Name: Evaluación del riesgo agroquímico para las reinas de abejas melíferas apareadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprende a evaluar el riesgo de agroquímicos en reinas de abejas melíferas usando jaulas de monitoreo especializadas. Este protocolo controlado mide la producción de huevos y la eclosión larval tras exposición subletal.

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Gracias a la Dra. Amy Cash-Ahmed, Nathanael J. Beach y Alison L. Sankey por su ayuda en la realización de este trabajo. La mención de nombres comerciales o productos comerciales en esta publicación es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación o respaldo por parte del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos. El USDA es un proveedor y empleador de igualdad de oportunidades. Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa # HR0011-16-2-0019 a Gene E. Robinson y Huimin Zhao, el proyecto 2030-21000-001-00-D del USDA, y la Experiencia de Investigación de Plasticidad Fenotípica para Estudiantes de Colegios Comunitarios en la Universidad de Illinois en Urbana Champaign.

1. Montaje QMC
<ol><li>Ensamble los MGC a partir de piezas (Figura 1A) con una sola placa de puesta de huevos (ELP) insertada como se muestra en la Figura 1B. No agregue tubos de alimentación hasta después de que los trabajadores se hayan agregado a la jaula. Cubra temporalmente los 4 orificios del alimentador con cinta de grado de laboratorio.</li>
	<li>Inserte el exclusor de reina y la puerta de la cámara de alimentación sobre la cámara de alimentación para evitar que la reina entre en la cámara de alimentación y entre en contacto con la dieta tratada. Véase Fine et al.32 para más detalles sobre el montaje.</li>
	<li>Recoja los marcos de peine de cera que contienen la cría obrera tapada de las colonias de abejas melíferas 24 h antes de la eclosión adulta y colóquelos en una incubadora (34.5 ° C) dentro de una caja de cría. 24 horas más tarde, cepille las abejas eclosionadas de los marcos y en un recipiente abierto que haya sido forrado con una pintura de barrera contra insectos (por ejemplo, Fluon) para evitar que las abejas se arrastren.</li>
	<li>Agregue al menos 50 abejas en peso (5 g ≈ 50 abejas44,45) a la cámara de puesta de huevos de cada QMC. Para garantizar que un grupo genético diverso de trabajadores esté representado en el experimento, obtenga un número aproximadamente igual de abejas obreras de al menos tres colonias y mézclelas antes de agregarlas a los MGC. NOTA: Las abejas obreras recién eclosadas de menos de 1 día de edad no pueden volar ni picar debido a sus músculos de vuelo subdesarrollados y su cutícula no endurecida. Si se agregan a esta edad, no hay necesidad de anestesiarlos antes de manipularlos. Se pueden pesar recogiendo suavemente las abejas del recipiente usando una pequeña taza medidora de volumen de 1/4 de taza y colocándolas en un segundo recipiente (forrado con pintura de barrera contra insectos, por ejemplo, Fluon) que ha sido manchado en una báscula. El área de los marcos cubiertos por la cría tapada debe ser aproximadamente igual para garantizar que las colonias de origen estén igualmente representadas en las poblaciones de trabajadores de QMC. La homogeneización de las abejas obreras se puede lograr cepillando las abejas recién eclosadas de los marcos tomados de todas las colonias en el mismo recipiente y permitiéndoles mezclar durante 5 minutos antes de agregarlas a los MGC.</li>
	<li>Añadir los comederos que contengan solución de sacarosa, agua y suplemento de polen (ver sección 2).</li>
	<li>Exponga a las reinas apareadas individuales al gas CO2 para estimular la puesta dehuevos 46 y facilitar la transferencia a QMC.<ol>
<li>Use reinas compradas a un criador comercial dentro de las 48 horas posteriores a la recepción. Mientras la reina todavía está dentro de la jaula de envío, colóquela en una bolsa de plástico transparente. Coloque un extremo de un tubo de plástico conectado a un recipiente de gas CO2 dentro de la bolsa y abra suavemente la válvula del recipiente para permitir que el gas CO2 fluya.</li>
