Name: Detección de glicosaminoglicanos por electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Aprende a detectar y medir glicosaminoglicanos sulfatados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata. Esta técnica sensible resuelve diferencias de tamaño en muestras biológicas sin equipos especializados.

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Este trabajo fue financiado por F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL y EPS)

Todas las muestras biológicas analizadas en este protocolo se obtuvieron de ratones, bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Colorado.
1. Aislamiento de sulfato de heparán
<ol><li>Delipidación de muestras de tejido NOTA: La delipidación es un paso opcional para los tejidos ricos en grasa.<ol>
<li>Haga una mezcla 1:1 de metanol y diclorometano. Preparar aproximadamente 500 μL por muestra; las piezas más grandes de tejido pueden requerir hasta 1 ml.</li>
		<li>Coloque cada muestra de tejido en un recipiente de vidrio pequeño con una tapa para la delipidación. NOTA: La masa de la muestra puede variar según el tejido de interés y las necesidades experimentales. 50 mg o menos suele ser suficiente para un rendimiento GAG adecuado, pero el usuario final puede requerir cierta optimización.</li>
		<li>Añadir 500 μL de la solución de metanol:diclorometano a cada recipiente de vidrio y mezclar. Asegúrese de que todas las muestras de tejido sólido estén completamente sumergidas en disolvente. NOTA: Use pipetas serológicas o tubos cónicos de plástico para mezclar y manipular la solución de metanol/diclorometano; otros plásticos pueden disolverse.</li>
		<li>Coloque las muestras en un agitador (en un estante seguro) en una campana de humos químicos y agite suavemente durante 1 h.</li>
		<li>Agitar las muestras para mezclar y centrifugar a 17.000 x g durante 5 min a 4 °C.</li>
		<li>Pipetee cuidadosamente la fracción de disolvente orgánico (sobrenadante). Esta es la fracción lipídica: no contiene GAG y se puede descartar. NOTA: Trate de no perturbar el tejido, ya que se podrían perder piezas pequeñas. Es preferible dejar parte de la capa orgánica en el recipiente de la muestra, en lugar de arriesgarse a la pérdida de la muestra.</li>
		<li>Deje la tapa del recipiente de vidrio abierta y deje que se evapore durante la noche en la campana. Cambie el tubo para el siguiente paso, ya que esos tubos no sobrevivirán al procesamiento posterior.</li>
		<li>Una vez que la mezcla de disolvente se haya evaporado por completo, proceda a la desintegración mecánica (si la muestra residual es >50 mg) o a la digestión de actinasa E (< 50 mg).</li>
	</ol></li>
	<li>Desintegración mecánica de tejido sólido (opcional; para muestras de tejido más grandes) NOTA: La mayoría de las piezas más pequeñas de tejido sólido (aproximadamente 50 mg o menos) deben disolverse completamente durante la etapa de digestión. Sin embargo, las muestras más grandes requerirán desintegración mecánica.<ol>
<li>Congelación rápida de muestras de interés colocándolas en un tubo de polipropileno de tamaño adecuado y colocando el tubo cerrado en nitrógeno líquido. Deje que la muestra se congele hasta que esté completamente sólida.</li>
		<li>Usando un mortero y un mortero limpios, muele las muestras congeladas en una consistencia similar al polvo.</li>
		<li>Proceda directamente a la digestión de la Actinasa E (Paso 1.4).</li>
	</ol></li>
	<li>Desalúdrico y concentración de muestras NOTA: Este es un paso opcional y solo se requiere para muestras de tejido líquido diluido (por ejemplo, líquido de lavado broncoal-alveolar (BALF) o plasma).<ol>
<li>Agrupar muestras líquidas en grupos experimentales apropiados (por ejemplo, por replicación biológica o grupo experimental)</li>
		<li>Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un corte de peso molecular (MWCO) de 3.000 Da.</li>
		<li>Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.</li>
		<li>Lave cada columna 3x con 400 μL de agua desionizada y filtrada. Descarta el flujo a través.</li>
		<li>Invierta el filtro y gire durante 1 minuto a 2.000 x g en tubos de recolección frescos y debidamente etiquetados. Congele a -80 °C o continúe con el siguiente paso.</li>
	</ol></li>
	<li>Digestión de actinasa E NOTA: Este paso es necesario para digerir y, en última instancia, eliminar los contaminantes de proteínas de su muestra.<ol>
<li>Mezclar muestras 1:1 con actinasa E recombinante a una concentración deseada de 10 mg/ml. Agregue el volumen apropiado de concentrado tampón de digestión 10x. Concentración final deseada: 0,005 M de acetato de calcio y 0,01 M de acetato de sodio, pH 7,5. Por ejemplo: 190 μL de muestra líquida, 190 μL de 20 mg/ml de actinasa E, 20 μL de acetato de calcio de 0,05 M, acetato de sodio de 0,1 M.</li>
		<li>Agitar las muestras suavemente para mezclar, luego digerir durante 48-72 h a 55 °C (hasta 7 días para el tejido entero).</li>
		<li>Calentar a 80 °C durante 15-20 min para calentar inactivar la Actinasa E.</li>
