Evaluación del riesgo agroquímico para las reinas de abejas melíferas apareadas

Este protocolo fue desarrollado para mejorar la comprensión de cómo los agroquímicos afectan la reproducción de lasabejas melíferas (Apis mellifera)mediante el establecimiento de métodos para exponer a las reinas de las abejas melíferas y sus cuidadores trabajadores a los agroquímicos en un entorno controlado y de laboratorio y monitoreando cuidadosamente sus respuestas relevantes.

La exposición a agroquímicos puede tener un gran impacto en todos los miembros de una colonia de abejas melíferas, incluido el miembro más importante, las reinas. Pero hasta hace poco, pocas herramientas han estado disponibles para estudiar estos efectos. Esta técnica permite a los investigadores exponer a las reinas a agroquímicos en condiciones controladas que simulan las condiciones que podrían experimentar en el campo.

Es bastante fácil alterar los comportamientos de puesta de huevos de la reina melífera, por lo que es importante tener cuidado al manipular obreras y reinas antes y durante el experimento. La demostración de estos procedimientos será, Amy Floyd y Eliza Litsey, técnicas de laboratorio en la Unidad de Investigación de Especies Invasoras y Salud de Polinizadores, Laboratorio de Investigación de Abejas Melíferas. Para comenzar, ensamble jaulas de monitoreo de reinas, o MGC, insertando los paneles de las puertas, luego inserte el exclusor de reinas en la puerta de la cámara de alimentación sobre la cámara de alimentación, para evitar que la reina entre y entre en contacto con la dieta tratada.

Inserte un único ELP. No agregue tubos de alimentación hasta después de que los trabajadores se hayan agregado a la jaula, y cubra temporalmente los cuatro orificios del alimentador con cinta de grado de laboratorio. Después de recolectar e incubar los marcos de peine de cera que contienen la cría obrera tapada de las colonias de abejas melíferas, cepille las abejas cerradas en un recipiente abierto forrado con una pintura de barrera contra insectos, para evitar que las abejas se arrastren.

Agregue al menos 50 abejas por peso a la cámara de puesta de huevos de cada QMC. Para garantizar que se introduzca un acervo genético diverso, obtenga un número similar de abejas obreras de al menos tres colonias y permítales mezclarse antes de agregar abejas a los MGC. Agregue los comederos que contengan solución de sacarosa, agua y suplemento de polen.

Use reinas compradas a un criador comercial dentro de las 48 horas posteriores a la recepción. Mientras la reina todavía está dentro de la jaula de envío, colóquela en una bolsa de plástico transparente. Luego coloque un extremo de un tubo de plástico conectado a un recipiente de gas de dióxido de carbono dentro de la bolsa y abra suavemente la válvula del recipiente para permitir que el gas de dióxido de carbono fluya.

Cuando la bolsa se haya inflado con gas, cierre simultáneamente la válvula del recipiente y mantenga la bolsa cerrada para atrapar el gas en su interior. Mantenga la bolsa cerrada durante 30 segundos o hasta que la reina haya dejado de moverse. Retire a la reina abriendo la jaula de embarque una vez que se observe que la reina está inconsciente.

Abra parcialmente la puerta de la cámara de puesta de huevos, coloque suavemente a la reina inconsciente dentro y cierre la tapa. Agregue el segundo ELP a cada QMC. Coloque un trozo de cinta de laboratorio en la parte superior de los dos ELP para evitar que se separen del marco QMC y evitar que los trabajadores salgan de la jaula.

Coloque las jaulas en una incubadora oscura con condiciones ambientales estables de 34 a 35 grados centígrados y 50-70% de humedad relativa. Para administrar la dieta mezclada con agroquímicos, prepare las soluciones madre de agroquímicos en un solvente apropiado, como la acetona, a una concentración que se pueda agregar a la dieta para lograr la concentración final deseada del agroquímico de interés. Administrar los tratamientos agroquímicos en una solución de sacarosa, un suplemento de polen comercial o ambos.

Prepare la dieta experimental para su uso en el mismo día, agregando una cantidad adecuada de solución madre a la solución refrigerada o a temperatura ambiente, 50% de sacarosa. Mezclar bien mediante vórtice a una velocidad media. Para los suplementos de polen, agregue una cantidad calculada de solución madre de agroquímicos a la solución de sacarosa y vórtice a fondo antes de agregarlo al suplemento en polvo.

