Monitoreo de las interacciones proteína-ligando en células humanas mediante RMN cuantitativa en células en tiempo real utilizando un biorreactor de alta densidad celular
9 de marzo de 2021
Este protocolo describe la configuración de un biorreactor de RMN para mantener viables las células humanas encapsuladas durante un máximo de 72 h, seguido de la adquisición y el análisis de datos de RMN en las células resueltos en el tiempo. La metodología se aplica para monitorizar las interacciones proteína-ligando intracelular en tiempo real.
La espectroscopia de RMN en las células ofrece un enfoque único para estudiar la estructura y la función de las proteínas directamente en las células vivas y para monitorear procesos biológicamente relevantes, como las interacciones proteína-ligando. Este biorreactor de RMN puede mantener un alto número de células humanas viables y metabólicamente activas durante varios días en el espectrómetro, lo que permite aplicaciones de RMN en la célula en tiempo real. Este método se puede aplicar a cualquier proteína intracelular soluble y de caída libre que experimente cambios conformacionales o químicos.
El etiquetado de isótopos amplía aún más la aplicabilidad del método. Para comenzar, ensamble la unidad de flujo utilizando un segundo tubo de RMN de la unidad de flujo, que luego se reemplazará por el que contiene células. Consulte las instrucciones de funcionamiento de la unidad de flujo para un montaje correcto.
Ajuste el baño de agua conectado al control de temperatura de la unidad de flujo a 37 grados centígrados y coloque la botella del depósito en el baño de agua. Conecte el tubo FEP de la botella del depósito a la bomba. Gire la válvula del biorreactor para evitar y prellene la bomba con medio.
Luego, gire la válvula del biorreactor para que fluya y llene previamente el biorreactor con el medio a 0.1 mililitros por minuto. Tome un matraz T75 de células T HEK 293 transfectadas de la incubadora de dióxido de carbono y retire el medio gastado. Agregue dos mililitros de tripsina EDTA a las células e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para separar las células.
Inactive la tripsina con 20 mililitros de DMEM completo y vuelva a suspender completamente las células mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo. Luego, transfiéralos en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar las células a 800X G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
Transfiera el pellet celular a un tubo de microcentrífuga con tapa de 1,5 mililitros. Para incrustar las células en hilos de agarosa, derrita una alícuota de agarosa solidificada a 85 grados Celsius en un calentador de bloque, luego manténgala en solución a 37 grados Celsius en el calentador de bloque. Con una pipeta Pasteur, llene la parte inferior del tubo de RMN de la unidad de flujo con 60 a 70 microlitros de gel de agarosa al 1,5% y colóquelo sobre hielo para crear un tapón inferior de cinco milímetros de altura.
Caliente el pellet de la celda durante 15 a 20 segundos en el calentador de bloque y vuelva a suspender cuidadosamente las celdas en 450 microlitros de solución de agarosa, evitando la formación de burbujas. Aspire la suspensión de célula/agarosa en un tubo PEEK de cromatografía de 30 centímetros de largo de 0,75 milímetros de diámetro interior conectado a una jeringa de un mililitro. Deje que el tubo se enfríe a temperatura ambiente durante dos minutos.
Llene previamente el tubo de RMN de la unidad de flujo con 100 microlitros de PBS a temperatura ambiente. Fundir hilos de células incrustadas en agarosa en el tubo de RMN de la unidad de flujo empujando suavemente la jeringa. Retire el tubo de RMN vacío de la unidad de flujo y aumente el caudal a dos mililitros por minuto durante unos minutos para eliminar las burbujas de gas residuales en el tubo de entrada.
Ajuste el caudal a 0,2 mililitros por minuto e inserte el tubo de RMN que contiene las células empujándolo hacia arriba lenta pero constantemente. Suministrar el medio biorreactor a un caudal de 0,1 mililitros por minuto. Ajuste la temperatura en el espectrómetro de RMN a 310 Kelvin e inserte la unidad de flujo en el espectrómetro.
Una vez que el biorreactor se inserta en el espectrómetro de RMN, espere unos minutos para permitir el intercambio del medio. Ajuste la coincidencia y el ajuste del canal de protones, ajuste el imán y calcule la longitud del pulso duro de 90 grados del protón. Ajuste los niveles de potencia del protón en cada secuencia de pulsos de acuerdo con el pulso duro del protón.
Registre un primer espectro de RMN de protones zgesgp para registrar el contenido de la muestra en la homogeneidad del campo. Copie el zgesgp y el p3919gp o los experimentos SOFAST-HMQC al número deseado y póngalos en cola en la cola de adquisición. Inyecte una solución concentrada de la molécula externa en la botella de depósito medio perforando el tubo de silicona con una jeringa estéril de aguja larga.