		<li>Congele la muestra a -80 °C o continúe con el paso 1.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Desalúdrico y concentración de muestras NOTA: Si se anticipa una masa baja del GAG de interés en la muestra biológica, o si es deseable la conservación de reactivos consumibles (es decir, columnas de filtro centrífugo), las muestras se pueden agrupar para producir un solo concentrado por grupo experimental (por ejemplo, por réplica biológica o grupo experimental).<ol>
<li>Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un MWCO de 3.000 Da.</li>
		<li>Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario, si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.</li>
		<li>Lave cada columna 3x con agua desionizada y filtrada de 400 μL. Descarta el flujo a través.</li>
		<li>Invierta el filtro y gire durante 1 min a 2.000 x g en tubos de recolección frescos y debidamente etiquetados (generalmente incluidos con las columnas del filtro centrífugo). Congele a -80 °C o continúe con el siguiente paso.</li>
	</ol></li>
	<li>Desecación<ol>
<li>Coloque las muestras disueltas del paso 1.5.5 en un concentrador de vacío rotacional durante la noche o liofilice las muestras como se detalla a continuación.</li>
		<li>Congele las muestras a fondo durante la noche a -80 °C o sumergiéndo las muestras en nitrógeno líquido.</li>
		<li>Perfore las tapas de muestra con una aguja de 18 G y colóquelas en la cámara del liofilizador. Agregue toallas de papel para empacar según sea necesario.</li>
		<li>Fijar la cámara del liofilizador al liofilizador y secar durante la noche (al menos -40 °C, 0,135 Torr)</li>
	</ol></li>
	<li>Columna de intercambio catiónico<ol>
<li>Resusped muestras desecadas en hasta 400 μL de 8 M de urea, solución CHAPS al 2% (o, si se agrupan muestras, resuspend a un máximo de (400/n) μL, donde n = el número de muestras en la piscina deseada. Use la menor parte posible de la solución detergente.</li>
		<li>Equilibrar la columna de intercambio catiónico (IEX) con 400 μL de 8 M de urea, solución CHAPS al 2%. Girar durante 5 min a 2.000 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Cargue 400 μL de muestras/muestras agrupadas en la columna IEX. Girar durante 5 min a 2.000 x g.</li>
		<li>Lavar 3x con 400 μL de 8 M de urea, solución CHAPS al 2%. Girar durante 5 min a 2.000 x g cada vez.</li>
		<li>Elute 3x con 400 μL de 0,2 M NaCl. Girar durante 5 min a 2.000 x g cada uno. Esta es la fracción de baja afinidad, que se puede conservar para fines de control de calidad si se desea.</li>
		<li>Elute 3x con 400 μL de 2,7 M (16%) NaCl. Girar durante 5 min a 2.000 x g cada uno. Esta fracción contendrá los glicosaminoglicanos aislados de interés, ¡guárdalo todo!</li>
		<li>Para desamar cada fracción eluida, agregue metanol hasta 80 vol% e incube a 4 ° C durante la noche. Girar cada muestra durante 5 min a 2.000 x g. Recupere el residuo sólido ya que este es glicosaminoglicano dessalado seco. NOTA: Alternativamente, omita este paso y continúe con el paso 1.8 para desatano el eluida sin metanol.</li>
	</ol></li>
	<li>Desalúdrico y concentración de muestras<ol>
<li>Si es necesario, agrupar las fracciones eluidas (a partir de 1.7.6) en grupos experimentales apropiados (por ejemplo, por réplica biológica o grupo experimental).</li>
		<li>Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un MWCO de 3.000 Da.</li>
		<li>Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario, si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.</li>
		<li>Lave cada columna 3x con agua desionizada y filtrada de 400 μL. Descarte el flujo a través. Continúe directamente con el paso 1.9.</li>
	</ol></li>
	<li>Digestión de la condroitina NOTA: El propósito de este paso es eliminar los GAG que no son de interés para el usuario final. En este caso, la condroitinasa se usa para eliminar la condroitina. En los tejidos utilizados para generar Resultados Representativos (líquido de lavado bronco-alveolar y pulmón entero), la digestión del sulfato de condroitina deja sulfato de heparán como el GAG residual primario. Los usuarios finales pueden necesitar agregar pasos de digestión adicionales dependiendo de sus objetivos experimentales.<ol>
<li>Cargue 350 μL de tampón de digestión (50 mM de acetato de amonio con 2 mM de cloruro de calcio ajustado a pH 7.0) a la columna del filtro centrífugo sin tocar la membrana.</li>
		<li>Añadir 5 μL de condroitinasa ABC recombinante.</li>
		<li>Coloque el tubo de muestras en un horno de 37 °C e incube durante 1 h.</li>
		<li>Gire la columna y colóquelos en tubos de recolección debidamente etiquetados. Girar durante 1 min a 2000 x g.</li>
		<li>Caliente las muestras a 80 °C durante 15-20 min para inactivar la condroitinasa ABC.</li>
	</ol></li>
	<li>Desalúdrico y concentración de muestras<ol>
<li>Si es necesario, agrupar las muestras de condroitina digeridas del paso 1.9.5 en grupos experimentales apropiados (por ejemplo, por réplica biológica o grupo experimental)</li>
		<li>Coloque el volumen total de la muestra en una columna de filtro centrífugo de 500 μL con un MWCO de 3.000 Da.</li>
