Name: Cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende a cuantificar especies reactivas de oxígeno en tiempo real en neutrófilos infectados con Escherichia coli meningítica mediante sondas fluorescentes y lectura en placa. Este método permite estudiar los mecanismos bactericidas durante interacciones huésped-patógeno.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31670845, 31870832, 32000811) y el Programa de Profesor Distinguido de la Provincia de Liaoning (LJH2018-35).

La sangre periférica de los voluntarios aplicados en esta investigación fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional del primer Hospital de la Universidad Médica de China (#2020-2020-237-2).
1. Preparación de reactivos y medios de cultivo
<ol><li>Preparar el tampón de lisis de glóbulos rojos añadiendo 8,29 g de NH4Cl, 1 g de KHCO3,37,2 mg de Na2EDTA en 1 L de agua destilada doble y ajustar el pH a 7,2-7,4. Retire la bacteria mediante filtración utilizando filtros de 0,22 μm.</li>
	<li>Prepare el medio de cultivo experimental para neutrófilos añadiendo un 5% de suero bovino fetal al medio RPMI 1640 y guárdelo a 4 °C. Equilibrar a temperatura ambiente antes de su uso. NOTA: Utilice el medio RPMI 1640 sin fenol rojo.</li>
	<li>Preparar solución salina tampón de fosfato (PBS) añadiendo 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4·2H2O y 0,2 g de KH2PO4 en 1 L de agua destilada doble en un matraz de vidrio de 1 L. Ajuste el pH a 7,2-7,4. Autoclave durante 15 min a 121 °C.</li>
	<li>Preparar solución de rifampicina mediante la disolución de 0,5 g de polvo de rifampicina en 10 ml de sulfóxido de dimetil (DMSO) para producir una solución de rifampicina de 50 mg/ml.</li>
	<li>Preparar solución de agar LB añadiendo 10 g de NaCl, 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 15 g de polvo de agar en 1 L de agua destilada doble y autoclave la mezcla. Llene las placas De Petri a la mitad del volumen vertiendo solución de agar LB caliente que contenga 100 rifampicina de μg/ml. Guarde la placa sólida enfriada a 4 °C.</li>
	<li>Preparar caldo de infusión cardíaca cerebral (BHI) apropiado para cepas bacterianas mediante la disolución de 37 g de polvo BHI en 1 L de agua destilada doble. Ajuste el pH a 7,2 y autoclave.</li>
	<li>Disolver la sonda fluorescente dihidroethidium (DHE) en disolvente DMSO para producir una solución de stock de 10 mM. Mezcle suavemente antes de usarlo. NOTA: Aliquot la solución de stock inmediatamente en viales a prueba de luz. La vida útil de la solución de stock es de 6 meses a -20 °C.</li>
</ol>2. Preparación de la cepa bacteriana E44
NOTA: E44 es una cepa mutante de E. coli meningítica con resistencia a la rifampicina.
<ol><li>Sumerja la colonia E44 criopreservada con una punta de pipeta estéril, inocular la cepa E44 en la placa de agar LB que contiene 100 μg/ml de rifampicina dibujando líneas. Ponga la placa boca abajo en la incubadora a 37 °C durante la noche.</li>
	<li>Un día antes del experimento, elija una colonia E44 de la placa con una punta de pipeta estéril y colóquela en 5 ml de caldo BHI que contenga 100 rifampicina de μg/ml en un matraz de 50 ml. Incubar el cultivo bacteriano a 37 °C con 90 rpm durante 17 h en un agitador de incubación.</li>
</ol>3. Aislamiento de neutrófilos de sangre periférica humana
<ol><li>Extraiga 5 ml de muestra de sangre de voluntarios por vía intravenosa al tubo de recolección de sangre al vacío que contiene EDTA para la anticoagulación.</li>
	<li>Centrífuga las muestras de sangre periférica a 500 x g durante 5 min. Las muestras de sangre se dividen en tres capas por centrifugación, que de abajo a arriba son la capa de glóbulos rojos (RBC), la capa de glóbulos blancos (CMB) y la capa plasmática, secuencialmente.</li>
	<li>Aspirar la capa de glóbulos blancos con un pipete a un nuevo tubo con 3x Tampón de lisis RBC. Mezcle bien la mezcla y colóquelo a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Centrífuga el tubo a 500 x g durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante por completo y descartar.<ol>
