Inmunización intranasal y recolección de leche en estudios de inmunización materna en conejos blancos de Nueva Zelanda (Oryctolagus cuniculus)

Los estudios de inmunización materna y transferencia de anticuerpos son invaluables por numerosas razones, ya que esta es la ruta inicial de transferencia de inmunidad y la posterior protección contra patógenos y enfermedades en recién nacidos y bebés. Debido a las similitudes en la placentación y la transferencia de anticuerpos con los humanos, los conejos son un excelente modelo de inmunización materna. En este artículo en video demostramos las técnicas que nuestro laboratorio ha utilizado en estudios de inmunización materna en conejos blancos de Nueva Zelanda, incluida la inmunización intranasal y la recolección de leche.

Primero describiremos una línea de tiempo de ejemplo y una serie de eventos para un estudio de inmunización materna de la mucosa en conejos blancos de Nueva Zelanda. Las hembras de conejos se inmunizan por vía intranasal, como se demuestra en este vídeo. Dependiendo del estudio, la vacuna puede requerir un impulso o puede necesitar ser dada a través de una ruta adicional, como la inmunización intramuscular.

Aunque no se representa, la sangre debe recolectarse antes de la inmunización inicial para las mediciones iniciales, y durante el resto del estudio a intervalos regulares. La sangre es obtenida fácilmente por la arteria del oído central con la sedación suave y un agente analgésico tópico. La presencia de niveles antígeno-específicos de IgG se puede medir en estas muestras.

Los conejos se crían entonces. Preferimos comprar criadores probados de vendedores para usar para asegurar una tasa de embarazo más alta para estos estudios. Dependiendo del calendario de inmunización, los conejos pueden recibir inmunizaciones adicionales durante todo el embarazo.

La IgG específica del antígeno se transfiere transplacentemente a los kits. Aproximadamente a los 30 a 32 días después de la cría, las gestantes se encenderán. Recomendamos limitar el manejo de los kits durante los primeros días para minimizar el rechazo de los hace.

Las muestras de sangre se pueden recoger de los kits para evaluar los niveles específicos de IgG del antígeno que fueron transferidos transplacentally. La sangre se puede recolectar de un pequeño número de kits en o cerca del momento del nacimiento para evaluar los niveles tempranos de anticuerpos específicos del antígeno. Además de una amplia variedad de nutrientes, los kits reciben IgA específica de antígenos de la dora lactante mientras amamanta.

Los kits se destete típicamente a las cuatro a ocho semanas de edad. Antes del destete, la leche se puede recolectar fácilmente de los productos de lactancia, como se demuestra en este video. Las muestras de leche recogidas se procesan para la detección de IgA específico del antígeno.

Dependiendo del estudio, se pueden administrar vacunas y un impulso a los kits y se pueden recolectar muestras de sangre en serie de los kits a una edad muy temprana utilizando la vena safena lateral. Ahora demostraremos la inmunización intranasal y la recolección de leche en New Zealand White Rabbits.Protocol. Todos los procedimientos fueron aprobados y realizados de acuerdo con las políticas del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Duke.

Inmunización intranasal. Materiales necesarios: Acepromazina, jeringa y aguja, lubricante oftálmico, isoflurano, cono de nariz, pipeta y puntas de pipeta, vacuna de la mucosa. Prepare la solución de inmunización antes de la manipulación de animales.

Los conejos son sedados con Acepromazina un miligramo por kilogramo por vía intramuscular, y anestesiados con Isoflurano usando un cono de la nariz. Una vez completamente anestesiado según lo evaluado por el reflejo del párpado, se agrega un lubricante oftálmico a cada ojo para prevenir el secado de los ojos y la posterior ulceración corneal. Una vez que el miembro del laboratorio esté listo para administrar la vacuna y el conejo esté en un plano adecuado de anestesia, apague el isoflurano y el oxígeno y retire el cono de la nariz.

Colocar el conejo en reclinación dorsal y apuntalar el cuello y la cabeza en un ángulo aproximado de 45 grados que permita un fácil acceso y visualización de ambos alars por parte del miembro del laboratorio que administra la vacuna. Cargue la pipeta con no más de 100 microlitros de la solución de la vacuna y administre rápidamente la solución a una fosa nasal y repita el procedimiento para la segunda fosa nasal. La pipeta debe mantenerse en un ángulo aproximado de 45 grados.

Ángulo hacia el aspecto medial del conducto nasal. El objetivo de la inmunización es que la solución entre en contacto con las membranas mucosas de las narinas. Por lo tanto, la punta no debe colocarse dentro de las narinas, ya que esto puede resultar en abrasión o irritación de los tejidos de la mucosa y potencialmente influir en la inmunogenicidad de la vacuna administrada por vía nasal.

La vacuna debe administrarse rápidamente y hacerse de la misma manera en la otra fosa nasal. Después de la administración en ambas fosas nasales, el conejo se mantiene en reclinación dorsal durante 30 segundos para minimizar la fuga de la solución vacunal. Por lo general, el laboratorio no administrará más de 100 microlitros por fosa nasal a la vez.

Si se va a administrar un volumen mayor con un volumen total máximo de 500 microlitros, la vacuna se puede administrar en 100 alícuotas de microlitro con un período de descanso de 30 segundos entre inmunizaciones. Y administraciones adicionales de la vacuna repetidas con 30 segundos de descanso entre cada administración hasta que se entregue el volumen total de la vacuna. Después de la inmunización, coloque el conejo en el ventrum para su recuperación y vigile de cerca al animal hasta que pueda mantener la reclinación esternal.