		<li>Girar durante 30 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. Repita según sea necesario si el volumen de muestra deseado excede la capacidad de la columna del filtro centrífugo.</li>
		<li>Lave cada columna 3x con agua desionizada y filtrada de 400 μL. Descarta el flujo a través.</li>
		<li>Invierta el filtro y gire durante 1 min a 2.000 x g en tubos de recolección frescos y debidamente etiquetados. Congele a -80 °C o continúe con el siguiente paso.</li>
	</ol></li>
	<li>Desecación NOTA: En este paso, la desecación es necesaria para que las muestras puedan ser resuspendidas en la menor cantidad posible de agua y tampón corriente.<ol>
<li>Coloque las muestras digeridas con condroitina del paso 1.10.5 directamente en un concentrador de vacío rotacional durante la noche o liofilice de la siguiente manera:</li>
		<li>Congele las muestras a fondo durante la noche a -80 °C o sumergiéndo las muestras en nitrógeno líquido.</li>
		<li>Perfore las tapas de muestra con una aguja de 18 G y colóquelas en la cámara del liofilizador. Agregue toallas de papel para empacar según sea necesario.</li>
		<li>Fijar la cámara del liofilizador al liofilizador y secar durante la noche (al menos 40 °C, 0,135 Torr)</li>
	</ol></li>
</ol>2. Electroforesis en gel de poliacrilamida de glicosaminoglicanos aislados y purificados
<ol><li>Preparar con antelación las soluciones necesarias para la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) (Tabla 1). NOTA: Seleccione el porcentaje de acrilamida de la solución de gel de resolución dependiendo del tamaño de los glicosaminoglicanos que se espera que estén en la muestra. Se recomienda un 15% para resolver fragmentos más grandes (más de 30 subunidades disacáridos de longitud); 22% para fragmentos más pequeños (<20 subunidades disacáridos de longitud).</li>
	<li>Coloque el cassette vacío en el tanque PAGE. Fundir el gel resolunte de la siguiente manera: En un tubo de 15 ml, mezcle 10 ml de solución de gel de resolución, 60 μL de persulfato de amonio al 10% (debe estar recién preparado) y 10 μL de TEMED (agregue TEMED en último lugar). Invierta el tubo suavemente 2-3x. Use pipeta para agregar rápidamente la solución de 10 ml anterior al cassette. Superponga con 2 ml de agua desionizada y filtrada y permita que el gel de resolución polimerice durante 30 min. NOTA: El siguiente protocolo PAGE se ha optimizado para un sistema PAGE vertical que utiliza casetes de fundición de 13,3 x 8,7 cm (ancho x largo) y 1,0 mm de grosor con un volumen total de aproximadamente 12 ml. Se pueden utilizar otros sistemas de casetes, pero pueden requerir la optimización por parte del usuario final.</li>
	<li>Después de que el gel de resolución se haya polimerizado por completo, deseche el agua superpuesta y funda el gel de apilamiento de la siguiente manera: en un tubo de 15 ml, mezcle 3 ml de la solución de gel de apilamiento, 90 μL de persulfato de amonio al 10% (debe estar recién preparado), 3 μL de TEMED (agregue TEMED por último).</li>
	<li>Invierta el tubo suavemente 2-3x. Use una pipeta para agregar rápidamente la solución de gel de apilamiento sobre el gel de resolución solidificado; llenar cassette hasta el borde. Inserte completamente el peine incluido con la configuración. Deje que el gel de apilamiento polimerice durante 30 min.</li>
	<li>Una vez que el gel se haya polimerizado, asegúrese de que la tira de cinta se retire de la parte inferior del cassette y vuelva a colocar el cassette en el conjunto del tanque PAGE.</li>
	<li>Llene las cámaras superior e inferior con amortiguador de cámara superior e inferior, respectivamente.</li>
	<li>Disolver las muestras secas del paso 1.11.4 en el volumen mínimo necesario de agua desionizada y filtrada (como máximo, el 50% del volumen de los pozos en el gel PAGE). Mezclar 1:1 con el búfer de carga de muestras. Cargue las muestras y las "escaleras" de oligosacáridos HS (ver Tabla 1) en el gel.</li>
	<li>Pre-ejecutar el gel durante 5 min a 100 V. Luego ejecute el gel a 200 V durante 20-25 min (para un gel resoludor de poliacrilamida al 15%). NOTA: Puede ser necesaria cierta optimización del tiempo de ejecución de 200 V. El rojo fenol migra por delante de los oligosacáridos de heparina que son 2 subunidades de polímero de longitud (es decir, grado de polimerización 2 o dp2); El azul de bromofenol migra antes que dp10-dp14. Los mejores resultados se obtienen cuando se aplica el voltaje de tal manera que la banda roja de fenol migra casi, pero no del todo, al fondo del gel. Ajuste el tiempo de ejecución en consecuencia.</li>
</ol>3. Protocolo de tinción de plata
<ol><li>Prepare todas las soluciones necesarias para la tinción de plata con anticipación (Tabla 2). NOTA: No toque directamente el gel PAGE hasta que se haya teñido, desarrollado y colocado en solución de parada. En su lugar, manipule el gel con herramientas limpias de plástico o vidrio. El manejo directo del gel dará como resultado distorsiones de huellas dactilares y otros artefactos visibles en el gel después de la tinción.</li>
