Name: Un enfoque de microfluídica para la investigación funcional de las oscilaciones de señalización que gobiernan la somitogénesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprende a utilizar microfluídica para modular y sincronizar oscilaciones de señalización en embriones de ratón. Este método permite analizar dinámicas de señalización en tiempo real durante la somitogénesis.

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Agradecemos a Yang Li y Jos Malda de la UMC Utrecht por su ayuda con la impresión 3D de moldes, a Karen van den Anker del grupo Sonnen por sus comentarios muy útiles sobre el protocolo y a Tjeerd Faase del taller mecánico del Instituto Hubrecht para el soporte de chips microfluídicos dentro del microscopio. Nos gustaría agradecer a todo el grupo sonnen por la lectura crítica del manuscrito y a los revisores por sus comentarios constructivos. Este trabajo recibió financiación del Consejo Europeo de Investigación en virtud de un acuerdo de subvención inicial del CEI n.º 850554 a K.F.S.

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<li>Aulehla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%CE%B2-catenin+gradient+links+the+clock+and+wavefront+systems+in+mouse+embryo+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+and+propagation+of+Hes7+oscillation+are+cooperatively+regulated+by+Fgf+and+Notch+signaling+in+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock.</a> Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+types+of+oscillations+in+notch+and+Fgf+signaling+regulate+the+spatiotemporal+periodicity+of+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis.</a> Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).</li>
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<li>Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+acts+upstream+of+the+NOTCH+and+WNT+signaling+pathways+to+control+segmentation+clock+oscillations+in+mouse+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis.</a> Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).</li>
<li>Sonnen, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+phase+shift+between+Wnt+and+Notch+signaling+oscillations+controls+mesoderm+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation.</a> Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).</li>
<li>Sonnen, K. F., Merten, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+an+emerging+precision+tool+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology.</a> Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).</li>
<li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).</li>
<li>Cimetta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+generating+stable+concentration+gradients+for+long+term+cell+culture%3A+Application+to+Wnt3a+regulation+of+%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling.</a> Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).</li>
<li>Demers, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development-on-chip%3A+In+vitro+neural+tube+patterning+with+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device.</a> Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).</li>
<li>Frank, T., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-switching+allows+independently+programmable%2C+extremely+stable%2C+high-throughput+diffusion-based+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).</li>
<li>Tay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+NF-B+dynamics+reveal+digital+activation+and+analogue+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing.</a> Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).</li>
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<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160 (3), 381-392 (2015).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+positioning+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subcellular positioning of small molecules.</a> Nature. 411 (6841), 1016(2001).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+treatment+of+cellular+microdomains+using+multiple+laminar+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams.</a> Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).</li>
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<li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li>
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<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
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<li>Manfrin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+signaling+centers+for+the+spatially+controlled+patterning+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cómo la dinámica de señalización controla los sistemas multicelulares ha sido una pregunta de larga data en el campo. La investigación funcional plantea un desafío clave, porque estas dinámicas tienen que ser sutilmente moduladas para permitir esto11. Este control temporal sobre las perturbaciones de la vía puede lograrse, en principio, con la optogenética, que también permite un alto control espacial34. Sin embargo, la optogenética requiere el establecimiento de herramientas genéticas sofisticadas para el análisis de cada vía de señalización en cuestión. El protocolo actual descrito aquí proporciona una herramienta altamente versátil para la perturbación de cualquier vía de señalización. El experimento de microfluídica permite la aplicación de pulsos de fármacos controlados temporalmente para investigar funcionalmente la dinámica de las vías de señalización en cultivos de tejidos. Aquí, la atención se centra en el estudio de la somitogénesis en cultivos ex vivo , pero el protocolo se puede adaptar para adaptarse a cualquier otro sistema modelo.