		<li>Cuando la bolsa se haya inflado con gas, cierre simultáneamente la válvula del recipiente y mantenga la bolsa cerrada para atrapar el gas en el interior. Mantenga la bolsa cerrada durante 30 s o hasta que la reina haya dejado de moverse. Retire a la reina y abra la jaula de embarque una vez que se observe que está inconsciente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Abra parcialmente la puerta de la cámara de puesta de huevos, coloque suavemente a la reina inconsciente dentro y cierre la tapa, teniendo cuidado de no aplastar a la reina o a las obreras en el interior. Agregue el segundo plato de puesta de huevos a cada QMC como se muestra en la Figura 1C. Coloque un trozo de cinta de laboratorio en la parte superior de los dos ELP para evitar que se separen del marco QMC y evitar que los trabajadores salgan de la jaula.</li>
	<li>Coloque las jaulas en una incubadora oscura con condiciones ambientales estables de 34 ± 0.5 ° C y 60% ± 10% de humedad relativa, como las condiciones dentro de una colonia normal.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62316/62316fig01.jpg"> Figura 1. R: QMC desmontado. B: QMC parcialmente ensamblado con 1 ELP insertado. C: QMC totalmente ensamblado con 2 ELP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62316/62316fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Preparar y administrar dietas mezcladas con agroquímicos
<ol><li>Para preparar 1000 g de solución de sacarosa al 50% (g/g), coloque una barra de agitación en el fondo de una botella limpia de reactivo de vidrio de 1 L. Añadir 500 g de sacarosa y 500 ml de agua desionizada. Desenrosque la tapa de la botella y use una placa de agitación calentada a fuego lento para mezclar la solución hasta que toda la sacarosa se haya disuelto. Deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de agregar las soluciones de stock de agroquímicos.</li>
	<li>Preparar las soluciones madre de agroquímicos en un disolvente apropiado, como la acetona, a una concentración que se pueda agregar a la dieta para lograr la concentración final deseada del agroquímico de interés. NOTA: Cuando se utiliza acetona como disolvente vehicular, las directrices de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) estipulan que la concentración final de acetona en la dieta debe ser ≤ 5% para las pruebas de toxicidad oral crónica en abejas melíferas adultas47. Sin embargo, algunos disolventes como la n-metil-2-pirrolidona5,31 y el dimetilsulfóxido25 puedenejercer efectos tóxicos por debajo de esta concentración, por lo que se recomienda mantener las concentraciones de disolventes lo más bajas posible en la dieta de tratamiento. Dependiendo del volumen y el tipo de disolvente utilizado, puede ser necesario incluir tanto un grupo de control de disolventes como un grupo de control negativo para garantizar que se detecten los posibles efectos debidos a la toxicidad del disolvente. Cuando se utilizan productos formulados, la cantidad del producto utilizado debe ajustarse en función de la concentración presente en la formulación. Dependiendo de la estabilidad del agroquímico de interés en el disolvente, las soluciones madre se pueden mantener durante un máximo de 2 semanas a -20 °C.</li>
	<li>Seleccionar dosis subletales basadas en los resultados de la Prueba Nº 245 de la OCDE: Abeja melífera(Apis mellifera L.),Prueba de toxicidad oral crónica (alimentación de 10días) 47,e identificar la literatura relevante consultando la base de conocimientos de Ecotox48.</li>
	<li>Administre los tratamientos agroquímicos en una solución de sacarosa, un suplemento de polen comercial (si está disponible en polvo) o ambos. Prepare la dieta experimental para su uso el mismo día agregando una cantidad adecuada de solución madre a la solución de sacarosa al 50% refrigerada / temperatura ambiente (p / p). Mezclar bien por vórtice o con una barra de agitación ajustada a velocidad media. Para los suplementos de polen, agregue la solución de sacarosa con agroquímicos al suplemento en polvo en lugar del jarabe de acuerdo con los protocolos del fabricante, asegurándose de ajustar el volumen de la solución madre utilizada de acuerdo con el peso final de la dieta de polen. Véase la Tabla 1 para ver cálculos de ejemplo.</li>
	<li>Prepare los tubos de alimentación a partir de tubos de microcentrífuga de 2 ml.<ol>
<li>Para los comederos de dieta líquida, caliente la punta de una aguja de calibre 20 en una placa caliente / estufa y perfore la parte inferior del tubo dos veces. Cierre la tapa del tubo y la pipete con aproximadamente 1,5 ml de solución de sacarosa o agua a través de uno de los orificios de punción. Coloque el tubo hacia abajo con el lado perforado hacia arriba hasta que se agregue al QMC.</li>