	<li>Una vez que se complete la ejecución, desmonte el cassette y extraiga el gel en un recipiente limpio y mediano-grande lleno de agua desionizada y filtrada. NOTA: Para evitar manipular directamente el gel, use la punta de la pipeta u otro objeto de plástico para pelar suavemente el gel del cassette mientras está sumergido en agua. El gel puede ser frágil: manipule con cuidado.<ol>
<li>Deseche el agua. Manche el gel en solución de tinción azul alciano durante 5 min.</li>
		<li>Deseche la mancha azul alcense. Enjuague / lave rápidamente 2-3 veces con agua desionizada y filtrada hasta que se haya eliminado la mayor parte de la solución de tinción azul alciano.</li>
		<li>Deje que se desmanche en agua desionizada y filtrada durante la noche en el balancín. Asegúrese de que haya un gran volumen de agua desionizada y filtrada para garantizar que cualquier mancha residual se lave completamente del gel durante la noche.</li>
		<li>Gel de lavado en metanol al 50% (40 min en total, solución de cambio 2-3x).</li>
		<li>Lavar el gel en agua desionizada y filtrada durante 30 min. Deseche el agua y repita 3 veces más durante un total de 2 h, reemplazando el agua cada vez.</li>
		<li>En un recipiente fresco y limpio, manche el gel durante 30 minutos en solución de tinción de nitrato de plata.</li>
		<li>Enjuague / lave rápidamente 2-3 veces en agua desionizada y filtrada para eliminar completamente la solución de tinción de plata.</li>
		<li>Lavar durante 30 min en agua desionizada y filtrada. Deseche el agua y repita 2x durante un total de 90 minutos, reemplazando el baño de agua cada vez.</li>
		<li>Deseche el agua y agregue la solución en desarrollo.</li>
		<li>Una vez que se agrega la solución en desarrollo, observe cuidadosamente el gel y observe la aparición de bandas. Dependiendo de la calidad de la mancha y la masa de la muestra cargada, el desarrollo puede tardar desde unos pocos segundos hasta varios minutos.</li>
		<li>Tan pronto como las bandas deseadas sean visibles, deseche inmediatamente la solución en desarrollo y lávese brevemente con la solución de parada.</li>
		<li>Deseche el lavado de la solución de parada y reemplácelo con una solución de parada fresca. Dejar remojar durante 1 h en un balancín o agitador.</li>
		<li>Lavar en agua desionizada y filtrada durante la noche (sin embargo, el gel se puede tomar una imagen inmediatamente después de detener el lavado de la solución).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS%3A+A+critical+role+for+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membrane%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li>
<li>Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+the+developing%2C+healthy%2C+and+injured+lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).</li>
<li>Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+heparan+sulfate+in+the+glomerular+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane.</a> Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).</li>
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<li>Haeger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heparan+sulfate+contributes+to+alveolar+barrier+function+and+is+shed+during+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratry+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury.</a> American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).</li>
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<li>Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+glycosaminoglycan-derived+oligosaccharides+by+capillary+electrophoresis+using+reverse+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity.</a> Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).</li>
<li>Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass+characterization+of+glycosaminoglycans+with+different+degrees+of+sulfation+in+bioengineered+heparin+process+by+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography.</a> Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).</li>
<li>Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+mass+spectrometry+for+glycosaminoglycan+analysis%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review.</a> Molecular and Cellular Proteomics. , 100025(2021).</li>
<li>Whiteman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+measurement+of+Alcian+Blue-glycosaminoglycan+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes.</a> Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).</li>
<li>Yuan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mass+dependence+of+hyaluronan+detection+by+sandwich+ELISA-like+assay+and+membrane+blotting+using+biotinylated+hyaluronan+binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein.</a> Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los GAG desempeñan un papel central en muchos procesos biológicos diversos. Una de las principales funciones de los GAG sulfatados (como HS y CS) es interactuar y unirse a los ligandos, que pueden alterar las funciones de señalización aguas abajo. Un determinante importante de la afinidad de unión gag a los ligandos cognados es la longitud de la cadena de polímero GAG 8,9,14. Por esta razón, es importante que los investigadores ...

