Un enfoque de microfluídica para la investigación funcional de las oscilaciones de señalización que gobiernan la somitogénesis

Las vías de señalización que controlan los sistemas multicelulares son dinámicas. Para comprender la función de estas dinámicas, es esencial poder modular sutilmente estas dinámicas sin afectar la actividad general de señalización. Este protocolo utiliza un sistema microfluídico que permite la disección funcional de las oscilaciones de señalización en embriones de ratón en desarrollo.

La dinámica de señalización se ha encontrado en muchos tejidos, incluidos los adultos. La microfluídica es una herramienta versátil que se puede adaptar para adaptarse a muchos sistemas modelo, incluidos cultivos celulares, tisulares y organoides. Para comenzar, prepare la cantidad requerida de PDMS mezclando el monómero con el catalizador en una proporción de nueve a uno para inducir la polimerización.

Use herramientas desechables y asegúrese de que la mezcla se logre correctamente. Coloque la mezcla PDMS en un desecador y aplique al vacío durante aproximadamente 30 minutos para eliminar el aire. Vierta una capa PDMS de aproximadamente tres a cinco milímetros en el molde del chip y vuelva a colocarla en el desecador durante aproximadamente 30 minutos.

Cure el molde colocándolo en un horno durante la noche a 65 grados Celsius o menos, dependiendo del material del molde. Corta el chip del molde con un bisturí. Perforar los orificios de entrada y salida con un punzón de biopsia de un milímetro a partir del interior de la cámara microfluídica.

Limpie el portaobjetos de vidrio con aire comprimido. Para unir el chip al portaobjetos de vidrio, coloque el chip y el portaobjetos de vidrio en el horno de plasma con los lados a unir hacia arriba. Genere plasma utilizando el protocolo específico de la máquina utilizada, luego una el chip al vidrio colocando las superficies activadas entre sí y aplicando presión de manera uniforme.

Para preparar el tubo y el chip para el experimento, corte el tubo en un ángulo de 45 grados y conecte una aguja a cada uno de los tubos. Coloque el tubo con agujas, el chip y los tapones en un plato y esterilícelos exponiéndolos a la luz ultravioleta durante aproximadamente 15 minutos. Para cubrir el chip con fibronectina, coloque el chip en un vaso de precipitados que contenga PBS más 1% de penicilina o estreptomicina a temperatura ambiente.

Enjuague el chip con PBS para eliminar el aire con una pipeta P200. Cargue una jeringa de tres mililitros para cada cámara del chip. Conecte la aguja a la jeringa que contiene fibronectina y conecte la jeringa a la bomba de la jeringa.

Enjuague los tubos manualmente para eliminar el aire. Conecte el tubo de salida a la salida del chip. Asegúrese de empujar el tubo hasta el fondo y establezca un caudal bajo para cubrir el chip.

Deje que la bomba de la jeringa funcione durante al menos dos horas o durante la noche. Cuando haya terminado, detenga la bomba y corte el tubo justo después de la aguja. Prepare jeringas llenas con el medio para el experimento y desgasifique tanto el medio de cultivo como el chip dentro de PBS.

Trate de eliminar o aspirar la mayoría de las burbujas de aire del chip, luego instale jeringas en las bombas y conecte los tubos de entrada a las jeringas. Para cargar tejido en el chip, diseccione la punta más posterior de la cola. Enjuague el chip con medio de cultivo con 25 HEPES micromolares para eliminar el PBS.

Cargue el tejido en el chip con una pipeta P200. Después de cada paso de carga de tejido, cierre la entrada de carga de tejido correspondiente con un trozo de tubo lleno de PDMS. Para ensamblar la configuración microfluídica, conecte el tubo al chip microfluídico sin tener burbujas de aire en el interior.

Para hacerlo, asegúrese de que haya una gota de medio presente al final del tubo. Una vez que todos los tubos estén unidos al chip, sáquelo del vaso de precipitados y colóquelo en un plato que contenga un pañuelo húmedo. Coloque el plato y aproximadamente 1,5 metros de tubo de entrada en una incubadora para el cultivo nocturno.

Asegurar una alta humedad para evitar la formación de burbujas de aire durante el cultivo. Alternativamente, seque el exterior del chip y colóquelo en un soporte de microscopio, luego coloque el soporte y aproximadamente 1,5 metros de tubo de entrada dentro de la cámara de incubación de un microscopio invertido para un experimento de imágenes en vivo. Después de al menos 20 minutos de flujo constante, comience el bombeo planificado para el experimento.

Para captar la señalización de muesca en el embrión de ratón segmentador, utilice un programa de bombeo de pulsos de fármaco de 100 minutos a medio y 30 minutos repetidos hasta el final del experimento, generalmente durante 24 horas. Para obtener imágenes en tiempo real, comience a tomar imágenes después de al menos 30 minutos. Para confirmar el arrastre de las oscilaciones de señalización, se alinean múltiples experimentos utilizando el tiempo de los pulsos de la droga y se visualizan con el tinte Cascade Blue.

Las oscilaciones cuantificadas se pueden destendizar y mostrar como media y se puede calcular la desviación estándar o las fases de las oscilaciones. Se puede analizar la relación de fase entre las oscilaciones de los cultivos embrionarios posteriores independientes entre sí y con los pulsos farmacológicos externos. Para confirmar el arrastre, se puede, por ejemplo, determinar el período de las oscilaciones de señalización endógenas utilizando el programa basado en Python pyBOAT.

Al aplicar pulsos con un período de 130 minutos, las oscilaciones de señalización de muesca también muestran un período de 130 minutos. Es fundamental evitar la evaporación del líquido durante el experimento microfluídico. De lo contrario, se formarán burbujas de aire en el chip que interfieren con el flujo medio.

Para evitar esto, desgasifique el medio y el chip y asegúrese de que la humedad en la incubadora sea lo suficientemente alta. Utilizando este método, la dinámica de señalización se puede modular y sus efectos se pueden analizar mediante imágenes en tiempo real de reporteros fluorescentes, inmunotinciones o hibridación in situ. Además, el tejido también se puede extraer del chip para su posterior análisis.

Se puede utilizar este método para estudiar la función de las oscilaciones de señalización en el desarrollo embrionario. Se aplicó para demostrar la importancia del cambio de fase entre dos vías de señalización oscilantes para la segmentación del embrión de ratón. En términos más generales, ahora se puede utilizar para diseccionar el mecanismo de codificación de señalización dinámica en sistemas multicelulares.