Name: Modelo de herida humana ex vivo y enfoque de tinción de montaje completo para evaluar con precisión la reparación de la piel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprende un protocolo ex vivo de heridas en piel humana para evaluar la reparación cutánea con alta precisión. Este método permite comparar la cicatrización entre piel sana y diabética mediante tinción de montaje completo.

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Nos gustaría agradecer al Sr. Paolo Matteuci y al Sr. George Smith por proporcionar tejido al paciente. También estamos agradecidos con la señorita Amber Rose Stafford por ayudar con la recolección de tejidos y el Daisy Appeal por proporcionar instalaciones de laboratorio.

<ol><li>Lindholm, C., Searle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+management+for+the+21st+century%3A+combining+effectiveness+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency.</a> International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).</li>
<li>Guest, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+economic+burden+that+different+wound+types+impose+on+the+UK%27s+National+Health+Service%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service.</a> International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).</li>
<li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+foot+ulcer+management+in+clinical+practice+in+the+UK%3A+costs+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes.</a> International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).</li>
<li>López-Valverde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+and+long-term+all-cause+mortality+in+patients+with+diabetes+who+underwent+a+lower+extremity+amputation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+estrogen+in+cutaneous+ageing+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Maturitas%22%5BJournal%5D)">The role of estrogen in cutaneous ageing and repair.</a> Maturitas. 103, 60-64 (2017).</li>
<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+the+treatment+of+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Challenges in the treatment of chronic wounds.</a> Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+cellular+mechanisms+and+pathological+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes.</a> Open Biology. 10 (9), 200223(2020).</li>
<li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+wound+repair%3A+Are+they+cutting+it%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Animal models of wound repair: Are they cutting it.</a> Experimental Dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).</li>
<li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modeling+conundrum%3A+murine+models+for+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li>
<li>Mazio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-vascularized+dermis+model+for+fast+and+functional+anastomosis+with+host+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Pre-vascularized dermis model for fast and functional anastomosis with host vasculature.</a> Biomaterials. 192, 159-170 (2019).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+silver+bioactive+glass+elicits+antimicrobial+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+ex+vivo+skin+wound+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1450(2018).</li>
<li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+local+senescence+in+diabetic+wound+healing+is+linked+to+pathological+repair+via+CXCR2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).</li>
<li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+iron+promotes+wound+repair+via+M2+macrophage+polarization+and+the+chemokine+%28CC+motif%29+ligands+17+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22.</a> The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).</li>
<li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 162, e61616(2020).</li>
<li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li>
<li>Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+excisional+wound%3A+an+improved+model+for+human+ex+vivo+wound+epithelialization+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies.</a> Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).</li>
<li>Olsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+humanistic+and+economic+burden+of+chronic+wounds%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).</li>
<li>Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+ex+vivo+wound+healing+model+in+the+adult+human+skin%3A+Functional+evaluation+using+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).</li>
<li>Brownhill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+assessment+of+single-use+negative+pressure+wound+therapy+during+in+vivo+porcine+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing.</a> Advances in Wound Care. , (2020).</li>
<li>Diekmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+skin+equivalent+reflecting+some+aspects+of+in+vivo+aged+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin.</a> Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).</li>
<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+equivalents+demonstrate+need+for+neuro-immuno-cutaneous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system.</a> Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283(2019).</li>
<li>Dijkgraaf, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+patrol+by+resident+memory+CD8%2B+T+cells+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin.</a> Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).</li>
<li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+isolation+from+human+skin+for+phenotypic+analysis+and+ex+vivo+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564(2016).</li>