En algunos casos, la formulación de la vacuna puede no administrarse completamente a la cavidad nasal y una parte de la formulación de la vacuna puede permanecer en la parte exterior de las narinas. En este caso, debido a que no está claro el volumen exacto de la vacuna que se entregó correctamente a la cavidad nasal, no se recomienda volver a aplicar material adicional de la vacuna, ya que esto agregaría una variable indefinida al experimento. Es importante utilizar una técnica de administración de vacunas que proporcione una entrega completa y consistente de la formulación de la vacuna a las narinas.

Recolección de leche. Materiales necesarios: Acepromazina, jeringas y agujas, hisopo de alcohol, gasa, lubricante oftálmico, isoflurano, cono de nariz, oxitocina y un vial de recolección. Los conejos son sedados con Acepromazina un miligramo por kilogramo por vía intramuscular, y anestesiados con Isoflurano usando un cono de la nariz.

Una vez completamente anestesiado según lo evaluado por el reflejo palpebral, se aplica un lubricante oftálmico a cada ojo para evitar el secado de los ojos y la posterior ulceración corneal. Limpie la piel sobre la vena marginal del oído con el hisopo de alcohol. Usando una jeringa de un mil y una aguja de calibre 25, administre aproximadamente de una a dos unidades internacionales de oxitocina por vía intravenosa por la vena marginal del oído para inducir la leche a la baja.

Debido a la relajación del músculo liso, es común que el conejo orine o defeque después de la administración de oxitocina. Después de la administración de oxitocina, aplique presión al sitio de inyección con un pedazo de gasa para proporcionar hemostasia. Mientras mantiene la máscara de anestesia o el cono de la nariz sobre la nariz del conejo, sostendría el conejo en sus cuartos traseros.

Como nota al margen, la recolección de leche también se puede realizar con el animal en reclinación lateral, pero el laboratorio encuentra que la recolección es más fácil cuando el conejo está apoyado en su grupa con un asistente sosteniendo el conejo en posición vertical con la máscara de anestesia. Abra el tubo estéril para prepararse para la recolección de leche y localice el tejido mamario y las tetinas asociadas. Los conejos típicamente tienen de cuatro a cinco pares de glándulas mamarias.

Las tetinas están típicamente rodeadas por piel húmeda de la lactancia reciente y el tejido mamario es fácilmente palpable cuando está lleno de leche. Agarre el tejido mamario asociado con el pezón entre el pulgar y el índice y aplique una presión de masaje suave al tejido glandular en la dirección del pezón. Coloque el tubo de recolección sobre el pezón para recoger la leche extraída.

A veces puede tomar varios minutos para que la oxitocina sea efectiva, y la producción de leche parece variar entre las glándulas mamarias. Si la expresión de la leche no es exitosa, espere varios minutos o gire alrededor de una glándula mamaria adicional. La leche de todas las tetinas se puede recoger en el mismo vil.

Por lo general, varios mililitros de leche se pueden recolectar fácilmente de una dora lactante. Después de que se haya recogido el volumen deseado de leche, apague el isoflurano y el oxígeno y retire el cono de la nariz del conejo, y permita que el conejo se recupere mientras es monitoreado de cerca hasta que el animal pueda mantener la reclinación esternal. Resultados representativos.

Figura uno. Para los estudios maternos, determinar el embarazo lo antes posible es útil para confirmar que la mente no necesita ser re-criada. Las opciones para la detección del embarazo incluyen la palpación, el ultrasonido, las radiografías, el aumento de peso, y las técnicas moleculares tales como medidas de los factores de crecimiento de la insulina y de la progesterona.

Los niveles adecuados de progesterona son necesarios para el mantenimiento del embarazo en conejos. Por lo tanto, varios estudios también han evaluado los niveles de progesterona en conejos preñadas y han demostrado niveles elevados en relación con las conejos no preñadas, particularmente durante la organogénesis alrededor de la mitad de la gestación. Como se muestra en la figura uno, se pueden detectar niveles elevados de progesterona en conejos preñadas en comparación con conejos no preñadas, incluso después de que se confirmaron los apareamientos por un dólar para todos.

Los niveles de la progesterona del suero fueron medidos usando un análisis quimioluminiscente automatizado. Figura dos. El Antígeno Específico IgG que fue transferido transplacentally durante la gestación se puede medir en el suero de los kits por Elisa.

La sangre se puede recolectar de un pequeño número de kits en o cerca del momento del nacimiento para evaluar los niveles tempranos de anticuerpos específicos del antígeno. La recolección de sangre en serie es técnicamente mucho más fácil a medida que los kits envejecen y aumentan de tamaño. Como se muestra en la Figura Dos, los niveles séricos de IgG específica de antígeno en los kits se pueden medir y comparar con los niveles maternos.

Los niveles de IgG transferidos por la madre son más altos al nacer y disminuyen con el tiempo. Figura tres. La leche de conejo se puede recolectar como se muestra en este video y procesarse para medir los niveles de anticuerpos totales y específicos de antígenos por Elisa.

Como se muestra en esta figura, igA constituye una parte significativa de los anticuerpos totales dentro de la leche materna que están disponibles para la transferencia pasiva a los kits. Los niveles de IgA e IgG son considerablemente más altos que IgM.Summary. Este artículo video describe y demuestra la administración de vacunas intranasales y la colección de leche de conejos lactantes como medios para evaluar inmunidad de la mucosa en un modelo traslacionalmente apropiado de inmunización materna.

Se muestra una imagen resumida de un diseño típico del estudio de inmunización intranasal materna que incorpora las inmunizaciones, la reproducción, el encizado, la lactancia y la transferencia de anticuerpos.