		<li>Para los comederos de suplementos de polen, use una cuchilla de afeitar para cortar la parte inferior del tubo. Cierre la tapa y empuje una bola de 1-2 g de suplemento de polen en el tubo hasta que toque la tapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registre los pesos del alimentador antes de colocarlos en los MGC. No mantenga la dieta no utilizada a 4 °C durante más de 48 horas.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Concentración deseada</td>
			<td>Concentración deseada de vehículos solventes</td>
			<td>Volumen/masa final deseada de solución de sacarosa</td>
			<td>Voume de solución de stock</td>
			<td>Imidacloprid en solución madre</td>
			<td>Receta de solución de stock sugerida</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución de sacarosa</td>
			<td>10 ppb (w/w)</td>
			<td>0.05% (v/v)</td>
			<td>81,45 ml/100 g*</td>
			<td>40,7 μL</td>
			<td>0,001 mg/40,7 μL</td>
			<td>0,02 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suplemento de polen</td>
			<td>10 ppb (w/w)</td>
			<td></td>
			<td>10 g**</td>
			<td>4,07 μL</td>
			<td>0,0001 mg/4,07 μL</td>
			<td>0,02 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución de sacarosa</td>
			<td>50 ppb (w/w)</td>
			<td>0.05% (v/v)</td>
			<td>78,5 ml/100 g*</td>
			<td>40,7 μL</td>
			<td>0,005 mg/40,7 μL</td>
			<td>0,1 mg/814 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Suplemento de polen</td>
			<td>50 ppb (w/w)</td>
			<td></td>
			<td>10 g**</td>
			<td>4,07 μL</td>
			<td>0,0005 mg/4,07 μL</td>
			<td>0,1 mg/814 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Ejemplos de recetas para solución de sacarosa tratada, suplemento de polen y solución madre. *Volumen basado en la densidad de solución de sacarosa al 50% (p/p) (1.228 g/mL). **La densidad del suplemento de polen variará dependiendo del producto que se utilice, pero si se utiliza este volumen de disolvente, la concentración final de disolvente en el suplemento de polen estará dentro del rango deseado de ≤ 5% por volumen.
3. Monitoreo - Tasa de producción de huevos
<ol><li>Cuantifique la puesta de huevos de 1 a 2 veces al día por la mañana y / o por la noche. Comience por retirar los MGC de la incubadora para verificar si hay huevos. NOTA: En un experimento exitoso, la producción de huevos comenzará en la mayoría de los MGC de control dentro de los 3 días posteriores al ensamblaje inicial de la jaula. Solo saque tantos MGC de la incubadora a la vez que se puedan verificar y alimentar dentro de los 10 minutos. Los períodos más largos fuera de la incubadora pueden interrumpir la producción de huevos.</li>
	<li>Examine la parte posterior de los ELP claros en busca de huevos. Si hay huevos, retire el panel de la puerta frente a la placa de interés. Retire la cinta de los ELP y deslice cuidadosamente el panel de la puerta entre el ELP y las abejas dentro del QMC, teniendo cuidado de no aplastar a ninguna abeja que pueda estar limpiando las células en los ELP.</li>
	<li>Con el panel de la puerta en su lugar, retire el ELP y cuente y registre el número de óvulos dentro de las células ELP. Retire los huevos golpeando el borde del ELP, abierto del lado de la celda hacia abajo, sobre una superficie dura (como el labio de un recipiente de desechos). Una vez que los huevos se caigan, reemplace el ELP vacío en el QMC. Retire y reemplace suavemente el panel de la puerta detrás del ELP en el exterior del QMC. Repita según sea necesario con el segundo ELP y reemplace la cinta en todo el QMC cuando haya terminado. NOTA: La producción de huevos generalmente disminuye y la mortalidad aumenta en los MGC después de 2 semanas32,33, por lo tanto, se recomienda concluir los experimentos después de 14 días.</li>
</ol>4. Monitoreo - Consumo de alimentos
<ol><li>Reemplace todos los alimentos que quedan en los comederos QMC con una dieta recién preparada cada dos días. Prepare nuevos tubos de alimentación (incluido el agua) y péselos antes de retirar los MGC de la incubadora para su monitoreo. Cambie todos los tubos viejos por otros nuevos y pese los tubos viejos antes de deshacerse de la dieta no consumida. Compare el peso final del tubo alimentador y la dieta no consumida con el peso del mismo tubo alimentador antes de colocarlo en el QMC para estimar el consumo de dieta.</li>