<li>Pupovac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+immunocompetent+3D+skin+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Toward immunocompetent 3D skin models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405(2018).</li>
<li>Ataç, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+on-a-chip%3A+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscale%2C+full-thickness%2C+human+skin+on+a+chip+assay+simulating+neutrophil+responses+to+skin+infection+and+antibiotic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).</li>
<li>Jardet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+human+Th17-driven+ex+vivo+skin+inflammation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model.</a> Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+attenuates+diabetes-induced+tau+hyperphosphorylation+in+vitro+and+in+vivo+by+enhancing+autophagic+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance.</a> Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).</li>
<li>Demirovic, D., Rattan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+induces+stress+response+and+hormetically+modulates+wound+healing+ability+of+human+skin+fibroblasts+undergoing+ageing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro.</a> Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+senescence%3A+A+functional+link+between+diabetes+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing.</a> Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).</li>
<li>Fisher, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fragmentation+promotes+oxidative+stress+and+elevates+matrix+metalloproteinase-1+in+fibroblasts+in+aged+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).</li>
<li>Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+matrix+metalloproteinases+and+collagen+fragmentation+in+photodamaged+human+skin%3A+impact+of+altered+extracellular+matrix+microenvironment+on+dermal+fibroblast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362(2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

En este protocolo experimental, describimos un método optimizado para evaluar el cierre de heridas en piel humana ex vivo utilizando tinción de tejido de montaje completo. Este es un recurso importante para permitir la evaluación crítica de posibles tratamientos de heridas y para proporcionar una mejor comprensión de la respuesta humana de reparación de heridas. Hemos publicado la evaluación de curación en heridas cutáneas ex vivo anteriormente12,13, sin embargo, en estos informes no se utilizó el enfoque de tinción de montaje completo para medir el cierre de la herida. La tinción de montaje completo es mucho más fácil y requiere menos experiencia técnica que la histología estándar, que implica la incrustación de parafina o OCT y la seccionamiento de muestras. El procedimiento de montaje completo también reduce la variabilidad experimental, lo que permite cuantificar toda la herida y no solo una sola sección transversal en una posición definida dentro del tejido (ver Figura 4B para ilustración comparativa). Apoyamos plenamente la importancia de cuantificar la curación de toda la estructura de la herida no simétrica, como lo describen claramente Rhea y Dunnwald para las heridas agudas murinas14. Estos autores mostraron la importancia de seccionar en serie las heridas por escisión in vivo para mediciones reproducibles y precisas de la morfología de la herida. La seccionamiento en serie podría aplicarse igualmente a las heridas humanas ex vivo; sin embargo, para una cuantificación precisa del cierre de la herida y la reepitelización, la tinción de montaje completo de alto rendimiento debe ser el método preferido. Observamos que este protocolo de tinción de montaje completo también debe ser compatible con el procesamiento posterior (cera u OCT) para el análisis histológico tradicional.
La tinción de montaje completo no está exenta de desventajas. Si bien ofrece una mayor reproducibilidad en experimentos de curación de heridas, requiere el uso de más tejido para el análisis que las técnicas histológicas estándar. Esto puede ser un problema en el que el acceso al tejido es limitado, particularmente cuando se necesitan evaluar múltiples anticuerpos. Un enfoque alternativo sería emplear un método de herida incisional donde el ancho de la herida es relativamente uniforme y la variabilidad se reduce (como se muestra en las heridas de ratón y humanos15,16). Sin embargo, las heridas por escisión siguen siendo más aplicables a la mayoría de los tipos de heridas patológicas17.
En este estudio, se crearon heridas de espesor parcial de 2 mm dentro del centro de los explantes de piel de 6 mm. Este método puede optimizarse para tamaños alternativos de heridas y explantes por escisión a diferentes profundidades de la piel18. Además, la fuerza requerida para generar heridas variará entre los donantes, donde la piel envejecida requerirá menos fuerza para la biopsia. También evitaríamos el uso de pieles que muestren estrías prominentes u otras alteraciones estructurales. Hemos validado una gama de anticuerpos para considerar diferentes aspectos de la respuesta curativa ex vivo. Este protocolo también se puede utilizar con otros anticuerpos relevantes para la piel, donde las concentraciones de anticuerpos y los tiempos de incubación deberán optimizarse. Sin embargo, creemos que nuestro protocolo es el más adecuado para la cuantificación absoluta del cierre total de la herida, seguido de la evaluación espacial de proteínas específicas de interés. Si bien la montura completa proporciona una resolución reducida de la inmunolocalización en comparación con el análisis histológico estándar de las secciones de tejido, proporciona información 3D adicional que falta en la histología 2D estándar.