Ciertos pasos en el protocolo son críticos para realizar un experimento de microfluídica exitoso (resumido en la Tabla 1). Los puntos clave se discuten de la siguiente manera. Debido al flujo medio durante el curso del experimento, el cultivo de tejidos experimenta estrés cortante. La exposición del sistema modelo al flujo continuo puede causar estrés celular y, en casos extremos, la muerte celular debido al efecto de cizallamiento. Para los cultivos de tejidos ex vivo de tailbuds de ratón y el diseño actual del chip, se encontró que un caudal de 60 μL / h (máximo de 100 μL / h) funciona bien con un efecto de cizallamiento mínimo. Cuando se encienden varias bombas simultáneamente para el mismo chip, el caudal de las bombas individuales debe ajustarse en consecuencia para no causar un aumento en el caudal total. Cuando el protocolo actual se adapta a otros sistemas de modelos y diseños de chips, se debe optimizar el caudal. Alternativamente, es posible no enjuagar el medio continuamente, sino cambiar periódicamente el medio en el chip35. Dicha configuración también se puede aplicar para controlar las oscilaciones de señalización en la somitogénesis del ratón (datos no publicados, no mostrados). Además, también se puede imaginar una configuración, en la que los cultivos de tejidos no están expuestos al flujo directo de fluidos, sino que los medicamentos llegan al tejido por difusión desde un canal vecino. Dichos sistemas se han utilizado con éxito para aplicar gradientes de factores de crecimiento a modelos in vitro de diferenciación ESC14,36.
Un problema importante de los experimentos microfluídicos es la aparición de burbujas de aire en el chip durante el experimento. Las burbujas de aire dentro del chip o tubo pueden interferir con el flujo uniforme de líquido en el chip y pueden conducir a la eliminación del cultivo de embriones de su ubicación. Para evitar la presencia de burbujas de aire, varios pasos del protocolo son indispensables. En primer lugar, el medio de cultivo dentro de las jeringas y el propio chip microfluídico debe desgasificarse utilizando un desecador (paso 3.1.3). En segundo lugar, al cargar muestras en las entradas de carga, se debe tener cuidado de no canalizar aire en el chip junto con la muestra (paso 3.2.3). En tercer lugar, al llenar el tubo con medio, todas las burbujas de aire deben bombearse antes de conectar el chip (paso 3.3.2). De lo contrario, estas burbujas serán empujadas hacia el chip principal durante el experimento. Por último, durante el experimento, el medio se equilibra dentro de la cámara de imágenes o incubadora debido al tubo semipermeable. La permeabilidad del tubo también permite la evaporación del medio, así que asegúrese de que la humedad esté regulada durante el experimento para evitar la formación de nuevas burbujas en el tubo.
En general, la microfluídica es una herramienta muy versátil que se puede adaptar a la pregunta específica del investigador. El enfoque de diseño actual permite obtener imágenes de hasta 12 cultivos ex vivo en paralelo por chip. Este número está limitado principalmente por el número de embriones por experimento y el tiempo que se tarda en obtener imágenes de cada cultivo de embriones con suficiente resolución. Si es necesario comparar varias condiciones en un solo experimento, se pueden montar varios chips en un solo portaobjetos de vidrio. Se proporciona un diseño de chip, que es ideal para la obtención de imágenes de múltiples explantes de tejido en paralelo, pero los diseños personalizados pueden superar las limitaciones en el número de muestras para permitir un análisis de alto rendimiento y aumentar la combinación de más condiciones dentro de un solo experimento16,17. La microfluídica se limita a modelos que se pueden cultivar en un chip y la cultura en chip tendrá que optimizarse para cada sistema modelo individualmente27,37,38.
En los últimos 5-10 años, la microfluídica se ha aplicado para abordar diversas cuestiones biológicas debido a su potencial para enfoques de alto rendimiento y modulaciones sutiles de la dinámica y los gradientes de señalización. Hoy en día, la microfluídica se ha convertido en una herramienta fácilmente aplicable, barata y versátil que los laboratorios pueden establecer con facilidad. Aquí, el protocolo actual está optimizado para una aplicación específica, a saber, estudiar la dinámica de señalización que gobierna la somitogénesis. Es sencillo adaptar este protocolo y diseño para adaptarse a las preguntas de investigación individuales en biología de tejidos.