	<li>Entre los días en que se programe el reemplazo de los comederos, verifique el consumo de dieta una vez al día (al mismo tiempo que se monitorean los MGC para la producción de huevos) para asegurarse de que los comederos nunca estén vacíos. Si un tubo alimentador está vacío o casi vacío, retírelo, vuelva a llenarlo, registre el peso del tubo antes y después y agregue la diferencia al consumo total de dieta de 2 días para el QMC.</li>
</ol>5. Monitorización - Viabilidad embrionaria
<ol><li>En un punto seleccionado durante un experimento de QMC, retire los ELP que contengan huevos recién puestos del QMC de acuerdo con el paso 3,pero no desaloje los huevos del ELP.</li>
	<li>Cubra el ELP con una tapa universal de microplaca y colóquelo dentro de un desecador con una solución saturada K2SO4 (150 g K2SO4 en 1 L de agua, mantenido en un plato poco profundo). NOTA: Un poco de sal debe ser visible en el fondo del plato después de que la mezcla llegue a la temperatura en la incubadora.</li>
	<li>Mantenga el desecador en una incubadora a 34,5 °C, lo que resulta en una humedad relativa del 95% dentro del desecador, similar a las condiciones utilizadas por Collins49. NOTA: Casi todos los huevos eclosionarán dentro de las 72 ± 6 horas de cuando se pusieron49,por lo tanto, las tasas de eclosión se pueden evaluar tan pronto como 78 horas después de que los ELP fueron retirados del QMC. Una larva en forma de "C" en la parte inferior de la célula es indicativa de un evento de eclosión exitoso. Alguna variación en este tiempo es posible si, por ejemplo, los huevos son drones y no trabajadores50.</li>
</ol>6. Muestreo de trabajadores
<ol><li>Si los MGC se han llenado con exceso de trabajadores, muestree las abejas obreras en un punto de tiempo seleccionado durante el experimento para evaluar los cambios inducidos por el tratamiento en su fisiología. Realice las colecciones junto con las actividades diarias de alimentación y conteo de huevos para minimizar el tiempo durante el cual los MGC están fuera de la incubadora.</li>
	<li>Antes del muestreo, coloque un panel de puerta entre un ELP y el interior del QMC, y retire el ELP. Levante con cuidado el panel de la puerta aproximadamente a 0,5 cm de la base de la jaula y retire una abeja obrera del interior del QMC con pinzas de peso pluma. Para evitar que las abejas se escapen, cubra partes de la abertura de 0,5 cm con un dedo enguantado o un trozo de algodón según sea necesario.</li>
	<li>Conserve la abeja recolectada para el análisis de seguimiento y repita este proceso hasta que se haya recolectado el número deseado de muestras. Para el análisis de la expresión génica, se recomienda encarecidamente la congelación instantánea de abejas en nitrógeno líquido y el almacenamiento inmediato a -80 °C51.</li>
</ol>7. Mortalidad de los trabajadores
<ol><li>Evalúe la mortalidad de los trabajadores durante el experimento contando el número de abejas muertas en la parte inferior de la cámara de alimentación y la cámara de puesta de huevos. Realice esta evaluación junto con la cuantificación diaria de la puesta de huevos.</li>
	<li>Usando fórceps, retire cuidadosamente las abejas muertas a través de los orificios del comedero, cubriendo el orificio con un dedo enguantado o un trozo de algodón mientras las pinzas no estén insertadas.</li>
	<li>Retire las abejas muertas de la cámara de puesta de huevos levantando cuidadosamente el panel de la puerta aproximadamente a 0,5 cm de la base de la jaula e insertando pinzas. Para evitar que las abejas se escapen, cubra partes de la abertura de 0,5 cm con un dedo enguantado o un trozo de algodón según sea necesario.</li>
	<li>Evalúe la mortalidad de los trabajadores al final del experimento eliminando y contando todas las abejas muertas de los MGC utilizando los métodos descritos anteriormente antes de sacrificar a las abejas restantes. NOTA: En ausencia de abejas obreras, las reinas no producirán huevos y morirán de hambre dentro de las 24 horas. Por lo tanto, si se observa que todos los trabajadores de un QMC están muertos, el QMC debe eliminarse del experimento. Del mismo modo, si una reina muere durante el experimento, el QMC debe eliminarse y los datos deben censurarse adecuadamente.</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

La fecundidad de las hembras de insectos solitarios, así como de las reinas en las colonias de insectos eusociales, puede estar influenciada por factores estresantes abióticos como los agroquímicos25,28, 29,30,33. En las abejas melíferas, los efectos de los agroquímicos en las reinas pueden ser indirectos, ya que pueden ocurrir a través de cambios en su cuidad...