Una advertencia de la evaluación de la curación en la piel ex vivo versus los modelos in vivo es que carece de una respuesta sistémica. Un aspecto importante de la reparación de heridas es la inflamación y la posterior granulación tisular, que es causada por una afluencia de células inflamatorias y células endoteliales de la vasculatura19. A pesar de esta limitación, la piel ex vivo todavía proporciona una mejor recapitulación de la curación clínica que los ensayos de heridas basados en células. Los experimentos in vitro en general involucran monocapas de tipo unicelular o cocultivos cultivados en plástico de cultivo de tejidos, mientras que la piel ex vivo proporciona un entorno nativo para explorar el comportamiento celular. Más recientemente, han surgido una serie de sistemas equivalentes de piel, donde la piel se cultiva en un entorno de laboratorio a partir de matriz artificial y células aisladas de la piel20,21. Aunque estos modelos imitan la piel humana mejor que la mayoría de los enfoques in vitro, todavía no simulan completamente el entorno del tejido nativo y generalmente son demasiado frágiles para lesionarse de manera reproducible. Además, nosotros (y otros) hemos demostrado que el tejido de la piel humana ex vivo retiene las células inmunes residentes, lo que sin duda contribuirá a la reparación22,23. El trabajo futuro debe centrarse ahora en ampliar la viabilidad y la inmunocompetencia del modelo ex vivo para la evaluación de la curación en etapa tardía24. Una opción es un mayor avance de las prometedoras tecnologías de órganos en un chip capaces de prolongar la viabilidad de los tejidos y mantener la arquitectura nativa de la piel durante un período de hasta dos semanas en cultivo25. Los modelos ex vivo también han comenzado a considerar la importancia de la respuesta inflamatoria de la piel mediante la incorporación exitosa de células inmunes, como los neutrófilos, en el tejido huésped26 o la inyección de anticuerpos al tejido huésped para provocar una reacción inmune27. Esperamos que estos hallazgos allanen el camino para el desarrollo de métodos más refinados y traducibles en el futuro.
Un beneficio importante del uso de piel ex vivo para medir el cierre de la herida es la capacidad de comparar las tasas de curación en tejido sano (por ejemplo, no diabético) versus patológico (por ejemplo, diabético o envejecido). Aquí demostramos que la reepilecialización y la formación de barreras están realmente deterioradas en las heridas diabéticas versus sanas ex vivo. De hecho, esto proporciona una ruta para la evaluación preclínica de la reparación patológica, donde el envejecimiento y la diabetes son los principales factores de riesgo para desarrollar heridas crónicas1. Si bien existen modelos patológicos in vitro, como células aisladas de tejido envejecido y diabético, o células cultivadas en glucosa alta para imitar la hiperglucemia28,29, estas células pueden perder rápidamente su fenotipo una vez eliminadas del microambiente in vivo. Un componente importante del entorno de curación patológica extrínseca es la matriz dérmica, que se altera tanto en el envejecimiento como en la diabetes30. De hecho, esta matriz perturbada afecta el comportamiento de los fibroblastos residentes e ingenuos31,32. Por lo tanto, no se puede subestimar la importancia de estudiar las células en su entorno de tejido huésped.
En resumen, nuestro protocolo proporciona una plataforma importante para cuantificar la reepilefilización de heridas humanas, explorar factores reguladores y probar la validez y eficacia de posibles terapias12,13. Si bien las pruebas preclínicas aún requieren enfoques in vivo, una estrategia combinada que utilice tejido humano ex vivo y heridas murinas in vivo debería refinar la vía preclínica, reduciendo el uso de animales al tiempo que aumenta la traducibilidad entre especies.

Las heridas crónicas que no cicatrizan, que son altamente prevalentes en los ancianos y diabéticos, son un área muy poco apreciada de necesidad clínica insatisfecha. Estas heridas presentan una gran carga física y psicológica para los pacientes y cuestan a los proveedores de atención médica miles de millones cada año para tratar1. A pesar de una mejor comprensión de la biología de las heridas y los avances en la tecnología, hasta el 40% de las heridas crónicas aún no se curan después de la mejor atención estándar2. Así, el 14-26% de los pacientes con úlceras del pie diabético requieren posteriormente la amputación3,mientras que la tasa de mortalidad post-amputación a 5 años se sitúa en aproximadamente el 70%4. Como resultado, existe un requisito urgente para desarrollar nuevas terapias eficaces para mejorar la calidad de vida del paciente al tiempo que se reduce la carga sustancial de atención médica impuesta por la mala cicatrización de las heridas. Los modelos preclínicos mal predictivos siguen siendo un obstáculo importante para el desarrollo de nuevas terapias efectivas.
La reparación de heridas es un proceso dinámico y multifacético que involucra una amplia gama de tipos de células, innumerables niveles de comunicación y un entorno tisular que se remodela temporalmente. La curación de la piel se basa en cuatro etapas reparadoras principales: hemostasia, inflamación, proliferación y remodelación de la matriz. Estas etapas en última instancia actúan para prevenir la pérdida de sangre y la infección, cerrar la superficie de la herida (un proceso denominado reepilecialización) y devolver la piel a un estado no herido5. Las heridas crónicas se asocian con una etiología diversa y una perturbación generalizada de los procesos de curación6,lo que complica aún más la identificación de dianas terapéuticas. Sin embargo, se ha desarrollado una amplia gama de modelos para dilucidar los impulsores moleculares y celulares de la patología de heridas y probar nuevos enfoques terapéuticos7.