Agregue la dieta a los tubos de alimentación y registre los pesos del alimentador antes de colocarlos en el QMC. Para cuantificar la puesta de huevos, comience por eliminar los MGC de la incubadora. Examine la parte posterior de los ELP transparentes, si hay huevos presentes, retire el panel de la puerta frente a la placa de interés.

Retire la cinta de los ELP y deslice el panel de la puerta entre el ELP y las abejas dentro del QMC. Con el panel de la puerta en su lugar, retire el ELP y cuente y registre el número de óvulos dentro de las células ELP. Retire los huevos golpeando el borde del el lado de celda abierta ELP hacia abajo, en una superficie dura.

Una vez que los huevos se caigan, reemplace el ELP vacío en el QMC. Retire y reemplace suavemente el panel de la puerta detrás del ELP en el exterior del QMC. Repita según sea necesario con el segundo ELP y reemplace la cinta en todo el QMC cuando haya terminado.

Para controlar el consumo de alimentos, reemplace los alimentos con una dieta recién preparada cada dos días. Prepare nuevos tubos de alimentación y péselos antes de comenzar las actividades de monitoreo de la producción de huevos. Cambie los tubos viejos por otros nuevos y pese los tubos viejos antes de desecharlos.

Compare el peso final del tubo alimentador y la dieta no consumida con el peso del mismo tubo, para estimar el consumo de dieta. Verifique una vez al día para asegurarse de que los comederos nunca estén vacíos. Si un tubo alimentador está vacío o casi vacío, retírelo, vuelva a llenarlo, registre el peso del tubo antes y después, y agregue la diferencia al consumo total de dieta de dos días para el QMC.

En un punto seleccionado durante un experimento de QMC, retire los ELP que contienen huevos recién puestos del QMC como se describió anteriormente, pero no desaloje los huevos del ELP. Cubra el ELP primero con un sello de placa de PCR, y luego una tapa de microplaca universal, y colóquelo dentro de un desecador con una solución saturada de sulfato de potasio. Evalúe las tasas de eclosión aproximadamente 78 horas después de eliminar los ELP del QMC.

Una larva en forma de C en la parte inferior de la célula es indicativa de un evento de eclosión exitoso. Si los MGC se habían llenado con exceso de trabajadores, muestree las abejas obreras en un punto de tiempo seleccionado durante el experimento para evaluar los cambios inducidos por el tratamiento en su fisiología. Antes del muestreo, coloque un panel de puerta entre un ELP y el interior del QMC, y retire el ELP.

Con cuidado, levante el panel de la puerta aproximadamente a 0,5 centímetros de la base de la jaula y retire una abeja obrera del interior del QMC con pinzas de peso pluma. Para el análisis de la expresión génica, congele las abejas en nitrógeno líquido y guárdelas a 80 grados centígrados. Conserve la abeja recolectada para el análisis de seguimiento y repita este proceso hasta que se haya recolectado el número deseado de muestras.

Los cambios relacionados con el tratamiento con imidacloprid en la dieta en los recuentos diarios de óvulos se evaluaron mediante la implementación de una ecuación de estimación generalizada lineal logarítmica de Poisson, con una matriz de correlación autorregresiva. La producción diaria de huevos fue significativamente menor en los MGC que recibieron suplementos de polen y sacarosa que contenían 50 partes por billón de imidacloprid. Se observó un efecto dependiente de la dosis sobre el número total de óvulos producidos en cada QMC para los tratamientos con imidacloprid administrados tanto en sacarosa como en suplemento de polen.

Con la mayor reducción observada en los MGC alimentados con 50 partes por billón de imidacloprid, seguido de 10 partes por mil millones en suplemento de polen más sacarosa. No se observaron diferencias en el total de huevos producidos entre el control y los MGC alimentados con 10 partes por billón de imidacloprid y suplemento de polen solo. El consumo de suplementos de polen, agua y sacarosa se registró cada 48 horas durante 10 o 12 días.

Las tasas diarias de consumo de sacarosa aumentaron significativamente a medida que avanzaba el experimento, pero las tasas de consumo de suplementos de polen disminuyeron. Se observaron tasas más altas de consumo de polen cuando se administraron 10 partes por billón de imidacloprid solo en suplemento de polen. Y la tasa disminuyó cuando se administraron 10 o 50 partes por mil millones en suplemento de polen y solución de sacarosa juntos.

El uso de abejas de un día es fundamental para garantizar la aceptación de la reina y reducir la reactivación de la obrera. También es fundamental el manejo cuidadoso de la reina y mantener las jaulas en un ambiente estable.