El desarrollo está controlado por la comunicación intercelular a través de vías de señalización. Solo hay un número limitado de vías de señalización que orquestan la formación compleja de tejidos y la diferenciación celular adecuada en el espacio y el tiempo. Para regular esta multitud de procesos, la información puede codificarse en la dinámica de una vía de señalización, el cambio de una vía a lo largo del tiempo, como la frecuencia o la duración de una señal1,2.
Durante la somitogénesis, el tejido somítico se segmenta periódicamente del mesodermo presomito (PSM)3. El PSM está organizado espacialmente por gradientes de Wnt, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) y señalización de ácido retinoico. En el PSM anterior en el frente de determinación, donde las señales Wnt y FGF son bajas, las células están preparadas para la diferenciación en somitas. La diferenciación ocurre cuando una onda de activación transcripcional alcanza este frente de determinación. Dentro del PSM, la señalización Wnt, FGF y Notch oscila. Las células vecinas oscilan ligeramente fuera de fase, lo que resulta en ondas de activación transcripcional oscilatoria aguas abajo de las vías Wnt, FGF y Notch que viajan desde el PSM posterior al anterior. En embriones de ratón, una onda transcripcional alcanza el frente de determinación aproximadamente cada 2 h e inicia la formación de somita. El estudio de la somitogénesis perturbando o activando las vías de señalización puede ilustrar la importancia de estas vías4,5,6,7,8,9. Sin embargo, para poder investigar la función de la dinámica de señalización en el control del comportamiento celular, es esencial modular sutilmente las vías de señalización en lugar de activarlas o inhibirlas permanentemente.
Para modular temporalmente la actividad de la vía de señalización dentro del embrión de ratón segmentador, Sonnen et al. han desarrollado un sistema microfluídico10. Este sistema permite un control estricto de los flujos de fluidos dentro de los microcanales de un chip que contiene la muestra biológica11. Para estudiar la importancia de la dinámica de señalización para la segmentación adecuada de PSM, esta configuración de microfluídica se utiliza para modular la dinámica de señalización del reloj de segmentación del ratón ex vivo. Mediante la pulsación secuencial de activadores o inhibidores de la vía en la cámara de cultivo, se logra el control externo de la dinámica de la señalización de Wnt, FGF y Notch10. Por ejemplo, es posible modificar el período de las vías individuales y la relación de fase entre múltiples vías de señalización oscilatoria. Utilizando imágenes concomitantes en tiempo real de reporteros de señalización dinámica, se puede analizar el efecto del arrastre en las propias vías, en la diferenciación y la formación de somita. Utilizando este nivel de control sobre la dinámica de señalización, se destacó la importancia de la relación de fase entre las vías de señalización Wnt y Notch durante la somitogénesis10.
Los diseños personalizados de chips permiten una gran cantidad de opciones para perturbaciones espaciotemporales dentro del entorno local, por ejemplo, formación de gradiente estable12,13,14,15, activación/inhibición pulsátil10,16,17,18 o perturbaciones localizadas19,20 . La microfluídica también puede permitir una lectura más reproducible y un mayor rendimiento debido a la automatización del manejo experimental21,22,23. El presente protocolo está destinado a llevar la microfluídica y el arrastre de oscilaciones de señalización endógenas dentro de los tejidos a todos los laboratorios estándar de ciencias de la vida. Incluso en ausencia de equipos sofisticados para la generación de chips, como salas limpias y equipos para litografía blanda, los chips microfluídicos se pueden fabricar y utilizar para abordar cuestiones biológicas. Los moldes se pueden diseñar utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD) disponible gratuitamente. Un molde para la generación de chips microfluídicos, que generalmente consiste en polidimetilsiloxano (PDMS), se puede imprimir con una impresora 3D o pedirse a empresas de impresión. De esta manera, los chips microfluídicos se pueden producir en un día sin la necesidad de costosos equipos24. Aquí, se proporciona un diseño de chip, con el que se puede imprimir un molde para el arrastre del reloj de segmentación del mouse en cultivos bidimensionales (2D) ex vivo25 con una impresora 3D.