El modelo de reparación de heridas más utilizado es la herida aguda en el ratón. Los ratones son altamente tratables para estudios mecanicistas y proporcionan modelos validados de envejecimiento y diabetes8. A pesar de las similitudes generales mostradas entre la curación de ratones y humanos, las diferencias entre especies en la estructura de la piel y la dinámica de curación permanecen. Esto significa que la mayoría de las investigaciones de heridas murinas no se traducen fácilmente a la clínica9. En consecuencia, se ha dado un impulso hacia los sistemas humanos in vitro y ex vivo con alta aplicabilidad y traducibilidad10,11.
Aquí proporcionamos un protocolo en profundidad para la realización de heridas por escisión de espesor parcial en piel humana ex vivo. También describimos nuestro enfoque de tinción de montaje completo como un método altamente reproducible para evaluar la curación ex vivo de la piel humana. Mostramos la trayectoria de la reparación epidérmica (reepilecialización) y la posterior formación de barreras, evaluando la tasa de cierre de heridas en piel humana sana versus diabética. Finalmente, demostramos cómo la tinción de montaje completo se puede adaptar para su uso con una variedad de anticuerpos para evaluar varios aspectos de la respuesta de curación.

<table><tbody><tr><td>50 mL Tubos Falcon</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Para el lavado de la piel</td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml TubeOne Microcentrífuga Tubos, Natural (Estéril)</td><td>Starlab</td><td>S1615-5510</td><td>Para tinción de montaje completo</td></tr><tr><td>48-Pocillos Placa CytoOne, tratada</td> TC <td>Starlab</td><td>CC7682-7548</td><td>Para tinción de montaje completo</td></tr><tr><td>Ácido acético Glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>A/0400/PB15</td><td>Parte del bromuro</td></tr> <tr><td></td><td>de fijación alquiltrimetilamonioSigma-Aldrich</td><td>M7635</td><td>Parte del anticuerpo de actina anti-anti-músculo liso alfa</td></tr><tr><td>Anti-Alpha Muscle [1A4]</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Manchas vasos sanguíneos</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Colágeno I</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td>Manchas colágeno</td></tr><tr><td>Anticuerpo Anti-Citoqueratina 14 [LL002]</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td>Manchas epidermis</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD1A (CTB6)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5265</td><td>Tinciones Células de Langerhans</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>Contratinción para núcleos celulares</td></tr><tr><td>Falcon Placas de Petri de 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>Cultivo ex vivo humano</td></tr><tr><td>Fibronectina Anticuerpo (EP5)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8422</td><td>Manchas fibronectina</td></tr><tr><td>Formaldehído, Extra Puro, Solución 37-41%, SLR</td><td>Fisher Chemical</td><td>F/1501/PB17</td><td>Parte de fijador</td></tr><tr><td>Hisopos de gasa</td><td>Medisave</td><td>CS1650</td><td>Para limpiar la piel</td></tr><tr><td>Gibco&trade; Solución antibiótica-antimicótica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Cultivo humano ex vivo</td></tr><tr><td>Gibco DMEM, alto en glucosa, sin glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960044</td><td>Cultivo humano ex vivo</td></tr><tr><td>Gibco Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>Cultivo humano ex vivo</td></tr><tr><td>Gibco HBSS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170088</td><td>Cultivo humano ex vivo</td></tr><tr><td>Gibco L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Cultivo humano ex vivo</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><<td>em>Para la tinción de inmunoperoxidasa</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>Institutos Nacionales de Salud</td><td>N/A</td><td>Para el análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>El anticuerpo secundario utilizado depende de los fluorocromos requeridos y el anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Invitrogen IgG (H+L) Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>El anticuerpo secundario utilizado depende de los fluorocromos necesarios y del anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Invitrogen LIVE/DEAD Kit de viabilidad/citotoxicidad, para células de mamíferos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td>Para la evaluación de la viabilidad de los tejidos</td></tr><tr><td>Iris Pinzas, 10 cm, curvadas, dientes 1x2</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td>Para crear heridas</td></tr><tr><td>Tijeras Iris, 11 cm, Curvas, SuperCut, Carburo de Tungsteno</td><td>World Precision Instruments</td><td>501264</td><td>Para crear heridas</td></tr><tr><td>Tijeras de iris, 11 cm, Rectas, SuperCut, Carburo de tungsteno</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td>Para eliminar el tejido adiposo</td></tr><tr><td>Queratina 1 Anticuerpo policlonal, purificado</td><td>Biolegend</td><td>905201</td><td>Manchas