Los glicosaminoglicanos (GAG) son una familia diversa de polisacáridos lineales que son un elemento ubicuo en los organismos vivos y contribuyen a muchos procesos fisiológicos básicos1. Los GAG como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) pueden ser sulfatados en posiciones distintas a lo largo de la cadena de polisacáridos, impartiendo dominios geográficos de carga negativa. Estos GAG, cuando están atados a proteínas de la superficie celular conocidas como proteoglicanos, se proyectan en el espacio extracelular y se unen a ligandos cognados, lo que permite la regulación de los procesos de señalización cis- (ligando unido a la misma célula) y trans- (ligando unido a la célula vecina)2. Además, los GAG también desempeñan funciones críticas como elementos estructurales en tejidos como la membrana basal glomerular3,el glicocáliz endotelial vascular4 y el glicocáliz epitelial pulmonar5,y en tejidos conectivos como el cartílago6.
La longitud de las cadenas de polisacáridos GAG varía sustancialmente según su contexto biológico y puede ser dinámicamente alargada, escindida y modificada por un sistema regulador enzimático altamente complejo7. Es importante destacar que la longitud de las cadenas de polímeros GAG contribuye sustancialmente a su afinidad de unión por los ligandos y, posteriormente, a su función biológica8,9. Por esta razón, la determinación de la función de un GAG endógeno requiere la apreciación de su tamaño. Desafortunadamente, a diferencia de las proteínas y los ácidos nucleicos, existen muy pocas técnicas fácilmente disponibles para detectar y medir los GAG, lo que históricamente ha resultado en una investigación relativamente limitada sobre los roles biológicos de esta diversa familia de polisacáridos.
Este artículo describe cómo aislar y purificar los GAG de la mayoría de los tejidos biológicos y, también, describe cómo usar la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para evaluar la longitud de los polímeros aislados con un buen grado de especificidad. A diferencia de otros enfoques glucómicos altamente complejos (y a menudo basados en espectrometría de masas), este método se puede emplear utilizando equipos y técnicas de laboratorio estándar. Este enfoque práctico puede, por lo tanto, ampliar la capacidad de los investigadores para determinar el papel biológico de los GAG nativos y su interacción con ligandos contextualmente importantes.

