Name: Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Aprende a visualizar la arborización dendrítica en células retinianas del ratón mediante inyección de virus adenoasociados Cre-dependientes y microscopía confocal de tiempo real. Este protocolo permite estudiar la morfogénesis neuronal in situ con alta resolución espacial y temporal.

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Agradecemos a Madison Gray por darme una mano cuando no tenía ninguna. Esta investigación fue apoyada por una beca de descubrimiento de NSERC (RGPIN-2016-06128), una beca Sloan en neurociencia y una cátedra de investigación de Canadá Nivel 2 (a J.L.L). S. Ing-Esteves fue apoyado por el Programa de Investigación de Ciencias de la Visión y las Becas de Postgrado-Doctorado de NSERC.

Los autores no tienen nada que revelar.

Este video muestra una tubería experimental que utiliza las herramientas genéticas existentes para obtener imágenes de la dinámica de las dendritas del desarrollo de las neuronas de la retina con imágenes en vivo confocales. También se han demostrado las inyecciones intraoculares de AAV dependientes de Cre que codifican proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana en ratones neonatales. Las células individuales de poblaciones genéticamente dirigidas están brillantemente etiquetadas tan pronto como 4-5 dpi. Se preparar...

Las dendritas de las neuronas de la retina forman patrones intrincados, pero específicos, que influyen en su función dentro de los circuitos neuronales. En la retina de los vertebrados, diversos tipos de células ganglionares retinianas (RGC) e interneuronas de células amacrinas tienen morfologías dendríticas únicas que difieren en tamaño del cenador, ubicación, longitud de la rama y densidad1. Durante el desarrollo postnatal, las RGC y las células amacrinas extienden procesos dendríticos exuberantes en un neuropil llamado capa plexiforme interna (IPL), donde reciben entradas de células bipolares que transmiten señales fotorreceptoras2. Según lo capturado por imágenes de lapso de tiempo de poblaciones retinianas marcadas fluorescentemente en larvas de pollitos o peces cebra, la morfogénesis de dendritas es altamente dinámica3,4,5. En cuestión de días, los cenadores dendríticos se expanden, remodelan y ramifican a subcapas estrechas de la IPL, donde hacen sinapsis con socios seleccionados. Los cenadores exhiben diferentes dinámicas estructurales a lo largo del desarrollo, con cambios en las tasas relativas de adición, retracción y estabilización de ramas. Las dendritas amacrinas y RGC también exhiben diferentes comportamientos de crecimiento y remodelación que podrían reflejar la arborización específica del tipo. Sin embargo, estos estudios rastrearon amplias poblaciones de amacrina o RGC y se centraron en la orientación laminar, que es solo un aspecto de la morfología.
Los mecanismos que producen la vasta diversidad morfológica observada a través de los subtipos de retina son poco conocidos. El objetivo de este grupo fue desarrollar un método para capturar la dinámica de las dendritas y la remodelación del cenador de subtipos retinianos definidos en ratones. La identificación de mecanismos específicos del tipo de célula de patrón de dendritas requiere métodos para visualizar y medir el comportamiento de las dendritas de las células de interés. Los cultivos organotípicos de retinas de ratón son adecuados para estudios de imágenes de células vivas que utilizan microscopía confocal o multifotónica. Las retinas en desarrollo se diseccionan y se montan en un explante plano que puede ser fotografiado durante varias horas en una cámara de grabación o cultivado durante unos días con efectos limitados en el circuito6,7. Las neuronas retinianas vivas pueden ser marcadas por una variedad de técnicas, incluyendo el llenado de tinte por electrodos, electroporación, entrega biolística de partículas recubiertas con colorantes lipofílicos o plásmidos que codifican proteínas fluorescentes (por ejemplo, Gene Gun), así como etiquetas celulares codificadas genéticamente7,8,9,10 . Sin embargo, estos enfoques son ineficientes para la dinámica de las dendritas por imágenes de subtipos específicos de retina. Por ejemplo, los métodos de llenado de colorantes son de bajo rendimiento y requieren aparatos de electrofisiología y etiquetas genéticas adicionales para dirigirse de manera confiable a las células de interés. Además, las fuertes señales de fluorescencia en el soma pueden oscurecer las dendritas cercanas.