epidermis</td></tr><tr><td>Queratina 14 Anticuerpo policlonal, Biolegend purificado</td><td></td><td>905301</td><td>Manchas epidermis</td></tr><tr><td>LSM 710 Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>Descontinuado</td><td>Para imágenes fluorescentes</td></tr><tr><td>Merck Millipore Almohadillas absorbentes</td><td>Merck Millipore</td><td>AP10045S0</td><td>Human ex vivo culture</td></tr><tr><td>Merck Millipore Nylon Filtros de membrana hidrofílica</td><td>Merck Millipore</td><td>HNWP04700</td><td>Humano ex vivo cultivo</td></tr><tr><td>Normal Solución de suero de cabra</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td>El suero animal utilizado depende de los anticuerpos secundarios</td></tr><tr><td>Solución tampón de fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>Para tampón de lavado</td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Para bloqueo tampón</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td>Parte de las bolsas de esterilización fijadoras</td></tr><tr><td></td><td>Medisave</td><td>SH3710</td><td>Para esterilizar instrumentos</td></tr><tr><td>Stiefel Punzones de biopsia de 2 mm</td><td>Medisave</td><td>BI0500</td><td>Para heridas de espesor parcial</td></tr><tr><td>Stiefel Punzones de biopsia de 6 mm</td><td>Medisave</td><td>BI2000</td><td>Para explante exterior</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm Placas de Petri Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>101VR20</td><td>Para preparar piel</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Chemical</td><td>T/3751/08</td><td>Para tampón de lavado</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroxidasa (IgG de conejo)</td><td>Vector Laboratorios</td><td>PK-6101</td><td>Para la tinción con inmunoperoxidasa; El kit HRP utilizado depende del anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Vector NovaRED Substrate Kit, Peroxidasa (HRP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4800</td><td>Para tinción de inmunoperoxidasa</td></tr><tr><td>Microscopio digital inalámbrico</td><td>Jiusion</td><td>N/A</td><td>Para imágenes de campo claro</td></tr></tbody></table>

modelo de herida humana ex vivo y enfoque de tinción de montaje completo para evaluar con precisión la reparación de la piel

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Las heridas crónicas que no cicatrizan, que afectan principalmente a los ancianos y diabéticos, son un área importante de necesidad clínica insatisfecha. Desafortunadamente, los tratamientos actuales para heridas crónicas son inadecuados, mientras que los modelos preclínicos disponibles predicen mal la eficacia clínica de las nuevas terapias. Aquí describimos un modelo preclínico de alto rendimiento para evaluar múltiples aspectos de la respuesta de reparación de la piel humana. Las heridas de espesor parcial se crearon en la piel humana ex vivo y se cultivaron a lo largo de un curso de tiempo de curación. Las biopsias de heridas de piel se recogieron en fijador para el procedimiento de tinción de montaje completo. Las muestras fijas se bloquearon y se incubaron en anticuerpos primarios, con la detección lograda a través de anticuerpos secundarios conjugados fluorescentemente. Las heridas se contrateñeron y se realizaron imágenes mediante microscopía confocal antes de calcular el porcentaje de cierre de la herida (reepilecialización) en cada biopsia. Aplicando este protocolo, revelamos que las heridas por escisión de 2 mm creadas en la piel sana del donante se reepitelizan completamente en el día 4-5 después de la herida. Por el contrario, las tasas de cierre de las heridas de la piel diabética se reducen significativamente, acompañadas de una reforma de barrera perturbada. La combinación de heridas en la piel humana con un novedoso enfoque de tinción de montaje completo permite un método rápido y reproducible para cuantificar la reparación de heridas ex vivo. En conjunto, este protocolo proporciona una valiosa plataforma humana para evaluar la efectividad de las posibles terapias de heridas, transformando las pruebas preclínicas y la validación.

En este informe, presentamos un nuevo enfoque ex vivo de heridas cutáneas y tinción de montaje completo para evaluar los factores que influyen en la respuesta de reparación de la piel humana. La Figura 1A muestra un esquema de la tubería de procedimiento, que se puede realizar en 3-10 días, dependiendo de los tiempos de incubación de la herida. Las heridas de espesor parcial se cultivan en pilas de membrana en el aire: interfaz de membrana y se pueden recolectar para tinción de montaje completo, incrustarse en parafina o medio OCT para histología general, o congelarse en nitrógeno líquido para análisis bioquímico(Figura 1B). Generalmente creamos heridas de espesor parcial de 2 mm dentro del centro de explantes de 6 mm. Sin embargo, el tamaño de la herida y el explante circundante pueden alterarse según los requisitos. El procedimiento de montaje completo se ha adaptado con éxito para los métodos de tinción de inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia(Figura 1C).