<li>Repita el procedimiento de lisis con el búfer de lisis RBC 1-2 veces, hasta que el precipitado se vuelva blanco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave las células resuspendiendo el precipitado con 2 ml de PBS. A continuación, centrífuga a 300 x g durante 5 minutos para dejar que las células se asienten hasta la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Etiquete a los neutrófilos con microperlas CD16 resuspendiendo el sedimento con 50 μL de amortiguador de clasificación de células magnéticas precooled. A continuación, mezcle con 50 μL de microperlas CD16 humanas a fondo. Incubar la mezcla a 4 °C durante 30 min. NOTA: Las soluciones deben preenfriarse para evitar el taponamiento de anticuerpos en la superficie celular y el etiquetado no específico. La mayoría de los adultos tienen entre 4.000 y 10.000 glóbulos blancos por microlitro de sangre, entre los cuales, los neutrófilos representan aproximadamente el 50-70%. Según las estimaciones, los recuentos de glóbulos blancos totales en 5 ml de sangre periférica humana suelen ser de hasta 2-5 x 107.</li>
	<li>Lave las células añadiendo 2 ml de amortiguador de clasificación de células magnéticas y centrífuga a 4 °C, 300 x g durante 10 min. Deseche el sobrenadante por completo y vuelva a gastar el precipitado con 500 μL de búfer de clasificación.</li>
	<li>Monte la columna magnética y el estante de separación. Mueva el separador al estante con la columna magnética y enjuague la columna con 3 ml de búfer de clasificación.</li>
	<li>Suelte la suspensión celular en la columna para permitir que los neutrófilos etiquetados por las cuentas magnéticas se unan a la columna magnética.</li>
	<li>Lávese las celdas no etiquetadas añadiendo 3 ml de búfer de clasificación de células magnéticas 3 veces, asegurándose de que el depósito de columnas esté vacío cada vez.</li>
	<li>Retire la columna del separador magnético y colóquela en un tubo de 15 ml. Agregue 5 ml de búfer de clasificación de células magnéticas a la columna. Expulse las células etiquetadas magnéticas usando un émbolo. NOTA: Para mejorar la pureza de los neutrófilos, los pasos de clasificación pueden repetirse utilizando una nueva columna.</li>
	<li>Centrífuga el tubo a 300 x g durante 5 min, deseche el sobrenadante por completo y resuspend el precipitado con 1 ml de medio de cultivo. Determine el número de celda con un contador de celdas y prepare las celdas para más experimentos.</li>
</ol>4. Medición de ROS
<ol><li>Centrífuga los neutrófilos aislados a 300 x g durante 5 minutos, resuspend el precipitado y ajuste la concentración celular a 2 x 106/ml con un medio de cultivo que contenga una sonda de fluorescencia DHE de 5 μM.</li>
	<li>Incubar los neutrófilos a 37 °C durante 30 minutos para cargar la sonda DHE, y luego asignar la suspensión celular a una microplaca de poliestireno negro de 96 pozos con 200 μL por pozo.</li>
	<li>Encienda el lector de microplacas y abra el software de detección. Elija el formato de placa opaca de 96 pozos y determine el área de lectura.<ol>
<li>Ajuste la fluorescencia (Ex/Em = 518/605 nm) en modo cinético cada 5 minutos durante 60 min a 37 °C. Asegúrese de agitar el plato durante 3 s antes de cada lectura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Saque la microplaca de la incubadora, agregue la E44 cultivada (MOI=100) o el phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA) (100 ng/mL) a cada pozo que contenga neutrófilos precargados con 3 réplicas. Utilice PMA como control positivo.</li>
	<li>Coloque la placa en el lector de microplacas e inicie el ensayo inmediatamente.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+bacterial+meningitis+in+infants+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Acute bacterial meningitis in infants and children.</a> Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11(2010).</li>
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<li>Eichelberger, K. R., Goldman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neutrophil+Isolation+and+Degranulation+Responses+to+Yersinia+pestis+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Neutrophil Isolation and Degranulation Responses to Yersinia pestis Infection.</a> Methods in Molecular Biology. 2010, 197-209 (2019).</li>
<li>Siano, B., Oh, H., Diamond, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+isolation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil isolation protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
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<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Puleston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mitochondrial+Mass%2C+Damage%2C+and+Reactive+Oxygen+Species+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mitochondrial Mass, Damage, and Reactive Oxygen Species by Flow Cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (9), (2015).</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses financieros competidores u otros conflictos de intereses.