<table><tbody><tr><td>Microcentrífuga de sobremesa Accuspin Micro17</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td>Cualquier combinación de microcentrífuga/rotor de sobremesa con capacidad de 14000 xG es apropiada</td></tr><tr><td>Acrilamida (sólida)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP170-100</td><td>Grado de electroforesis</td></tr><tr><td>Actinasa E</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5147</td><td>Mezcla de proteasas de S. griseus</td></tr><tr><td>Azul alcián 8GX (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC400460100</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A639-500</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio (líquido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>ACS</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>grado de electroforesis</td></tr><tr><td>Barnstead GenPure Pro Water Sistema de purificación</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10-451-217PKG</td><td>Cualquier sistema de desionización/purificación de agua es un sustituto aceptable</td></tr><tr><td>Ácido bórico (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Azul de bromphenol (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de calcio (sólido)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18-609-432</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (sólido)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC349610250</td> Detergente CHAPS de <td>grado de biología molecular</td></tr><tr><td>(3-((3-colamidopropil) dimetilaminamonio)-1-propanosulfonato)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28299</td><td></td></tr><tr><td>Condroitinasa ABC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3667</td><td></td></tr><tr><td>Criterion casete vacío para PAGE (1,0 mm de grosor, 12+2 pocillos)</td><td>Bio-Rad</td><td>3459901</td><td>Cualquier sistema de casete de fundición PAGE de 1,0 mm de grosor será suficiente</td></tr><tr><td>Criterion PAGE Sistema de celdas (celda y fuente de alimentación)</td><td>Bio-Rad</td><td>1656019</td><td>cualquier sistema PAGE de gel vertical comparable funcionará)</td></tr><tr><td>Diclorometano (líquido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>certificado</td><td>por AC610931000 ACS</td></tr><tr><td>EDTA sal disódica (sólida)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td>Molecular grado biológico</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial (líquido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A35-500</td><td>Certificado ACS</td></tr><tr><td>Glicina (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>G48-500 Grado de</td><td>electroforesis</td></tr><tr><td>Heparanasa I/III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3917</td><td>De Flavobacterium heparinum</td></tr><tr><td>Decasaccárido derivado de heparina (dp10)</td><td>galeno científico</td><td>HO10</td><td></td></tr><tr><td>Hexascárido derivado de la heparina (dp6)</td><td>Galeno científico</td><td>HO06</td><td></td></tr><tr><td>Oligosacárido derivado de la heparina (dp20)</td><td>Galeno</td><td>científico HO20</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (líquido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>Liofilizador A466-250</td><td></td></tr><tr><td>Labconco</td><td>7752020</td><td></td><td>Cualquier liofilizador que pueda alcanzar -40C y 0.135 Torr funcionará; también se puede reemplazar con un concentrador de vacío rotacional</td></tr><tr><td>Metanol (líquido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A412-500</td><td>Certificado ACS</td></tr><tr><td>Generador de imágenes moleculares Gel Doc XR System</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8170</td><td>Cualquier sistema de imagen en gel comparable es un sustituto aceptable</td></tr><tr><td>N,N'-metileno-bis-acrilamida (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP171-25 Grado de</td><td>electroforesis</td></tr><tr><td>Rojo de fenol (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>P74-10</td><td>Columna</td>de</tr><tr><td>intercambio iónico Q Mini H</td> de ácido libre <td>Vivapure</td><td>VS-IX01QH24</td><td>La columna de intercambio iónico debe tener un volumen de carga mínimo de 0,4 ml, un pH de trabajo de 2-12 y una selectividad para grupos iónicos con pKa de 11</td></tr><tr><td>Nitrato de plata (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S181-25</td><td>certificado ACS</td></tr><tr><td>Acetato de sodio (sólido)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S210-500 Grado de</td><td>biología molecular</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S392-212</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP220-1 Grado de</td><td>biología molecular</td></tr><tr><td>TEMED (N,N,N',N'-tetrametilendiamina)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>Grado de electroforesis</td></tr><tr><td>Tris base (sólido)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Filtros</td></tr><tr><td>ultracentrífugos de grado de biología molecular, 0,5 ml, corte de peso molecular de 3000 Da</td><td>Amicon</td><td>UFC500324</td><td>Se pueden utilizar unidades de filtro de mayor volumen, dependiendo del tamaño de la muestra.</td></tr><tr><td>Urea (sólida)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>Cualquier concentrador de vacío rotacional funcionará; se puede reemplazar con liofilizador</td></tr><tr><td>Unidad de filtro de vacío, de un solo uso, poro de 0,22 uM PES, volumen de 500 ml</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>569-0020</td><td>Volúmenes alternativos y materiales de filtro aceptables</td></tr></tbody></table>