Debido al aumento de la demanda mundial de productos agrícolas, las prácticas agrícolas modernas a menudo requieren el uso de agroquímicos para controlar numerosas plagas conocidas por reducir o dañar los rendimientos de los cultivos1. Simultáneamente, los productores de muchos cultivos de frutas, verduras y nueces dependen de los servicios de polinización proporcionados por las colonias comerciales de abejas melíferas para garantizar abundantes rendimientos decultivos 2. Estas prácticas pueden dar lugar a que los polinizadores, incluidas las abejasmelíferas (Apis mellifera),estén expuestos a niveles nocivos de residuos de plaguicidas3. Al mismo tiempo, la presencia generalizada de infestaciones parasitarias de ácaros Varroa destructor en colonias de abejas melíferas con frecuencia requiere que los apicultores traten sus colmenas con miticidas, lo que también puede ejercer efectos negativos sobre la salud y la longevidad de la colonia4,5,6. Para reducir y mitigar los efectos nocivos de los productos agroquímicos, es necesario evaluar completamente su seguridad para las abejas melíferas antes de su implementación para que se puedan hacer recomendaciones para su uso para proteger a los insectos beneficiosos.
Actualmente, la Agencia de Protección Ambiental (EPA) se basa en una estrategia de evaluación de riesgos escalonada para la exposición a pesticidas de abejas melíferas, que implica pruebas de laboratorio en abejas adultas y, a veces, larvas de abejas melíferas7. Si las pruebas de laboratorio de nivel inferior no logran aliviar las preocupaciones de toxicidad, se pueden recomendar pruebas de campo y semicampo de nivel superior. Si bien estas pruebas de laboratorio proporcionan información valiosa sobre los efectos potenciales de los agroquímicos en la longevidad de los trabajadores, no son necesariamente predictivas de sus efectos en las reinas, que difieren significativamente de las obreras biológicamente8 y conductualmente9. Además, existen numerosos efectos potenciales de los agroquímicos sobre los insectos más allá de la mortalidad, lo que puede tener consecuencias considerables para los insectos sociales que dependen de comportamientos coordinados para funcionar como una unidad de colonia10,11.
Aunque la mortalidad es el efecto más comúnmente considerado de los plaguicidas agroquímicos12,estos productos pueden tener una amplia gama de efectos tanto en artrópodos objetivo como no objetivo, incluido el comportamiento alterado13,14,15,16,repelencia o atracción17,18,19,cambios en los patrones de alimentación20,21,22 , y aumento o disminución de la fecundidad20,21,22,23,24,25. Para los insectos sociales, estos efectos pueden interrumpir sistemáticamente las interacciones y funciones de las colonias11. De estas funciones, la reproducción, que depende en gran medida de una sola reina ponedora de huevos apoyada por el resto de la unidad9de la colonia, puede ser particularmente vulnerable a la perturbación debido a la exposición a pesticidas.
Los estudios realizados en reinas inmaduras han demostrado que la exposición del desarrollo a miticidas puede afectar el comportamiento de las reinas adultas, la fisiología, la supervivencia26,27. Del mismo modo, los estudios que utilizan colonias de tamaño completo o reducido han demostrado que los agroquímicos pueden afectar a las reinas adultas de las abejas melíferas al disminuir el éxito de apareamiento28,disminuir la oviposición29y disminuir la viabilidad de los huevos producidos25,30,31. Estos fenómenos han sido previamente difíciles de observar sin el uso de colonias enteras, debido en gran parte a la falta de métodos de laboratorio disponibles. Sin embargo, un método para estudiar la oviposición de reinas en condiciones de laboratorio estrechamente controladas utilizando Jaulas de Monitoreo de Reinas (QMC)32 ha sido adaptado recientemente para examinar los efectos de los agroquímicos en la fecundidad de las reinas33. Aquí, estas técnicas se describen en detalle junto con métodos adicionales para medir y rastrear el consumo de la dieta de los trabajadores en los MGC.