Los neutrófilos actúan como el componente más abundante de los glóbulos blancos en la circulación sanguínea humana. Son células efectoras importantes en el sistema inmune humano innato, que construye la primera línea de defensa contra la invasión de patógenos11. La generación de ROS representa uno de los principales mecanismos bactericidas de los neutrófilos después de la fagocitosis11. Estudios recientes han demostrado que una estructura similar a la red liberada por un ne...

La meningitis bacteriana neonatal es una enfermedad infecciosa pediátrica común. Escherichia coli (E. coli)con una cápsula K1 es el patógeno gram-negativo más común que causa meningitis bacteriana neonatal, representando alrededor del 80% de la incidencia total1,2,3. A pesar de los avances en la quimioterapia antimicrobiana y la atención de apoyo, la meningitis bacteriana sigue siendo una de las afecciones más devastadoras con alta morbilidad y mortalidad4.
La aparición de meningitis bacteriana neonatal generalmente comienza con la bacteremia causada por la entrada de bacterias patógenas en la circulación periférica de las lesiones locales de los recién nacidos, seguida de la penetración a través de la barrera blood - brain (BBB) en el cerebro, lo que resulta en la inflamación de las meninges4. La aparición de la bacteremia depende de la interacción entre las bacterias y las células inmunes huésped, incluidos los neutrófilos y los macrófagos, etc. Los neutrófilos, que representan ~50-70% de los glóbulos blancos, son la primera línea de defensa contra las infecciones bacterianas5,6. Durante la invasión de bacterias, los neutrófilos activados son reclutados en los sitios infecciosos y liberan especies reactivas de oxígeno (ROS) incluyendo el anión superóxido, peróxido de hidrógeno, radicales hidroxilos y oxígeno singlete7. El ROS se somete a reacciones redox con la membrana celular, moléculas de ácido nucleico y proteínas de la bacteria, lo que resulta en la lesión y muerte de la bacteria invasora8. Las mitocondrias son el sitio principal de producción de ROS en células eucariotas, y varios oxidases (por ejemplo, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) complejo oxidasa, sistema lipoxigenasa, proteína quinasa C y sistema ciclooxigenasa) median la producción de ROS9,10. La medición en tiempo real de la producción de ROS, que representa el mecanismo antimicrobiano primario en neutrófilos, es un método útil para estudiar la defensa del huésped durante la interacción bacteriana-huésped.
En este protocolo, la producción de ROS dependiente del tiempo en neutrófilos infectados con E. coli meningítica se cuantificó con una sonda ROS fluorescente DHE, detectada por un lector de microplacas de fluorescencia en tiempo real. Este método también se puede aplicar a la evaluación de la producción de ROS en otras células de mamíferos durante la interacción patógeno-huésped.