detección de glicosaminoglicanos por electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

Los glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) como el sulfato de heparán (HS) y el sulfato de condroitina (CS) son omnipresentes en los organismos vivos y desempeñan un papel crítico en una variedad de estructuras y procesos biológicos básicos. Como polímeros, los GAG existen como una mezcla polidispersa que contiene cadenas de polisacáridos que pueden variar desde 4000 Da hasta más de 40,000 Da. Dentro de estas cadenas existen dominios de sulfatación, que confieren un patrón de carga negativa que facilita la interacción con residuos cargados positivamente de ligandos de proteínas cognadas. Los dominios sulfatados de los GAG deben tener una longitud suficiente para permitir estas interacciones electrostáticas. Para comprender la función de los GAG en los tejidos biológicos, el investigador debe ser capaz de aislar, purificar y medir el tamaño de los GAG. Este informe describe una técnica práctica y versátil basada en electroforesis en gel de poliacrilamida que se puede aprovechar para resolver diferencias relativamente pequeñas de tamaño entre los GAG aislados de una variedad de tipos de tejidos biológicos.

El azul alciano se utiliza para teñir GAGs sulfatados 10; esta señal se amplifica mediante el uso de una mancha de plata posterior 11. La Figura 1 proporciona una demostración visual del proceso de desarrollo de tinción de plata. Como se demostró, la señal azul alcense que representa los GAG separados por electroforesis se amplifica a medida que el agente en desarrollo penetra en el gel de poliacrilamida. Por lo general, el proceso de desarroll...

Este informe describe técnicas para aislar y purificar glicosaminoglicanos sulfatados (GAG) a partir de muestras biológicas y un enfoque de electroforesis en gel de poliacrilamida para aproximarse a su tamaño. Los GAG contribuyen a la estructura de los tejidos e influyen en los procesos de señalización a través de la interacción electrostática con las proteínas. La longitud del polímero GAG contribuye a su afinidad de unión por los ligandos cognados.

Detección de glicosaminoglicanos por electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