Estos métodos son más ventajosos que los experimentos que requieren colonias de tamaño completo porque permiten la administración de dosis precisas de agroquímicos a un número muy reducido de trabajadores en relación con las decenas de miles típicamente presentes dentro de una colonia34,que luego aprovisionan a la reina. Esta técnica de exposición refleja la exposición de segunda mano que las reinas experimentarían en escenarios del mundo real porque, dentro de una colonia, las reinas no se alimentan y dependen de las obreras para proporcionarles una dieta9. Del mismo modo, las reinas generalmente no abandonan la colmena excepto durante la reproducción de la colonia (enjambre) para los vuelos de apareamiento35. Las reinas de abejas melíferas apareadas se pueden comprar a criadores de reinas comerciales y enviarse durante la noche. Por lo general, los criadores de reinas venden reinas directamente después de confirmar que han comenzado a poner huevos, lo que se toma como una indicación de apareamiento exitoso. Si se necesita información más precisa sobre la edad de la reina o la relación, los investigadores pueden consultar con el criador de reinas antes de realizar un pedido.
Los MGC permiten la observación precisa y la cuantificación de la oviposición de la reina abeja melífera y las tasas de eclosión dehuevos 32,33, lo que arroja datos valiosos relacionados con los efectos de la exposición a agroquímicos en la fecundidad de la reina. Los resultados representativos presentados aquí describen un experimento que cuantifica la oviposición, el consumo de dieta y la viabilidad embrionaria en MGC bajo exposición crónica a concentraciones relevantes para el campo del pesticida neonicotinoide neurotóxico sistémico imidacloprid36. Una vez aplicado, el imidacloprid se transloca a los tejidos vegetales37,y se han detectado residuos del polen y néctar de numerosas plantas polinizadas por abejas38,39,40. La exposición al imidacloprid puede tener una amplia gama de efectos perjudiciales sobre las abejas melíferas, incluido el rendimiento de forrajeo deteriorado16,la función inmune deteriorada41y la disminución de las tasas de expansión y supervivencia de la colonia42,43. Aquí, el imidacloprid fue seleccionado para su uso como sustancia de prueba porque los experimentos de campo han demostrado que puede afectar la oviposición de la reina de la abejamelífera 29

<table><tbody><tr><td>Fluon</td><td>BioQuip, Rancho Domínguez, CA</td><td>2871A</td><td></td></tr><tr><td>Reinas de las abejas melíferas</td><td>Olivarez Honey Bees, Orland, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidacloprid</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>37894</td><td></td></tr><tr><td>MegaBee Powder</td><td>MegaBee, San Dieago, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>02-682-004</td><td></td></tr><tr><td>Agujas calibre 20</td><td>W. W. Grainger, Lake Forest, IL</td><td>5FVK4</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de potasio</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Jaulas de monitoreo</td><td>Queen Universidad de Illinois Urbana-Champaign</td><td></td><td>Número de solicitud de patente: 20190350175</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Tapas de microplacas universales</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>5500</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación del riesgo agroquímico para las reinas de abejas melíferas apareadas

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Las estrategias actuales de evaluación de riesgos para las abejas melíferas dependen en gran medida de las pruebas de laboratorio realizadas en abejas obreras adultas o inmaduras, pero estos métodos pueden no capturar con precisión los efectos de la exposición a agroquímicos en las reinas de las abejas melíferas. Como el único productor de huevos fertilizados dentro de una colonia de abejas melíferas, la reina es posiblemente el miembro individual más importante de una unidad de colonia en funcionamiento. Por lo tanto, comprender cómo los agroquímicos afectan la salud y la productividad de las reinas debe considerarse un aspecto crítico de la evaluación del riesgo de los plaguicidas. Aquí, se presenta un método adaptado para exponer a las reinas de las abejas melíferas y a las asistentes de las reinas obreras a los factores estresantes agroquímicos administrados a través de una dieta de trabajadores, seguido de un seguimiento de la producción de huevos en el laboratorio y la evaluación de la primera eclosión instar utilizando una jaula especializada, conocida como jaula de monitoreo de reinas. Para ilustrar el uso previsto del método, se describen los resultados de un experimento en el que los asistentes a la reina obrera fueron alimentados con una dieta que contenía dosis subletales de imidacloprid y se monitorearon los efectos en las reinas.

La producción de huevos se monitoreó en CGC ensamblados y mantenidos como se describió anteriormente con observaciones una vez al día de la producción de huevos y 15 jaulas por grupo de tratamiento. Las reinas recién apareadas de ganado carniolan principalmente fueron compradas y enviadas durante la noche a un criador de reinas, y las obreras de abejas melíferas se obtuvieron de 3 colonias mantenidas de acuerdo con métodos comerciales estándar en The Bee Research Facility en la Universidad de Illinois Urbana-Champaign. A...