<table><tbody><tr><td>Tubos centrífugos cónicos de polipropileno de 15 mL</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Agar Corning</td><td>3025</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DINGGUO</td><td>DH010-1.1</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células autenticado</td><td>Bio-rad</td><td>508BR03397</td><td></td></tr><tr><td>Carbinet de seguridad biológica</td><td>Shanghai Lishen</td><td>Hfsafe-1200Lcb2</td><td></td></tr><tr><td>Infusión cerebro-corazón</td><td>BD</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>CD16 Microperlas, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-701</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Changsha Xiangyi</td><td>TDZ5-WS</td><td></td></tr><tr><td>Columnas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Dihidroetidio (DHE)</td><td>MedChemExpress</td><td>104821-25-2</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Cellmax</td><td>SA211.02</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Heraeus</td><td>Hera Cell Tampón</td><td></td></tr><tr><td>de separación MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M5</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Beyoitme</td><td>S1819-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de separación QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Solarbio</td><td>13292-46-1</td><td></td></tr><tr><td>medio RPMI1640</td><td>Sangon Biotech</td><td>E600027-0500</td><td></td></tr><tr><td>Agitador termostático</td><td>Shanghai Zhicheng</td><td>ZWY-100D</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli)es la bacteria Gram-negativa más común que causa meningitis neonatal. La aparición de bacteremia y penetración bacteriana a través de la barrera hematoencefálica son pasos indispensables para el desarrollo de la meningitis E. coli. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) representan los principales mecanismos bactericidas de los neutrófilos para destruir los patógenos invadidos. En este protocolo, la producción de ROS intracelular dependiente del tiempo en neutrófilos infectados con E. coli meningítica se cuantificó utilizando sondas ROS fluorescentes detectadas por un lector de microplacas de fluorescencia en tiempo real. Este método también se puede aplicar a la evaluación de la producción de ROS en células de mamíferos durante las interacciones patógeno-huésped.

Utilizando el protocolo descrito en este artículo, los neutrófilos fueron aislados de la sangre periférica humana y cargados con la sonda de fluorescencia DHE para detectar los cambios de los niveles de ROS en respuesta a la infección por E44. Aquí, proporcionamos datos representativos que demuestran la producción ROS evocada por la cepa E44 determinada por un lector de microplacas en tiempo real. Al añadir cepas E44 a un MOI de 100, los niveles ROS aumentaron inmediatamente y mostraron una tendencia continua al alza con...

La escherichia coli es la principal causa de meningitis bacteriana gram-negativa neonatal. Durante la infección bacteriana, las especies reactivas de oxígeno producidas por neutrófilos desempeñan un papel bactericida importante. Aquí introducimos un método para detectar las especies reactivas de oxígeno en neutrófilos en respuesta a la meningitis E. coli.

Cuantificación en tiempo real de especies reactivas de oxígeno en neutrófilos infectados con escherichia coli meningítica