La inmunofluorescencia permite el sondeo de tejido con múltiples anticuerpos. Para ello, aconsejamos el uso de anticuerpos primarios criados en diferentes especies, y anticuerpos secundarios conjugados fluorescentemente compatibles con especies para limitar la reactividad entre especies. Las concentraciones de anticuerpos y los tiempos de incubación deberán optimizarse. Si se observa tinción de fondo, reduzca las concentraciones de anticuerpos, aumente los pasos de lavado y agregue un tampón de bloqueo al anticuerpo secundario. La viabilidad de los tejidos frescos se puede evaluar directamente con colorantes de viabilidad comercial (ver Tabla de Materiales). También mostramos que el tejido puede fijarse después de la tinción de viabilidad y obtener una imagen exitosa cuando es prácticamente adecuado (Figura 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg"> Figura 1: El enfoque de la herida humana ex vivo y la tinción de montaje completo. (A) Pipeline que representa el flujo de trabajo de procedimiento desde la recolección de piel y la realización de heridas ex vivo, hasta la tinción de tejidos y el análisis de datos. (B) Diagrama que demuestra el sistema de cultivo de heridas de piel humana ex vivo con análisis realizados rutinariamente en el tejido. (C) La tinción de montaje completo puede emplearse utilizando técnicas de inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia. K14 = queratina 14. (D) El tejido vivo puede teñirse con tintes de viabilidad comercial y obtener imágenes con éxito después de la fijación. Bar = 100 μm. Esta tinción se realizó en pieles no diabéticas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El uso más ampliamente aplicable para la tinción de heridas en todo el montaje es determinar la tasa de cierre de la herida de una manera más reproducible que la que se puede proporcionar a través de la sección histológica. El porcentaje de cierre se cuantificó como porcentaje de reepilecialización de la superficie de la herida, como se demuestra en la Figura 2A. El porcentaje de cobertura de área de marcadores específicos se puede medir a partir del área total de la herida o como un porcentaje de la herida reepilecializada. Caracterizamos la cicatrización en piel sana (no diabética) versus diabética a lo largo de un curso de siete días, recogiendo heridas en cada día después de la herida (imágenes representativas, Figura 2B). Las heridas cutáneas sanas se cerraron con el tiempo como se esperaba, con un cierre total observado en la mayoría de las muestras para el día 4-5. Por el contrario, las heridas de la piel diabética no se cerraron completamente dentro del período de análisis de siete días(Figura 2C). Se observó un retraso significativo en el cierre de la herida entre las heridas cutáneas sanas y diabéticas al comparar las tasas de cicatrización en cada punto de tiempo posterior a la lesión(P &lt; 0,001 al día 6, P &lt; 0,05 al día 6 y P &lt; 0,05 a P &lt; 0,001 al día 7).
Después de la evaluación de las tasas generales de cierre de heridas; medimos el porcentaje de toda el área de la herida (área externa en la Figura 2A)donde se pudieron visualizar las células K14 positivas (tinción verde en la Figura 2B). Curiosamente, observamos que en heridas cutáneas sanas ex vivo, la tinción de K14 alcanzó su punto máximo en el día 2 y luego disminuyó rápidamente (importancia en cada punto de tiempo frente al pico del día 2, Figura 2D). Es probable que esto refleje la re-formación de la barrera epidérmica temprana, excluyendo la penetración de anticuerpos K14 a través de capas epidérmicas diferenciadas (ver Esquema de la Figura 2E). Durante el proceso de reepiltelización, los queratinocitos de la capa basal (K14 + ve) migran hacia adentro sobre la herida abierta de tal manera que la epidermis más cercana al borde externo de la herida se forma antes que la epidermis más cerca del borde interno de la herida (frente migratorio). Mientras que el borde frontal de la epidermis recién formada continúa migrando para cerrar la herida abierta restante, la epidermis del borde externo comienza a diferenciarse para reformar las otras capas epidérmicas. En la curación temprana, esperaríamos ver que la mayor parte del área reepiltelizada consiste en células basales (K14 + ve), mientras que en la reparación posterior se pierde la tinción de K14 a medida que la epidermis se diferencia del exterior hacia adentro (ver imágenes de montura completa en la Figura 2E). Por lo tanto, la disminución en la tinción de K14 que se muestra en la Figura 2D (flechas hacia abajo) se correlaciona con una mayor diferenciación epidérmica. Curiosamente, la tinción visible de K14 alcanzó su punto máximo más temprano en heridas sanas (día 2) versus diabéticas (día 4), lo que demuestra aún más que la reepilecialización y la posterior diferenciación epidérmica se retrasan en las heridas de la piel diabética.