimiento, la enfermedad, las lesiones y la rehabilitación. Presentamos un método novedoso para medir repetidamente el par tetánico máximo isométrico de extensión de rodilla in vivo.

Medición in vivo de la función muscular extensora de la rodilla en ratones

En este protocolo se describe un método de cultivo y análisis funcional in vitro para células madre musculares, que conserva la mayoría de sus interacciones con su nicho endógeno.

Ensayo único de cultivo de Myofiber para la evaluación de la funcionalidad de las células madre musculares adultas ex vivo

Este protocolo proporciona métodos para generar tejidos cardíacos y esqueléticos diseñados en 3D y describe su uso en modalidades preclínicas de detección de fármacos. Los métodos descritos utilizan un sistema de detección magnética para facilitar la evaluación simultánea de 24 tejidos en paralelo.

Pruebas preclínicas de fármacos en tejidos musculares escalables diseñados en 3D

Describimos un protocolo para obtener fibras disociadas enzimáticamente de diferentes longitudes y tipos a partir de seis músculos de ratones adultos: tres de ellos ya descritos (flexor corto de los dedos, extensor largo de los dedos, sóleo) y tres de ellos disociados con éxito por primera vez (extensor largo del dedo gordo, peroneo largo, peroneo largo de los dedos cuartos).

Fibras musculares esqueléticas cortas, intermedias y largas intactas obtenidas por disociación enzimática de seis músculos de las extremidades posteriores de ratones: más allá del flexor corto de los dedos

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

Este protocolo utiliza la tomografía microcomputarizada para permitir la cuantificación rentable de la masa magra, incluido el músculo esquelético y el tejido visceral, el tejido adiposo y el tejido esquelético en animales pequeños. Distingue entre tejido magro y adiposo, lo que ofrece ventajas significativas para la investigación biomédica, particularmente en la investigación traslacional en animales pequeños.

Cuantificación no invasiva del músculo esquelético en pequeños animales mediante microtomografía computarizada

Aprende a fabricar y analizar microtejidos musculares 3D humanos con la plataforma MyoTACTIC. Este método permite evaluar fuerza contractil y calcio de forma repetida y no invasiva para estudios longitudinales.

Evaluación de las métricas funcionales de la salud del músculo esquelético en microtejidos del músculo esquelético humano

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