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

Escherichia Coli es la bacteria gram-negativa más común que causa meningitis neonatal. La aparición de meningitis bacteriana neonatal comienza únicamente con la bacteremia y luego las bacterias en la sangre penetran a través de la barrera hematoencefálica para causar meningitis. Los neutrófilos son la primera línea de defensa contra las infecciones bacterianas.Durante la invasión bacteriana, los neutrófilos activos liberan ROS. ROS representa los principales mecanismos bacteriocidas de las células huésped para destruir los patógenos invasores. Medir la producción de ROS en neutrófilos es un método útil para iniciar la defensa del huésped durante la interacción bacteriana-huésped.Tome una sola colonia bacteriana de la placa con una pipeta estéril y colóquela en un medio de infusión cerebro-corazón de cinco mililitros que contiene rifampicina en un matraz cóncavo. Incubar el cultivo bacteriano a 37 grados centígrados, con 90 RPM durante 17 horas en la incubadora. Centrífuga las muestras de sangre periférica a 2000 RPM durante cinco minutos.Después de la centrífuga, las muestras de sangre se dividen en tres capas. Desde la parte inferior hasta la parte superior, la capa de glóbulos rojos, la capa de glóbulos blancos y la capa plasmática. Aspirar la capa de glóbulos blancos a un nuevo tubo con una pipeta estéril.Agregue tres veces el tampón de lisis de los glóbulos rojos. Mezcle bien la mezcla y colóquelo a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrífuga el tubo a 2000 RPM durante cinco minutos.Aspirar el sobrenadante por completo y descartar. Repita el procedimiento de lisis de los glóbulos rojos durante una o dos veces, hasta que los sedimentos se vuelvan blancos. Lave las células re-suspendiendo el sedimento con dos mililitros PBS.A continuación, centrífuga el tubo a 1000 RPM durante cinco minutos. Resuspend el sedimento con 15 microlitros precodificar amortiguador de clasificación de células magnéticas para 15 millones de células. Agregue 15 microperlas magnéticas de microlitro y mezcle bien.Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. En condiciones normales, el ser humano adulto tiene entre cuatro y 10.000 glóbulos blancos por sangre microlitro. Así que el costo del total de glóbulos blancos en sangre periférica humana de cinco mililitros, casi menos de 50 millones.Y 50 cuentas magnéticas de microlitro en 15 microlitros de clasificación magnética es suficiente. El porcentaje normal de neutrófilos es del 50 al 70% del total de los glóbulos blancos. Así que alrededor de 10 millones de neutrófilos se pueden obtener de sangre de cinco mililitros.Lave las células añadiendo dos mililitros de clasificación magnética, por cada 10 millones de células al tubo, y centrífuga a cuatro grados centígrados, 1.200 RPM durante 10 minutos. Monte la columna magnética y el estante de separación. Deseche el sobrenadante por completo, y resuspend los sedimentos con 500 amortiguadores de clasificación magnética de microlitro para hasta 100 millones de células.Enjuague la columna con un búfer de clasificación magnética de tres mililitros. Aplique la suspensión celular en la columna para permitir que los neutrófilos etiquetados por las cuentas magnéticas, unidas a la columna. Lávese las celdas específicas no específicas añadiendo tres mililitros durante tres veces, una vez que el depósito de columnas esté vacío cada vez.Retire la columna del separador magnético y colóquela en un tubo nuevo. Agregue cinco mililitros de clasificación magnética en la columna. Expulse las células etiquetadas magnéticas usando un émbolo.Centrífuga el tubo a 1.200 RPM durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante por completo, y resuspend el sedimento con un medio de cultivo mililitro. Determine el número de celda con un contador.Se ha ajustado la concentración celular a 2 millones por mililitro en el medio de cultivo que contiene la sonda de fluorescencia DHE. Coloque los neutrófilos en la incubadora durante 30 minutos para cargar la sonda DHE. Asigne la suspensión celular a una microplaca negra de 96 pozos con 200 microlitros por pozo.Encienda el lector de microplacas. Ajuste la temperatura a 37 grados centígrados, elija el modo de lectura de fluorescencia, el tipo de lectura cinética, establezca la longitud de onda de fluorescencia. Elija el formato de placa.Determine el área de lectura. Mida la intensidad de fluorescencia cada cinco minutos durante una hora. Agitar el plato durante tres segundos antes de cada lectura.Saca la microplaca de la incubadora. Añadir cepas PMA o E44 con tres repeticiones. Coloque la placa en el lector de microplacas, pulse el botón de inicio para comenzar el ensayo inmediatamente.Usando el esquema del protocolo en este artículo, los neutrófilos fueron aislados de la sangre periférica humana, y cargados con sonda de fluorescencia DHE. Al agregar PMA, ros intracelular en neutrófilos, mostró un aumento significativo de 20 a 40 minutos, y alcanzó su pico en 60 minutos. Pero creo que las cepas E44, la producción de ROS se produce inmediatamente y aumenta el tiempo de forma dependiente.La expresión de ROS causada por la cepa E44 es similar a la causada por PMA. La detección de la producción de ROS en neutrófilos puede contribuir al estudio posterior de los mecanismos bacteriócidas de los neutrófilos. En este protocolo, proporcionamos una manera más fácil de detectar la producción ros en neutrófilos de una manera en tiempo real.El método simple también podría utilizarse para monitorear la producción de ROS en otros tipos de células anfitrionas durante las interacciones entre el huésped y las bacterias.

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