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg"> Figura 2:La tinción de montaje completo revela tasas de curación perturbadas en la piel diabética frente a la sana. (A) El método utilizado para cuantificar el cierre de la herida a partir de las mediciones externas e internas de la herida. Las imágenes de Campo Brillante muestran queratina 14 (K14) se tiñe en rojo. Bar = 300 μm. (B) Imágenes representativas de la cicatrización a lo largo del tiempo (día post-herida) en piel sana y diabética. Bar = 500 μm. K14 = verde. DAPI = núcleos azules. (C) Cuantificación de las tasas de cierre de heridas (porcentaje de reepilecialización) que muestra que las heridas ex vivo de piel sana se cierran significativamente más rápido que las heridas ex vivo de piel diabética. H = saludable. Db = diabético. (D) El porcentaje de tinción K14 alcanza su punto máximo antes en la piel sana frente a la diabética y luego disminuye en línea con el aumento de la diferenciación epidérmica (flechas hacia abajo). (E) La tinción K14 (célula epidérmica basal) se pierde a medida que la epidermis se diferencia. D = diferenciado. ND = no diferenciado. Las líneas punteadas blancas representan los bordes internos y externos de la herida. Flechas blancas = dirección de la migración. n = 6 heridas por donante, por punto de tiempo. Media +/- SEM. * = P &lt; 0,05, ** = P &lt; 0,01 y *** = P &lt; 0,001. Sanos y diabéticos comparados en cada punto de tiempo de curación en C (valorde P para la comparación menos significativa). Cambio temporal en la tinción de K14 en comparación con el pico para cada donante en D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
A continuación, utilizamos la tinción de montaje completo para explorar la expresión tisular y la localización de otros marcadores relevantes para la herida en pieles no diabéticas(Figura 3). Todos los anticuerpos utilizados y sus concentraciones de trabajo se proporcionan en la Tabla de Materiales. Los vasos sanguíneos en la herida abierta se tiñen positivamente con el anticuerpo de actina del músculo liso alfa (a-SMA), utilizado en combinación con K14 para delinear los bordes epidérmicos en imágenes de menor potencia(Figura 3A). La matriz dérmica se tiñó con anticuerpos contra colágeno tipo I (COL 1) y fibronectina (Fn). Aquí se observó que el colágeno era abundante en fibras gruesas, mientras que las fibras de fibronectina eran escasas, onduladas ydelgadas (Figura 3A). Nuestro enfoque de tinción de montaje completo también es capaz de proporcionar resolución de tinción a nivel celular, como se ha demostrado para los queratinocitos K14 positivos(Figura 3B).
Finalmente, mostramos que las heridas humanas ex vivo poseen células inmunes residentes, con células de Langerhans detectadas alrededor de la epidermis recién formada en el día 3 después de la herida(Figura 3C). De hecho, estos resultados sugieren que la tinción de montaje completo puede usarse para investigar las características clave de la respuesta de curación, incluida la inflamación, la proliferación y la matriz extracelular(Figura 4A). Tomados en conjunto, nuestros datos revelan que el procedimiento combinado de heridas cutáneas ex vivo y tinción de montaje completo es un método válido para evaluar varios aspectos de la reparación de la piel humana sana y diabética (patológica).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg"> Figura 3: Optimización del enfoque de tinción de montaje completo para su uso con otros anticuerpos. (A) Los vasos sanguíneos se tiñeron con actina alfa del músculo liso (α-SMA, verde) y queratina 14 (K14, rojo), mientras que las fibras de la matriz se tiñeron con colágeno I (COL 1, rojo) y fibronectina (Fn, verde). (B) El procedimiento de montaje completo proporciona una resolución de localización hasta el nivel de celda (K14, verde; K1, rojo). (C) Células de Langerhans CD1a+ve (verdes) observadas en la epidermis recién formada. DAPI = núcleos azules. Bar = 100 μm. Las líneas punteadas blancas muestran los bordes internos y externos de la herida y separan la herida de la epidermis. Esta tinción se realizó en pieles no diabéticas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg"> Figura 4: Validez del procedimiento de tinción de montaje completo para evaluar la cicatrización de heridas. (A) Ilustración que representa cómo la técnica de tinción de montaje completo puede evaluar los procesos relevantes para la herida. Anticuerpos utilizados = texto rojo. K14 = queratina 14. COL 1 = colágeno 1. Fn = fibronectina. (B) El procedimiento de tinción de montaje completo (flechas azules) introduce menos variabilidad en las mediciones de cierre de heridas que el análisis histológico estándar (flechas rojas). S1 = sección 1. WE = borde de la herida. Barra = 300 μm. Esta tinción se realizó en pieles no diabéticas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí demostramos una técnica optimizada para evaluar la reparación de heridas utilizando piel humana ex vivo combinada con un enfoque de tinción de montaje completo. Esta metodología proporciona una plataforma preclínica para la evaluación de posibles terapias de heridas.