Al final del experimento de RMN, reemplace el tubo que contiene las células con un tubo vacío y enjuague la unidad de flujo con agua. Para las células que expresan anhidrasa carbónica no etiquetada, procese los espectros p3919gp aplicando la función de ventana de llenado cero y de ampliación de línea exponencial. Para las células que expresan nitrógeno-15 marcado, superóxido dismutasa, procese los espectros SOFAST-HMQC aplicando la función de ventana de campana de llenado cero y signo cuadrado en ambas dimensiones.
En MATLAB, importe las regiones espectrales mediante el script personalizado Load_ascii_spectra. Ejecute el script Load_acqus para extraer las marcas de tiempo de los espectros 1D. Abra la GUI de MCR-ALS 2.0 ejecutando el script mcr_main y, en la pestaña Selección de datos, cargue la matriz de espectros.
Verifique los datos graficándolos. Evalúe el número de componentes, ya sea por descomposición de valores singulares o manualmente, y seleccione un método para la estimación inicial de los espectros puros. Se puede utilizar la detección de variables más pura o el análisis factorial evolutivo.
En la ventana Selección del conjunto de datos, seleccione Continuar. Establezca las restricciones para las concentraciones en la ventana Restricciones:modo de fila. Aplique una restricción de no negatividad, seleccionando fnnls como Implementación, y dos como el número de especies.
Luego, aplique una restricción de cierre, establezca la restricción en una, la condición de restricción de cierre como igual a y aplíquela a todas las especies. Establezca las restricciones para los espectros en la ventana Restricciones:modo columna. Aplicar una restricción de no negatividad, seleccionando fnnls como implementación, y dos como el número de especies.
En la ventana final, establezca 50 iteraciones y un criterio de convergencia de 0,01. Especifique los nombres de salida para concentraciones, espectros y desviación estándar. Haga clic en Continuar para ejecutar el ajuste MCR-ALS.
Las células en el biorreactor se pueden mantener vivas hasta por 72 horas, como lo confirma una prueba de azul de tripano. El biorreactor se utilizó para la monitorización en tiempo real de la unión de dos inhibidores, acetazolamida y metazolamida a la anhidrasa carbónica sobreexpresada en el citosol de las células T HEK 293. La presencia de señales de la proteína sobreexpresada y la homogeneidad del campo se evaluaron con el primer espectro de protones que esculpe la excitación.
En el caso de la anhidrasa carbónica, la unión intracelular de los dos inhibidores se monitorizó mediante la observación de señales de protones en la región entre 11 y 16 partes por millón del espectro WATERGATE, procedentes de las histidinas coordinadoras de zinc y otros residuos aromáticos. El enlace exitoso fue confirmado por la aparición de señales adicionales. MCR-ALS se utilizó para separar las señales de RMN que surgen de la anhidrasa carbónica libre y unida, y para proporcionar los perfiles de concentración relativa de las dos especies.
El biorreactor se aplicó para monitorear la formación de enlace disulfuro intramolecular de superóxido dismutasa unido a zinc promovido por ebselen, un imitador de glutatión peroxidasa. El análisis MCR-ALS en regiones seleccionadas del espectro 2D separó las señales que surgen de las dos especies y proporcionó sus perfiles de concentración relativa. Es importante insertar y retirar el tubo de RMN de la unidad de flujo de forma lenta y constante para evitar saltos de presión que puedan provocar la formación de burbujas.
El desarrollo de biorreactores de RMN ha allanado el camino para estudiar los procesos dependientes del tiempo de resolución atómica, como el trazado de la regulación redux y las interacciones fármaco/diana en las células vivas.
Descripción general
Este artículo describe el uso de la espectroscopía de RMN en células combinada con un biorreactor RMN especializado para monitorear interacciones proteína-ligando y modificaciones químicas de proteínas en células humanas vivas. El flujo de trabajo descrito permite la observación en tiempo real y con resolución atómica de procesos intracelulares, superando las limitaciones tradicionales de viabilidad celular dentro del espectrómetro de RMN. El protocolo incluye la preparación de muestras, el montaje del biorreactor, la adquisición de datos de RMN y el análisis cuantitativo mediante resolución de curvas multivariante (MCR-ALS).
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología estructural
- Bioquímica celular
- Espectroscopía de RMN
Antecedentes
- La RMN en células permite la observación directa de la estructura y dinámica de proteínas en células vivas.
- La RMN tradicional en células está limitada por la corta viabilidad de las células en el espectrómetro.
- Los biorreactores de RMN pueden prolongar la viabilidad celular, posibilitando experimentos más largos y el monitoreo en tiempo real.
- El análisis cuantitativo de los datos de RMN en células vivas es complicado debido al solapamiento complejo de señales y a cambios dinámicos.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo detallado para utilizar un biorreactor de RMN con el fin de mantener células humanas viables durante períodos prolongados durante experimentos de RMN.