Los métodos de administración de genes biolísticos pueden etiquetar simultáneamente docenas de células, pero los pasos que involucran la entrega de partículas a alta presión y la incubación nocturna de retina aislada pueden comprometer la fisiología celular y el crecimiento dendrítico. Este artículo propone que se pueden emplear herramientas genéticas recientes para capturar la dinámica temprana de las dendritas con el tipo de célula y la resolución estructural, dados los siguientes criterios experimentales. Primero, para resolver las ramas finas y los filopodios que dominan los cenadores en desarrollo, el método debe etiquetar las neuronas con proteínas brillantes y fluorescentes que llenan los procesos en todo el cenador. El etiquetado de fluorescencia no debe desvanecerse debido al fotoblanqueo durante el período de obtención de imágenes. Se han generado y comparado una variedad de variantes de proteínas fluorescentes para la idoneidad de las imágenes in vivo/ex vivo11 basadas en el brillo y la fotoestabilidad. En segundo lugar, las proteínas fluorescentes (PFX) deben expresarse en niveles suficientemente altos en la etapa más temprana de la morfogénesis de la dendrita, de modo que no se pierda la estrecha ventana de desarrollo. En los análisis de puntos de tiempo estáticos en la retina del ratón, el desarrollo de dendritas ocurre durante la primera semana postnatal e incluye fases de crecimiento, remodelación y estabilización10,12,13,14,15. En tercer lugar, el método debe conducir a un etiquetado selectivo o a una mayor probabilidad de etiquetado de la subpoblación neuronal de interés. En cuarto lugar, el etiquetado de la subpoblación objetivo debe ser lo suficientemente escaso como para que se pueda identificar y rastrear todo el cenador neuronal. Aunque los subtipos RGC y amacrina pueden distinguirse por sus características morfológicas maduras y patrones de estratificación de IPL16,17,18,19,20, el desafío es identificar subtipos durante el desarrollo basados en estructuras inmaduras. Esta tarea se ve facilitada por la expansión de herramientas transgénicas para etiquetar tipos específicos de células de la retina durante el desarrollo.
Las líneas de ratón transgénicos y knock-in en las que la expresión celular y temporal de proteínas fluorescentes o Cre está determinada por elementos reguladores de genes son ampliamente utilizadas para estudiar tipos de células retinianas13,21,22,23. Las observaciones clave sobre los patrones específicos de subtipo de desarrollo de dendritas provienen de estudios de retinas de ratones transgénicos en puntos de tiempo estáticos10,14,24,25. El sistema Cre-Lox, en particular, permite una exquisita manipulación genética y monitoreo de subtipos utilizando una variedad de reporteros, sensores y activadores optogenéticos dependientes de la recombinasa. Estas herramientas han llevado a descubrimientos de programas moleculares específicos de subtipos y propiedades funcionales que subyacen al ensamblaje del circuito retiniano26,27,28,29,30. Sin embargo, aún no se han aprovechado para estudiar la dinámica de las dendritas específicas del subtipo en la retina del ratón. El etiquetado de baja densidad se puede lograr combinando líneas de ratón Cre con transgenes introducidos por electroporación o por AAV recombinantes. Si está disponible, también se pueden usar líneas de Cre inducibles por tamoxifeno o estrategias genéticas interseccionales. Finalmente, la célula debe ser etiquetada de una manera mínimamente invasiva y fotografiada utilizando parámetros de adquisición para no comprometer el tejido o interferir con la función celular requerida para la morfogénesis de la dendrita.
Aquí se presenta un método para aplicar herramientas transgénicas y microscopía confocal para investigar la dinámica de las dendritas en explantes de retina de ratones vivos. Las líneas de ratón transgénico Cre se han combinado con vectores AAV que expresan proteínas fluorescentes tras la recombinación de Cre, lo que permite un etiquetado escaso de las células de la retina de interés. Los AAV disponibles comercialmente se administran a la retina neonatal mediante inyecciones intravítreas. Este artículo demuestra que los AAV producen una expresión fluorescente significativamente alta y específica del tipo celular en 4 dpi, lo que permite el acceso a los puntos de tiempo postnatales. Para ilustrar este enfoque, la interneurona colinérgica "starburst" amacrina fue marcada mediante la administración de Brainbow AAV en ratones neonatales que expresan el transgén de colina acetiltransferasa (ChAT)-ribosoma interno (IRES)-Cre, que es activo en la retina postnatal temprana31,32. Las células amacrinas starburst desarrollan una morfología estereotipada y radial del cenador que está formada por la autoevitabilidad de las dendritas mediada por las protocadherinas agrupadas33,34. Este artículo muestra que la resolución de las dendritas y filopodias de estallido estelar se mejora significativamente mediante XFP a la membrana plasmática con la adición del motivo CAAX que sufre farnesilación, como se utiliza para los AAV de Brainbow31. Finalmente, se han determinado los protocolos de imágenes de lapso de tiempo y post-procesamiento que producen imágenes de alta calidad susceptibles de reconstrucción de dendritas y cuantificación morfométrica. Este protocolo se puede utilizar para identificar factores que controlan la morfogénesis de las dendritas y para capturar varios comportamientos celulares en la retina intacta.