Los cultivos en chip y las perturbaciones precisas, habilitadas por la microfluídica, tienen un potencial excepcional para desentrañar los mecanismos moleculares de cómo las vías de señalización controlan el comportamiento multicelular. La dinámica de señalización y los gradientes de morfógenos son necesarios para muchos procesos en desarrollo. Anteriormente, los laboratorios habían cultivado células, tejidos y organismos enteros en chips microfluídicos y los protocolos para la perturbación espaciotemporal del cultivo celular principalmente 2D se proporcionan en otros lugares12,26,27,28,29. La aplicación de microfluídica para modular entornos locales en sistemas multicelulares abre nuevas perspectivas para perturbaciones espaciotemporales precisas y de alto rendimiento. El campo de la microfluídica ha llegado a un punto en el que se ha convertido en una herramienta no especializada, económica y fácilmente aplicable para los biólogos del desarrollo.
Aquí, se proporciona un protocolo para el arrastre del reloj de segmentación del mouse a los pulsos de un inhibidor de señalización Notch. Dicho experimento consta de los siguientes pasos: (1) generación de chip microfluídico, (2) preparación de tubos y recubrimiento del chip, y (3) el experimento microfluídico en sí (Figura 1A). La investigación que involucra sistemas modelo de vertebrados requiere la aprobación ética previa del comité responsable.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 10 mL</td><td>Becton, Dickinson y compañía</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>184 Elastómero de silicio</td><td>SYLGARD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>184 Elastómero de silicio PDMS</td><td>SYLGARD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>jeringas de 3 ml</td><td>Becton, Dickinson y compañía</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Cinta</td><td></td><td></td> adhesiva <td>Cinta adhesiva Scotch Magic tape o similar</td></tr><tr><td>Pinzas de punta roma Bochem 18/10 Acero inoxidable</td><td>Fisher Scientific</td><td>10663341</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina Liofilizado pH~7</td><td>Biowest</td><td>P6154</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td><td></td><td></td><td></td>de aire comprimido</tr><tr><td>Plato de cristalización</td><td>VWR</td><td>10754-7</td><td>D</td></tr><tr><td>-(+)-glucosa esterilizada 45%</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Desecador</td><td>VWR</td><td>467-0104</td><td></td></tr><tr><td>Vasos desechables</td><td>Duni</td><td>173 941</td><td></td></tr><tr><td>Tenedores desechables</td><td>Grapas</td><td>511514</td><td></td></tr><tr><td>Equipos</td><td></td><td></td><td></td>de disección</tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Tecnologías de cultivo celular</td><td>personalizadas</td><td>DMEM/F-12, sin rojo fenol, sin L-glutamina, sin glucosa</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo BioVanguard Greenline</td><td>CleanAir de Baker</td><td>511514</td><td>Para fuente de luz UV</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio Nº 1.5H de alta precisión, 70x70 mm</td><td>Marienfeld</td><td>107999098</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td></td> Microscopio 25030024 <td></td></tr><tr><td></td><td>Leica Leica Leica</td><td>SP8 MP</td><td></td></tr><tr><td>Agujas 22G</td><td>Becton, dickinson y empresa</td><td>z412139-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Horno</td><td>VWR</td><td>390-09</td><td></td></tr><tr><td>PBS0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Horno de plasma Femto</td><td>Diener electrónico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punch & Oslash; 1mm</td><td>Uni-Core</td><td>WB100073</td><td></td></tr><tr><td>Escala</td><td>Sartorius</td><td>Entris</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>WPI</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Tubing & Oslash; 1mm</td><td>APT</td><td>AWG24T</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de vacío</td><td>VWR</td><td>181-0308</td><td></td></tr></tbody></table>