- Demostrar el monitoreo en tiempo real de interacciones proteína-ligando y modificaciones proteicas en células vivas.
- Presentar un flujo de trabajo para el análisis cuantitativo de datos de RMN en células en tiempo real mediante MCR-ALS.
Métodos Utilizados
- Preparación de células HEK 293T transfectadas e inclusión en hilos de agarosa.
- Ensamblaje y operación de un biorreactor de RMN con control de temperatura y flujo continuo de medio.
- Adquisición en tiempo real de datos de RMN en células, incluyendo experimentos 1D y 2D (por ejemplo, SOFAST-HMQC).
- Análisis cuantitativo de espectros de RMN mediante resolución de curvas multivariadas con mínimos cuadrados alternantes (MCR-ALS) en MATLAB.
Resultados principales
- El biorreactor mantuvo una alta viabilidad celular y actividad metabólica durante hasta 72 horas.
- Se logró el monitoreo en tiempo real de la unión de inhibidores (acetazolamida, metazolamida) a la anhidrasa carbónica en células vivas.
- MCR-ALS permitió la separación y cuantificación de especies proteicas libres y ligadas a lo largo del tiempo.
- El sistema también se utilizó para monitorear modificaciones químicas en proteínas, como la formación de enlaces disulfuro en la superóxido dismutasa inducida por ebselen.
Conclusiones
- El sistema de biorreactor de RMN permite estudios prolongados en tiempo real dentro de células sobre interacciones y modificaciones entre proteínas y ligandos.
- MCR-ALS proporciona un método robusto para el análisis cuantitativo de datos complejos de RMN resueltos temporalmente en células vivas.
- Este enfoque mejora el estudio de procesos biológicos dinámicos e interacciones fármaco-diana a resolución atómica en un contexto celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación en tiempo real mediante RMN en células utilizando un biorreactor de alta densidad permite el monitoreo directo, con resolución atómica, de interacciones proteína-ligando y modificaciones químicas en células humanas vivas. Esta capacidad aborda una brecha crítica en la fase inicial del descubrimiento de fármacos al proporcionar información dinámica y cuantitativa sobre la interacción con el blanco intracelular y los procesos mecanicistas. El enfoque mejora la confianza predictiva en las etapas de validación del blanco y optimización del fármaco líder, apoyando decisiones de cartera ajustadas al riesgo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la observación directa de la unión proteína-ligando y de los cambios conformacionales en un contexto celular nativo.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante la cuantificación del compromiso del objetivo intracelular en tiempo real.
- Proporciona perfiles cinéticos y de concentración para la validación funcional del objetivo.
- Facilita la clasificación de objetivos basada en lecturas dinámicas y cuantitativas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona sistemas biológicos validados y reproducibles para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Permite resultados cuantitativos y resueltos en el tiempo de ensayos para la evaluación de compuestos.
- Apoya la estandarización de ensayos y la escalabilidad de la plataforma mediante un funcionamiento robusto del biorreactor.
- Mejora la preparación para cribado al mantener una alta viabilidad celular y actividad metabólica.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea los datos de interacción con objetivos intracelulares con modelos celulares relevantes para la enfermedad.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el seguimiento en tiempo real de modificaciones e interacciones de proteínas.
- Permite tomar decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en evidencia cuantitativa a nivel celular.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales al vincular eventos moleculares con resultados funcionales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad del descubrimiento desde la validación temprana de objetivos hasta la identificación de compuestos iniciales y la investigación preclínica, proporcionando una plataforma reutilizable para el análisis en tiempo real y cuantitativo de las interacciones proteína-ligando en células vivas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el monitoreo de procesos intracelulares dinámicos.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles de ensayos para la evaluación y optimización de compuestos.
- Análisis: Ofrece perfiles de concentración y parámetros cinéticos mediante análisis de resolución de curvas multivariante (MCR-ALS).
- Investigación Traductiva: Conecta las etapas de descubrimiento y preclínica al permitir el monitoreo en tiempo real en modelos celulares humanos relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado y escalable para su aplicación repetida en diferentes objetivos y programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de los flujos de trabajo de RMN en células.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos cuantitativos en tiempo real.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de los programas de descubrimiento.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en espectroscopía de RMN, cultivo celular y análisis cuantitativo de datos.
- Necesita instrumentación especializada, incluyendo un biorreactor de RMN con control de temperatura y un sistema de flujo continuo de medio.
- Exige estandarización entre equipos para los protocolos de preparación de muestras, adquisición de datos y análisis.
- Adaptable a diversas proteínas intracelulares solubles y en libre rotación, con posibilidad de marcado isotópico.
- La viabilidad celular y la actividad metabólica deben mantenerse cuidadosamente para garantizar la calidad y la reproducibilidad de los datos.