Este protocolo describe una técnica sencilla que se puede utilizar para detectar la presencia y medir la longitud de los glicosaminoglicanos, que son moléculas de importancia cada vez más reconocida para muchos procesos biológicos. Esta técnica es fácilmente adaptable a la mayoría de los laboratorios de ciencias de la vida. Las técnicas glucómicas comparables a menudo requieren equipos y experiencia que solo se encuentran en los laboratorios de investigación de glicoquímica.Esta técnica puede ser especialmente útil para los investigadores que están interesados en estudiar el glicocáliz, una capa de polisacáridos que recubre las superficies endotelial y epitelial del cuerpo humano. Comience colocando un cassette vacío en el tanque PAGE. Funde un gel de resolución mezclando 10 mililitros de solución de gel de resolución con 60 microlitros de persulfato de amonio 10% en un tubo de 15 mililitros.Luego agregue 10 microlitros de TEMED. Invierta el tubo suavemente dos o tres veces. Agregue rápidamente 10 mililitros de la solución de gel de poliacrilamida activada al cassette usando una pipeta.Superponga con dos mililitros de agua filtrada desionizada y permita que el gel de resolución polimerice durante 30 minutos. Después de que el gel de resolución se haya polimerizado por completo, deseche el agua superpuesta. Fundir el gel de apilamiento mezclando tres mililitros de solución de gel de apilamiento con 90 microlitros de persulfato de amonio 10% recién preparado en un tubo de 15 mililitros.Luego agregue tres microlitros de TEMED e invierta el tubo suavemente de dos a tres veces. Use una pipeta para agregar rápidamente la solución de gel de apilamiento sobre el gel de resolución solidificado hasta que el cassette se llene hasta el borde. Inserte completamente el peine incluido con el cassette de gel de poliacrilamida vacío y permita que el gel de apilamiento polimerice durante 30 minutos.Una vez polimerizado el gel, retire la tira de cinta de la parte inferior del cassette y vuelva a colocar el cassette en el conjunto del tanque PAGE. Llene las cámaras superior e inferior con las respectivas soluciones tampón. Disolver muestras secas de glicosaminoglicanos en el volumen mínimo necesario de agua filtrada desionizada y mezclar con el tampón de carga de muestras en una proporción de uno a uno.Cargue las muestras y las escaleras de oligosacáridos HS en el gel. Ejecute el gel durante cinco minutos a 100 voltios, luego hágalo funcionar a 200 voltios durante 20 a 100 minutos, dependiendo del porcentaje de acrilamida de la solución de gel de resolución. Una vez que se complete la ejecución, desmonte el cassette y extraiga cuidadosamente el gel en un recipiente grande y limpio lleno de agua filtrada desionizada.Luego deseche el agua y manche el gel en una solución de tinción azul alciano durante cinco minutos. Deseche la mancha azul alciano y lave rápidamente dos o tres veces con agua filtrada desionizada hasta que se haya eliminado la mayor parte de la solución de tinción azul alciano. Manche el gel en una solución de tinción de nitrato de plata en un recipiente fresco y limpio durante 30 minutos.Luego lave de dos a tres veces durante 30 minutos cada una en agua filtrada desionizada para eliminar completamente la solución de tinción de plata. Deseche el agua y agregue la solución de desarrollo. Observe cuidadosamente el gel para la aparición de bandas.Dependiendo de la calidad de la mancha y la masa de la muestra cargada, el desarrollo puede tardar desde unos pocos segundos hasta varios minutos. Tan pronto como las bandas deseadas sean visibles, deseche inmediatamente la solución en desarrollo y lave el gel brevemente con la solución STOP. Los glicosaminoglicanos aislados y purificados se visualizaron mediante la técnica de tinción de azul y plata de Alcian después de la resolución dependiente de la densidad mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida.Como se ve en esta figura, los oligosacáridos de sulfato de heparán de diferentes longitudes de polímero fueron fácilmente detectables utilizando este enfoque basado en PAGE. El límite de detección de este método, tan bajo como 0,5 microgramos, muestra que la técnica es altamente sensible en la detección de glicosaminoglicanos aislados y purificados a partir de muestras biológicas. De los cuatro oligosacáridos diferentes de sulfato de heparina visualizados utilizando este método, la heparina no fraccionada fue la menos fácilmente detectable.Debido a la polidispersidad de la heparina no fraccionada, la densidad de cada banda individual de esta muestra es menor que las bandas producidas por una masa igual de oligosacáridos de heparina purificada. La eficiencia de la purificación de glicosaminoglicanos a partir de muestras biológicas líquidas se evaluó utilizando muestras de lavado broncoalveolar recolectadas de ratones, que originalmente contenían concentraciones relativamente bajas de glicosaminoglicanos. Además, se demostró el éxito de esta técnica utilizando sulfato de heparina aislado de homogeneizado de pulmón entero, que produjo una amplia cantidad de sulfato de heparina aislado, con los fragmentos más pequeños que equivalen a aproximadamente 10 subunidades disacáridas en masa.Es muy importante usar reactivos recién preparados y filtrar cada reactivo utilizado en este protocolo. Es fundamental utilizar reactivos de la más alta pureza y calidad para realizar con éxito esta técnica.

detection-glycosaminoglycans-polyacrylamide-gel-electrophoresis

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Usando glicosidasas específicas para eliminar los azúcares de las glicoproteínas seguido de SDS-PAGE es un método útil para detectar las modificaciones de glicanos de las muestras de proteínas y es una buena opción para los estudios de glicobiología inicial. Siguientes cambios deglicosilación pueden ser detectados como cambios en la movilidad en gel o por tinción con glicano reactivos sensibles.

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En este video, demostramos un procedimiento para la tinción combinada de azul alcián y plata de fragmentos de oligosacáridos de glicosaminoglicanos sulfatados. Esta técnica de tinción combinada amplifica significativamente las bandas de polímeros de glicosaminoglicanos de diferentes longitudes en geles de poliacrilamida.

Tinción de plata de glicosaminoglicanos sulfatados: un método de tinción para la visualización de glicosaminoglicanos sulfatados en geles de poliacrilamida

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Electroforesis en gel de poliacrilamida: una técnica analítica para detectar sulfatos de heparán de diferentes longitudes de cadena aislados de tejido pulmonar de ratón

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Detección de glicosaminoglicanos por electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción de plata

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