un enfoque de microfluídica para la investigación funcional de las oscilaciones de señalización que gobiernan la somitogénesis

A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis

La segmentación periódica del mesodermo presómico de un embrión de ratón en desarrollo está controlada por una red de vías de señalización. Se cree que las oscilaciones de señalización y los gradientes controlan el tiempo y el espaciado de la formación de segmentos, respectivamente. Si bien las vías de señalización involucradas se han estudiado ampliamente en las últimas décadas, ha faltado evidencia directa de la función de las oscilaciones de señalización en el control de la somitogénesis. Para permitir la investigación funcional de la dinámica de señalización, la microfluídica es una herramienta previamente establecida para la modulación sutil de estas dinámicas. Con este enfoque de arrastre basado en microfluídica, las oscilaciones de señalización endógenas se sincronizan mediante pulsos de moduladores de vía. Esto permite la modulación de, por ejemplo, el período de oscilación o la relación de fase entre dos vías oscilantes. Además, se pueden establecer gradientes espaciales de moduladores de vía a lo largo del tejido para estudiar cómo los cambios específicos en los gradientes de señalización afectan la somitogénesis.
El presente protocolo está destinado a ayudar a establecer enfoques microfluídicos para los usuarios primerizos de microfluídica. Se describen los principios básicos y el equipo necesario para configurar un sistema microfluídico, y se proporciona un diseño de chip, con el que se puede preparar convenientemente un molde para la generación de chips utilizando una impresora 3D. Finalmente, se discute cómo cultivar tejido primario de ratón en un chip microfluídico y cómo arrastrar las oscilaciones de señalización a pulsos externos de moduladores de vía.
Este sistema microfluídico también se puede adaptar para albergar otros sistemas modelo in vivo e in vitro , como gastruloides y organoides, para la investigación funcional de la dinámica de señalización y los gradientes de morfógenos en otros contextos.