Este protocolo fue desarrollado para mejorar la comprensión de cómo los agroquímicos afectan la reproducción de lasabejas melíferas (Apis mellifera)mediante el establecimiento de métodos para exponer a las reinas de las abejas melíferas y sus cuidadores trabajadores a los agroquímicos en un entorno controlado y de laboratorio y monitoreando cuidadosamente sus respuestas relevantes.

Evaluación del riesgo agroquímico para las reinas de abejas melíferas apareadas

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

La exposición a agroquímicos puede tener un gran impacto en todos los miembros de una colonia de abejas melíferas, incluido el miembro más importante, las reinas. Pero hasta hace poco, pocas herramientas han estado disponibles para estudiar estos efectos. Esta técnica permite a los investigadores exponer a las reinas a agroquímicos en condiciones controladas que simulan las condiciones que podrían experimentar en el campo.Es bastante fácil alterar los comportamientos de puesta de huevos de la reina melífera, por lo que es importante tener cuidado al manipular obreras y reinas antes y durante el experimento. La demostración de estos procedimientos será, Amy Floyd y Eliza Litsey, técnicas de laboratorio en la Unidad de Investigación de Especies Invasoras y Salud de Polinizadores, Laboratorio de Investigación de Abejas Melíferas. Para comenzar, ensamble jaulas de monitoreo de reinas, o MGC, insertando los paneles de las puertas, luego inserte el exclusor de reinas en la puerta de la cámara de alimentación sobre la cámara de alimentación, para evitar que la reina entre y entre en contacto con la dieta tratada.Inserte un único ELP. No agregue tubos de alimentación hasta después de que los trabajadores se hayan agregado a la jaula, y cubra temporalmente los cuatro orificios del alimentador con cinta de grado de laboratorio. Después de recolectar e incubar los marcos de peine de cera que contienen la cría obrera tapada de las colonias de abejas melíferas, cepille las abejas cerradas en un recipiente abierto forrado con una pintura de barrera contra insectos, para evitar que las abejas se arrastren.Agregue al menos 50 abejas por peso a la cámara de puesta de huevos de cada QMC. Para garantizar que se introduzca un acervo genético diverso, obtenga un número similar de abejas obreras de al menos tres colonias y permítales mezclarse antes de agregar abejas a los MGC. Agregue los comederos que contengan solución de sacarosa, agua y suplemento de polen.Use reinas compradas a un criador comercial dentro de las 48 horas posteriores a la recepción. Mientras la reina todavía está dentro de la jaula de envío, colóquela en una bolsa de plástico transparente. Luego coloque un extremo de un tubo de plástico conectado a un recipiente de gas de dióxido de carbono dentro de la bolsa y abra suavemente la válvula del recipiente para permitir que el gas de dióxido de carbono fluya.Cuando la bolsa se haya inflado con gas, cierre simultáneamente la válvula del recipiente y mantenga la bolsa cerrada para atrapar el gas en su interior. Mantenga la bolsa cerrada durante 30 segundos o hasta que la reina haya dejado de moverse. Retire a la reina abriendo la jaula de embarque una vez que se observe que la reina está inconsciente.Abra parcialmente la puerta de la cámara de puesta de huevos, coloque suavemente a la reina inconsciente dentro y cierre la tapa. Agregue el segundo ELP a cada QMC. Coloque un trozo de cinta de laboratorio en la parte superior de los dos ELP para evitar que se separen del marco QMC y evitar que los trabajadores salgan de la jaula.Coloque las jaulas en una incubadora oscura con condiciones ambientales estables de 34 a 35 grados centígrados y 50-70% de humedad relativa. Para administrar la dieta mezclada con agroquímicos, prepare las soluciones madre de agroquímicos en un solvente apropiado, como la acetona, a una concentración que se pueda agregar a la dieta para lograr la concentración final deseada del agroquímico de interés. Administrar los tratamientos agroquímicos en una solución de sacarosa, un suplemento de polen comercial o ambos.Prepare la dieta experimental para su uso en el mismo día, agregando una cantidad adecuada de solución madre a la solución refrigerada o a temperatura ambiente, 50% de sacarosa. Mezclar bien mediante vórtice a una velocidad media. Para los suplementos de polen, agregue una cantidad calculada de solución madre de agroquímicos a la solución de sacarosa y vórtice a fondo antes de agregarlo al suplemento en polvo.Agregue la dieta a los tubos de alimentación y registre los pesos del alimentador antes de colocarlos en el