<table><tbody><tr><td>Preparación viral Addgene #45185-AAV9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preparación viral Addgene #45186-AAV9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><Herramientas >disección fuerte</papel de filtro ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>celulosa</td> fuerte <td>Whatman</td><td>1001-070</td><td></td></tr><tr><td>Pinza fina Dumont #5</td><td>FST</td><td>11252-20</td> Se <td>requieren dos pinzas Dumont #5 para la microdisección de retina</td></tr><tr><td>Pinza Dumont</td><td>VWR</td><td>82027-426</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>Papeles de filtro de membrana de éster de celulosa mixta (MCE), hidrófilos, 0,45 y micro; m tamaño de poro</td><td>Millipore</td><td>HABG01 300</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri, 50 &times; 15 mm</td><td>VWR</td><td>470313-352</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia desechable de polietileno</td><td>VWR</td><td>470225-034</td><td></td></tr><tr><td>Pincel de punta redonda, tamaño 3/0</td><td>Tienda</td><td></td> de artículos de arte convencional <td>Se requieren dos pinceles de tamaño 3/0 (o más pequeños) para el montaje plano de retina</td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>FST</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas - Filo de corte de 2,5 mm</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td><sistema de incubación de imagen en vivo fuerte></tubo ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>polietileno de cámara fuerte, PE-160 10'Warner</td> <td>Instruments</td><td>64-0755</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de calentador de doble canal, modelo TC-344C</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2401</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo de inmersión HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR</td><td>Leica</td><td>15506374</td><td></td></tr><tr><td>Cable controlador de calentador</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de incubación de baño grande con soporte de corte</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td></td></tr><tr><td>MPII Mini-Bomba Peristáltica Harvard</td><td>Apparatus</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>PM-6D Plataforma calefactada magnética (calentador de cámara de incubación)</td><td>Piezas</td><td>de tubo de cabeza de bomba PM-6D</td><td></td></tr><tr><td>de Warner Instruments para bomba miniperistáltica MPII</td><td>Aparato Harvard</td><td>55-4148</td><td></td></tr><tr><td>Anclaje de muestra (arpas)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0260</td><td>El anclaje de muestra debe ser compatible con la cámara de incubación</td></tr><tr><td>Calentador de solución en línea Sloflo</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Inyecciones neonatales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 y micro; L Jeringa de microlitros serie 700, aguja extraíble</td><td>Hamilton Company</td><td>80314</td><td></td></tr><tr><td>Agujas hipodérmicas de 30 g (0,5 pulgadas)</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>capilar de vidrio de pared delgada de 4 pulgadas, sin filamento (diámetro exterior de 1,0 mm/0,75 mm)&nbsp;</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99.8% (para diluir a 70% con agua bidestilada [ddH2O])</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V001229&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV2453</td><td>Addgene Plásmido #45185&nbsp;</td></tr><tr><td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV2454</td><td>Addgene Plásmido #45186</td></tr><tr><td>ChAT-IRES-Cre línea de ratones transgénicos knock-in</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>6410</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Contenido de tinte &ge; 85 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de micropipetas flameado/marrón, modelo P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pasta de tatuaje verde</td><td>Ketchum MFG Co</td><td>329A</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, líquida, filtrada estéril, apta para cultivo celular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>PicoPump neumático</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>PV-820</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Líquido cefalorraquídeo oxigenado (aCSF) Reactivos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cárgeno (5% CO2, 95% O2)</td><td>AirGas</td><td>X02OX95C2003102</td><td>El proveedor puede variar según la región</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Ácido Libre</td><td>Bio Basic</td><td>HB0264</td><td></td></tr><tr><td>Solución de ácido clorhídrico, 1 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>pH-Tiras reactivas (6.0-7.7)</td><td>VWR</td><td>BDH35317.604</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Bio Basic</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD007</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Institutos Nacionales de Salud (NIH)</td><td>Código</td><td></td> abierto</tr></tbody></table>

imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Descubrir los mecanismos que modelan los cenadores dendríticos requiere métodos para visualizar, visualizar y analizar las dendritas durante el desarrollo. La retina de ratón es un potente sistema modelo para la investigación de mecanismos específicos del tipo celular de morfogénesis neuronal y conectividad. La organización y composición de los subtipos de retina están bien definidas, y las herramientas genéticas están disponibles para acceder a tipos específicos durante el desarrollo. Muchos tipos de células de la retina también restringen sus dendritas y / o axones a capas estrechas, lo que facilita las imágenes de lapso de tiempo. Los cultivos de explantes de retina de ratón son adecuados para la obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía confocal o multifotónica, pero faltan métodos optimizados para la dinámica de las dendritas de imágenes con resolución temporal y estructural. Aquí se presenta un método para etiquetar e visualizar escasamente el desarrollo de poblaciones específicas de retina marcadas por el sistema Cre-Lox. Los virus adenoasociados (AVA) disponibles comercialmente utilizados aquí expresaron proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre. La administración intraocular de AAV en ratones neonatales produce un marcado fluorescente de tipos de células objetivo a los 4-5 días después de la inyección (dpi). Las señales fluorescentes de membrana son detectables por imágenes confocales y resuelven estructuras y dinámicas de ramas finas. Los videos de alta calidad que abarcan de 2 a 4 h se adquieren a partir de imágenes de montajes planos de retina perfundidos con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado (aCSF). También se proporciona una tubería de postprocesamiento de imágenes para la deconvolución y la corrección de deriva tridimensional (3D). Este protocolo se puede utilizar para capturar varios comportamientos celulares en la retina intacta y para identificar nuevos factores que controlan la morfogénesis de la neurita. Muchas estrategias de desarrollo aprendidas en la retina serán relevantes para comprender la formación de circuitos neuronales en otras partes del sistema nervioso central.

Usando el protocolo anterior, se adquirió, descontornó y corrigió un video 3D de alta resolución del desarrollo de dendritas celulares starburst para la deriva 3D. Se produjeron proyecciones máximas en plano Z para realizar videos 2D para su análisis (Video Complementario 1, Figura 5A). La deconvolución 3D de cada punto temporal aumentó la resolución de las proyecciones de filopodia fina (Figura 5B, C). Las protuberancias finas ...

Aquí, presentamos un método para investigar la morfogénesis de neuritas en explantes retinianos de ratón postnatales mediante microscopía confocal de lapso de tiempo. Describimos un enfoque para el etiquetado disperso y la adquisición de tipos de células retinianas y sus procesos finos utilizando vectores de virus adenoasociados recombinantes que expresan proteínas fluorescentes dirigidas a la membrana de una manera dependiente de Cre.

Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Se requiere el etiquetado de una sola célula y la visualización de cenadores dendríticos o axonales para estudiar la morfogénesis neuronal. Al etiquetar los cenadores en desarrollo de una manera mínimamente invasiva, el tejido de la retina permanece sano y adecuado para imágenes vivas confocales prolongadas. La principal ventaja de este método es la capacidad de visualizar cenadores individuales con proteínas fluorescentes multicolores dentro de los cuatro días posteriores a la inyección.Esto hace posible el estudio de las morfologías de los cenadores neonatales. Este protocolo de análisis e imágenes de inyección se puede utilizar para estudiar las morfologías neuronales en todo el sistema nervioso central. Se debe determinar la selección adecuada de Cre y la ubicación de la inyección para dirigirse a la población celular de interés.Comience seleccionando una línea de ratón Cre para etiquetar las poblaciones de células de la retina de interés. Obtener el virus AAV dependiente de la recombinasa que codifica proteínas fluorescentes. Para un etiquetado óptimo de procesos finos, seleccione vectores que expresen proteínas fluorescentes modificadas dirigidas a la membrana plasmática.Para

time-lapse-imaging-neuronal-arborization-using-sparse-adeno

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Investigación

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Neurociencia

En este video, las técnicas para la multicolor confocal de imágenes a intervalos de tiempo y la ablación de células específicas se proporcionan. Time-lapse de imágenes se utiliza para controlar el comportamiento de los múltiples tipos de células de...

Multicolor Time-lapse de imágenes de pez cebra transgénico: Visualización de células madre retinianas activado por la ablación selectiva de células neuronales

Aquí presentamos la inyección intracraneal de vectores AAV de marcaje fluorescente de las neuronas y la glía en la corteza visual.

Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

Se describe un protocolo en tiempo real videoimaging de la migración neuronal en el cerebro anterior del ratón. La migración de viralmente marcados o injertado precursores neuronales se registró en rebanadas agudas en vivo utilizando de gran campo de imagen fluorescente con un intervalo de adquisición relativamente rápido para estudiar las diferentes fases de la migración de células, incluyendo las duraciones de las fases estacionaria y la migración y la velocidad de migración.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

Fuente: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el uso de la microscopía confocal para visualizar la dinámica dendrítica en explantes de retina de ratones vivos. Describe los pasos para estabilizar la retina bajo un microscopio confocal, realizar imágenes de epifluorescencia para visualizar las interneuronas amacrinas...

Imágenes confocales de lapso de tiempo de la dinámica dendrítica neuronal en explantes de retina de ratón

Para investigar la permeabilidad de la barrera hematorretiniana y la integridad de la membrana limitante interna en modelos animales de enfermedad de la retina, utilizamos varias variantes de virus adenoasociados (AAV) como herramientas para etiquetar las neuronas de la retina y la glía. La expresión génica reportera mediada por virus se utiliza como indicador de la permeabilidad de la barrera retiniana.

Utilizando adeno-asociado virus como una herramienta para estudiar las barreras de retina en la enfermedad

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

El protocolo actual demuestra un método simple para el rastreo de las proyecciones de glutamato del área tegmental ventral (VTA) al hipocampo. La fotoestimulación de las neuronas de glutamato VTA se combinó con el registro de CA1 para demostrar cómo los terminales de glutamato VTA modulan la tasa de disparo piramidal putativa CA1 in vivo.

Trazado anatómico y funcional combinado in vivo de terminales de glutamato del área tegmental ventral en el hipocampo

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Aprende a visualizar la arborización dendrítica en células retinianas del ratón mediante inyección de virus adenoasociados Cre-dependientes y microscopía confocal de tiempo real. Este protocolo permite estudiar la morfogénesis neuronal in situ con alta resolución espacial y temporal.

Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas (Video) | JoVE Journal

Imágenes de lapso de tiempo de arborización neuronal utilizando el etiquetado de virus adenoasociados dispersos de poblaciones de células retinianas genéticamente dirigidas

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