Con este protocolo, se presenta un método para el arrastre externo de las oscilaciones de señalización del reloj de segmentación del ratón utilizando microfluídica. Mediante la aplicación de pulsos del inhibidor de señalización Notch, las oscilaciones de señalización en cultivos embrionarios independientes se sincronizan entre sí10. Un requisito previo para la aplicación de este sistema para estudiar la funcionalidad del reloj de segmentación es que la dinámica de señalización y la segmentación todavía están presentes en el chip. Se demostró anteriormente que tanto la dinámica de señalización Wnt como Notch se mantienen a pesar del flujo medio constante y la formación de límites físicos persiste en cultivos 2D periféricos, lo que representa PSM10 anterior.
Para confirmar el arrastre de las oscilaciones de señalización a pulsos de medicamentos externos, se realizan imágenes en tiempo real de, por ejemplo, el reportero de señalización Notch LuVeLu5, que expresa la proteína fluorescente amarilla Venus, durante el experimento microfluídico. Dado que la orientación de los cultivos 2D en chip es difícil de controlar, se analizan las oscilaciones de señalización en el tejido anterior. La periferia del cultivo 2D puede ser detectada de forma reproducible. La orientación de las secciones de tejido en el chip no se puede controlar a voluntad y toda la superficie interna del chip se recubre con fibronectina. Por lo tanto, ocasionalmente sucede que los cultivos se adhieren a los lados o al techo del chip. En caso de que las muestras se muevan fuera del campo de visión (en dirección x, y y z) o se adhieran con el extremo posterior de la cola mirando hacia abajo, generalmente se excluyen estas muestras.
Para un análisis más detallado, se combinan varios de estos experimentos de arrastre. Los experimentos independientes se pueden alinear entre sí utilizando el tiempo de los pulsos de fármaco visualizados por el tinte, Cascade Blue, a aproximadamente 400 nm. Para analizar y visualizar la sincronización, las oscilaciones cuantificadas se pueden destendenciar (Figura 2B, D) y luego se pueden mostrar como media y desviación estándar o se pueden calcular las fases de las oscilaciones. Esto permite el análisis de la relación de fase entre las oscilaciones de los cultivos de embriones posteriores independientes entre sí y con los pulsos externos de fármacos (Figura 2C,E). El programa basado en Python pyBOAT33 es una herramienta sencilla y fácil de usar para determinar el período, la fase y la amplitud de tales oscilaciones de señalización. Para confirmar el arrastre, se puede, por ejemplo, determinar el período de las oscilaciones de señalización endógenas. Al aplicar pulsos con un período de 130 min, las oscilaciones de señalización notch también muestran un período de 130 min (Figura 2F)10. Además, utilizando pulsos Cascade Blue, los experimentos independientes con diferentes reporteros de señalización se pueden alinear entre sí. De esta manera se puede determinar indirectamente la relación de fase entre las oscilaciones de múltiples reporteros de señalización10.
Así, el sistema microfluídico presentado permite el control de las oscilaciones de señalización en cultivos ex vivo del embrión de ratón en desarrollo. En combinación con imágenes de marcadores para la formación y diferenciación de segmentos, este sistema ahora se puede aplicar para diseccionar cómo interactúan las vías de señalización del reloj de segmentación y cómo controlan la formación de somitas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general esquemática del protocolo de microfluídica. (A) Los moldes de chip se pueden diseñar utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD). Se proporciona un diseño de chip para arrastrar las oscilaciones de señalización en modelos ex vivo de somitogénesis de ratón. Los moldes pueden, por ejemplo, ser generados por impresión 3D u ordenados. Los chips microfluídicos se producen mediante moldeo de PDMS. Un chip PDMS endurecido se corta y se une covalentemente a un portaobjetos de vidrio utilizando un horno de plasma. La superficie de vidrio dentro del chip está recubierta con fibronectina para permitir que el tejido diseccionado se adhiera. El tejido embrionario se carga en el chip a través de entradas de carga, que posteriormente se cierran. Las bombas con diferentes condiciones de medios se unen a las entradas del chip y se inicializa un programa de flujo. El tejido se puede obtener imágenes utilizando un microscopio confocal durante el experimento. (Kymographs adaptados de Sonnen et al., 201810. Reimpreso y modificado de Cell según Creative Commons Atribución CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Dibujo esquemático de un diseño de molde para el cultivo en chip de tejido embrionario posterior de ratón. La altura de los canales microfluídicos es de 500 μm, suficiente para el cultivo de colas de ratón embrionarias posteriores. El archivo para imprimir este molde se proporciona en el Archivo Suplementario 1, y una alternativa se da en el Archivo Suplementario 2. (C) Imagen de campo brillante de una cola de ratón seccionada E10.5 encerrada por pilares PDMS en el chip. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig02.jpg"> Figura 2: Resultados representativos de un experimento de microfluídica. (A) Representación esquemática del experimento de arrastre con medio y bomba de fármaco. Los pulsos del modulador de la vía de señalización se aplican a cultivos ex vivo de embriones de ratón y las oscilaciones de señalización se pueden visualizar mediante imágenes en tiempo real de reporteros de señalización dinámica (por ejemplo, el reportero de señalización Notch LuVeLu5 y el reportero de señalización Wnt Axin2T2A10). Las líneas discontinuas indican la región que se utiliza para los análisis a lo largo del tiempo. (B-F) Las oscilaciones del reportero LuVeLu son arrastradas por pulsos periódicos del inhibidor de señalización Notch DAPT. (B,D) Cuantificaciones de las oscilaciones de señalización Notch en PSM anterior tras el arrastre utilizando DAPT o un control DMSO. (C,E) La relación fase-fase traza entre la fase de las oscilaciones de señalización Notch y la sincronización de los pulsos EXTERNOS DAPT/DMSO. En caso de arrastre, se establece una relación fase-fase estable. (F) Cuantificación del período medio y SEM de las oscilaciones del informador comparando muestras arrastradas con pulsos DMSO y DAPT. (Figura adaptada de Sonnenet al., 201810. Reimpreso y modificado de Cell según Creative Commons Atribución CC BY-NC-ND 4.0.). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problema</td>
			<td>Solución(es) sugerida(s)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">El PDMS no se adhiere al vidrio.</td>
			<td>- Asegúrese de que tanto el PDMS como el vidrio estén limpios.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Asegúrese de que haya suficiente PDMS alrededor de la cámara para la unión.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Optimizar los ajustes del horno de plasma.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Hay burbujas de aire en mi chip.</td>
			<td>- Compruebe si la bomba estaba encendida.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Desgasificar el chip antes de cargar el tejido en el chip.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Desgasificar el medio antes del inicio del experimento.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Asegúrese de que la humedad en la cámara de incubación sea lo suficientemente alta.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">El tejido muere al comienzo del experimento.</td>
			<td>- Añadir HEPES al medio al cargar y montar el chip.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- No enjuague el tejido dentro y fuera con demasiada frecuencia durante la carga.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Compruebe que el caudal no es demasiado alto.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">El tejido muere durante la toma de imágenes.</td>
			<td>- Asegúrese de que no haya fototoxicidad de la imagen</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Asegúrese de que no haya contaminación.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- El caudal no debe ser demasiado alto.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">El enfoque cambia durante la toma de imágenes.</td>
			<td>- Utilice el enfoque automático durante la toma de imágenes para ajustar la deriva de la diapositiva de imagen.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Deje que el chip se equilibre a la temperatura dentro del microscopio durante al menos 30 minutos.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tomacorrientes/entradas se desprenden.</td>
			<td>- Empuje todos los tubos completamente hacia abajo hasta el fondo.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">El vaso del chip se rompe.</td>
			<td>- Ten más cuidado, el cristal es muy frágil.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- El vidrio delgado solo es necesario para la obtención de imágenes. Si no se realizan imágenes, se puede usar un portaobjetos de vidrio normal más grueso.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Si la rotura está fuera del chip, puede que no sea un problema. Si el sello de vidrio del chip se rompe, el líquido se filtrará y entrará aire.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Hay una contaminación en mi chip.</td>
			<td>- Añadir antibióticos al medio de cultivo.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Esterilizar todo el equipo y tubería.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- Trabajar rápido y limpio.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Solución de problemas
Expediente complementario 1: Archivo STL para imprimir un molde con una impresora 3D. Este molde se utiliza para generar un chip microfluídico para el cultivo en chip de tejido embrionario posterior (diseño que se muestra en la Figura 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-1.stl" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Expediente Complementario 2: Archivo STL para imprimir un molde con una impresora 3D para generar un chip microfluídico para el cultivo en chip de tejido embrionario posterior. A diferencia del Archivo Suplementario 1 y el diseño que se muestra en la Figura 1, este diseño contiene trampas de burbujas en todas las entradas para evitar que pequeñas cantidades de aire entren en la cámara microfluídica principal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-2.stl" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Expediente complementario 3: Archivo de diseño para la generación de un soporte para colocar el chip en el microscopio. Este soporte tiene las dimensiones de una placa de 96 pocillos y debe caber en los soportes estándar de la mayoría de los microscopios. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-3.dwg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Se proporciona un protocolo para el cultivo y manipulación de tejido embrionario de ratón en un chip microfluídico. Mediante la aplicación de pulsos de moduladores de vía, este sistema se puede utilizar para controlar externamente las oscilaciones de señalización para la investigación funcional de la somitogénesis del ratón.