QMC. Para cuantificar la puesta de huevos, comience por eliminar los MGC de la incubadora. Examine la parte posterior de los ELP transparentes, si hay huevos presentes, retire el panel de la puerta frente a la placa de interés.Retire la cinta de los ELP y deslice el panel de la puerta entre el ELP y las abejas dentro del QMC. Con el panel de la puerta en su lugar, retire el ELP y cuente y registre el número de óvulos dentro de las células ELP. Retire los huevos golpeando el borde del el lado de celda abierta ELP hacia abajo, en una superficie dura.Una vez que los huevos se caigan, reemplace el ELP vacío en el QMC. Retire y reemplace suavemente el panel de la puerta detrás del ELP en el exterior del QMC. Repita según sea necesario con el segundo ELP y reemplace la cinta en todo el QMC cuando haya terminado.Para controlar el consumo de alimentos, reemplace los alimentos con una dieta recién preparada cada dos días. Prepare nuevos tubos de alimentación y péselos antes de comenzar las actividades de monitoreo de la producción de huevos. Cambie los tubos viejos por otros nuevos y pese los tubos viejos antes de desecharlos.Compare el peso final del tubo alimentador y la dieta no consumida con el peso del mismo tubo, para estimar el consumo de dieta. Verifique una vez al día para asegurarse de que los comederos nunca estén vacíos. Si un tubo alimentador está vacío o casi vacío, retírelo, vuelva a llenarlo, registre el peso del tubo antes y después, y agregue la diferencia al consumo total de dieta de dos días para el QMC.En un punto seleccionado durante un experimento de QMC, retire los ELP que contienen huevos recién puestos del QMC como se describió anteriormente, pero no desaloje los huevos del ELP. Cubra el ELP primero con un sello de placa de PCR, y luego una tapa de microplaca universal, y colóquelo dentro de un desecador con una solución saturada de sulfato de potasio. Evalúe las tasas de eclosión aproximadamente 78 horas después de eliminar los ELP del QMC.Una larva en forma de C en la parte inferior de la célula es indicativa de un evento de eclosión exitoso. Si los MGC se habían llenado con exceso de trabajadores, muestree las abejas obreras en un punto de tiempo seleccionado durante el experimento para evaluar los cambios inducidos por el tratamiento en su fisiología. Antes del muestreo, coloque un panel de puerta entre un ELP y el interior del QMC, y retire el ELP.Con cuidado, levante el panel de la puerta aproximadamente a 0,5 centímetros de la base de la jaula y retire una abeja obrera del interior del QMC con pinzas de peso pluma. Para el análisis de la expresión génica, congele las abejas en nitrógeno líquido y guárdelas a 80 grados centígrados. Conserve la abeja recolectada para el análisis de seguimiento y repita este proceso hasta que se haya recolectado el número deseado de muestras.Los cambios relacionados con el tratamiento con imidacloprid en la dieta en los recuentos diarios de óvulos se evaluaron mediante la implementación de una ecuación de estimación generalizada lineal logarítmica de Poisson, con una matriz de correlación autorregresiva. La producción diaria de huevos fue significativamente menor en los MGC que recibieron suplementos de polen y sacarosa que contenían 50 partes por billón de imidacloprid. Se observó un efecto dependiente de la dosis sobre el número total de óvulos producidos en cada QMC para los tratamientos con imidacloprid administrados tanto en sacarosa como en suplemento de polen.Con la mayor reducción observada en los MGC alimentados con 50 partes por billón de imidacloprid, seguido de 10 partes por mil millones en suplemento de polen más sacarosa. No se observaron diferencias en el total de huevos producidos entre el control y los MGC alimentados con 10 partes por billón de imidacloprid y suplemento de polen solo. El consumo de suplementos de polen, agua y sacarosa se registró cada 48 horas durante 10 o 12 días.Las tasas diarias de consumo de sacarosa aumentaron significativamente a medida que avanzaba el experimento, pero las tasas de consumo de suplementos de polen disminuyeron. Se observaron tasas más altas de consumo de polen cuando se administraron 10 partes por billón de imidacloprid solo en suplemento de polen. Y la tasa disminuyó cuando se administraron 10 o 50 partes por mil millones en suplemento de polen y solución de sacarosa juntos.El uso de abejas de un día es fundamental para garantizar la aceptación de la reina y reducir la reactivación de la obrera. También es fundamental el manejo cuidadoso de la reina y mantener las jaulas en un ambiente estable.

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