Un enfoque de microfluídica para la investigación funcional de las oscilaciones de señalización que gobiernan la somitogénesis

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and ...

Las vías de señalización que controlan los sistemas multicelulares son dinámicas. Para comprender la función de estas dinámicas, es esencial poder modular sutilmente estas dinámicas sin afectar la actividad general de señalización. Este protocolo utiliza un sistema microfluídico que permite la disección funcional de las oscilaciones de señalización en embriones de ratón en desarrollo.La dinámica de señalización se ha encontrado en muchos tejidos, incluidos los adultos. La microfluídica es una herramienta versátil que se puede adaptar para adaptarse a muchos sistemas modelo, incluidos cultivos celulares, tisulares y organoides. Para comenzar, prepare la cantidad requerida de PDMS mezclando el monómero con el catalizador en una proporción de nueve a uno para inducir la polimerización.Use herramientas desechables y asegúrese de que la mezcla se logre correctamente. Coloque la mezcla PDMS en un desecador y aplique al vacío durante aproximadamente 30 minutos para eliminar el aire. Vierta una capa PDMS de aproximadamente tres a cinco milímetros en el molde del chip y vuelva a colocarla en el desecador durante aproximadamente 30 minutos.Cure el molde colocándolo en un horno durante la noche a 65 grados Celsius o menos, dependiendo del material del molde. Corta el chip del molde con un bisturí. Perforar los orificios de entrada y salida con un punzón de biopsia de un milímetro a partir del interior de la cámara microfluídica.Limpie el portaobjetos de vidrio con aire comprimido. Para unir el chip al portaobjetos de vidrio, coloque el chip y el portaobjetos de vidrio en el horno de plasma con los lados a unir hacia arriba. Genere plasma utilizando el protocolo específico de la máquina utilizada, luego una el chip al vidrio colocando las superficies activadas entre sí y aplicando presión de manera uniforme.Para preparar el tubo y el chip para el experimento, corte el tubo en un ángulo de 45 grados y conecte una aguja a cada uno de los tubos. Coloque el tubo con agujas, el chip y los tapones en un plato y esterilícelos exponiéndolos a la luz ultravioleta durante aproximadamente 15 minutos. Para cubrir el chip con fibronectina, coloque el chip en un vaso de precipitados que contenga PBS más 1% de penicilina o estreptomicina a temperatura ambiente.Enjuague el chip con PBS para eliminar el aire con una pipeta P200. Cargue una jeringa de tres mililitros para cada cámara del chip. Conecte la aguja a la jeringa que contiene fibronectina y conecte la jeringa a la bomba de la jeringa.Enjuague los tubos manualmente para eliminar el aire. Conecte el tubo de salida a la salida del chip. Asegúrese de empujar el tubo hasta el fondo y establezca un caudal bajo para cubrir el chip.Deje que la bomba de la jeringa funcione durante al menos dos horas o durante la noche. Cuando haya terminado, detenga la bomba y corte el tubo justo después de la aguja. Prepare jeringas llenas con el medio para el experimento y desgasifique tanto el medio de cultivo como el chip dentro de PBS.Trate de eliminar o aspirar la mayoría de las burbujas de aire del chip, luego instale jeringas en las bombas y conecte los tubos de entrada a las jeringas. Para cargar tejido en el chip, diseccione la punta más posterior de la cola. Enjuague el chip con medio de cultivo con 25 HEPES micromolares para eliminar el PBS.Cargue el tejido en el chip con una pipeta P200. Después de cada paso de carga de tejido, cierre la entrada de carga de tejido correspondiente con un trozo de tubo lleno de PDMS. Para ensamblar la configuración microfluídica, conecte el tubo al chip microfluídico sin tener burbujas de aire en el interior.Para hacerlo, asegúrese de que haya una gota de medio presente al final del tubo. Una vez que todos los tubos estén unidos al chip, sáquelo del vaso de precipitados y colóquelo en un plato que contenga un pañuelo húmedo. Coloque el plato y aproximadamente 1,5 metros de tubo de entrada en una incubadora para el cultivo nocturno.Asegurar una alta humedad para evitar la formación de burbujas de aire durante el cultivo. Alternativamente, seque el exterior del chip y colóquelo en un soporte de microscopio, luego coloque el soporte y aproximadamente 1,5 metros de tubo de entrada dentro de la cámara de incubación de un microscopio invertido para un experimento de imágenes en vivo. Después de al menos 20 minutos de flujo constante, comience el bombeo planificado para el experimento.Para captar la señalización de muesca en el embrión de ratón segmentador, utilice un programa de bombeo de pulsos de fármaco de 100 minutos a medio y 30 minutos repetidos hasta el final del experimento, generalmente durante 24 horas. Para obtener imágenes en tiempo real, comience a tomar imágenes después de al menos 30 minutos. Para confirmar el arrastre de las oscilaciones de señalización, se alinean múltiples experimentos utilizando el tiempo de los pulsos de la droga y se visualizan con el tinte Cascade Blue.Las oscilaciones cuantificadas se pueden destendizar y mostrar como media y se puede calcular la desviación estándar o las fases de las oscilaciones. Se puede analizar la relación de fase entre las oscilaciones de los cultivos embrionarios posteriores independientes entre sí y con los pulsos farmacológicos externos. Para confirmar el arrastre, se puede, por ejemplo, determinar el período de las oscilaciones de señalización endógenas utilizando el programa basado en Python pyBOAT.Al aplicar pulsos con un período de 130 minutos, las oscilaciones de señalización de muesca también muestran un período de 130 minutos. Es fundamental evitar la evaporación del líquido durante el experimento microfluídico. De lo contrario, se formarán burbujas de aire en el chip que interfieren con el flujo medio.Para evitar esto, desgasifique el medio y el chip y asegúrese de que la humedad en la incubadora sea lo suficientemente alta. Utilizando este método, la dinámica de señalización se puede modular y sus efectos se pueden analizar mediante imágenes en tiempo real de reporteros fluorescentes, inmunotinciones o hibridación in situ. Además, el tejido también se puede extraer del chip para su posterior análisis.Se puede utilizar este método para estudiar la función de las oscilaciones de señalización en el desarrollo embrionario. Se aplicó para demostrar la importancia del cambio de fase entre dos vías de señalización oscilantes para la segmentación del embrión de ratón. En términos más generales, ahora se puede utilizar para diseccionar el mecanismo de codificación de señalización dinámica en sistemas multicelulares.

a-microfluidics-approach-for-functional-investigation-signaling

Research

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Aprende a utilizar microfluídica para modular y sincronizar oscilaciones de señalización en embriones de ratón. Este método permite analizar dinámicas de señalización en tiempo real durante la somitogénesis.

Un enfoque de microfluídica para la investigación funcional de las oscilaciones de señalización que gobiernan la somitogénesis

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