Modelo de herida humana ex vivo y enfoque de tinción de montaje completo para evaluar con precisión la reparación de la piel

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

En este artículo, presentamos un protocolo optimizado ex vivo de heridas en la piel humana que puede proporcionar datos importantes de eficacia como parte de una línea de traducción clínica. La principal ventaja de esta técnica es que permite una evaluación precisa de alto rendimiento de la reparación de heridas en la piel humana viva. La demostración del procedimiento estará a favor elizabeth Roberts, investigadora postdoctoral, y Alexandria Kidd, asistente de investigación de nuestro laboratorio.Para preparar una muestra de tejido cutáneo para la herida, coloque la dermis de la piel hacia abajo en una placa de Petri de 90 milímetros y use tijeras estériles para eliminar el tejido adiposo. Cuando se haya eliminado toda la grasa, coloque la piel en 25 mililitros de HBSS suplementada con antibióticos durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación intermitente para eliminar cualquier sangre residual en el tejido adiposo. Después de 10 minutos, enjuague la piel en 25 mililitros de DPBS.Después de 10 minutos, repita el enjuague HBSS sin antibióticos y luego realice un enjuague final en 25 mililitros de DPBS. Luego coloque una membrana de filtro de nylon estéril en la pila de almohadillas absorbentes y seque el lado dérmico de la piel en una gasa estéril en una placa de Petri de 90 milímetros para eliminar el DPBS residual. Coloque la dermis de la piel seca boca abajo en una tapa limpia de placa de Petri de 90 milímetros para eliminar cualquier DPBS residual y seque la epidermis con una gasa estéril fresca.Para crear una herida, presione un punzón de biopsia de dos milímetros contra la piel mientras mantiene la piel firme y se retuerce suavemente. Usando unas fórceps curvas de tejido dentado, recoja cada lado de la herida de aproximadamente dos milímetros de diámetro y enganche las tijeras curvas iris debajo de la herida. Use una punción de biopsia de seis milímetros para biopsiar alrededor de la herida central de dos milímetros para crear un explante de seis milímetros con un grosor parcial de dos milímetros de herida en el centro.Luego, coloque la epidermis de explante de la herida hacia arriba en la pila de membrana del filtro de nylon para una incubación de uno a siete días a 32 a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Para la tinción fluorescente, recoja los explantes de la herida en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan 500 microlitros de fijador de la piel por tubo e incube los explantes durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, reemplace el fijador con un mililitro de tampón de lavado de manchas.Después del lavado, cubra cada muestra con aproximadamente 150 microlitros de tampón de bloqueo e incube durante una hora a temperatura ambiente. Después de retirar el tampón de bloqueo, agregue 150 microlitros de anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo por tubo e incube los explantes de la herida durante la noche a cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, enjuague las muestras con 500 microlitros de tampón de lavado de tinción que contenga azida de 0.2% de sodio seguido de tres enjuagues en tampón de lavado regular.Después del lavado, agregue 150 microlitros de un anticuerpo secundario conjugado con florescencia apropiado diluido en tampón de lavado de tinción a cada pozo durante una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, enjuague el explante tres veces durante 30 minutos en 500 microlitros de tampón de lavado de tinción por lavado antes de contramantar cada explante con 150 microlitros de DAPI durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, lave el explante dos veces durante 30 minutos con 500 microlitros de tampón de lavado por lavado.Para obtener imágenes de explante, coloque una placa de Petri de 60 milímetros en la plataforma de imágenes de un microscopio confocal y agregue una capa de aproximadamente un mililitro de DPBS a la placa. Use forrcepciones para transferir los explantes de la herida al plato. Después de configurar el software de imágenes según corresponda para el experimento, coloque la herida en el centro del plano de imágenes y adquiera imágenes de las biopsias de la herida.Para realizar imágenes de microscopio digital inalámbrico para obtener imágenes de alta calidad de una manera rentable, conecte un teléfono o computadora portátil a un microscopio digital inalámbrico. Coloque los explantes enrollados de lado hacia arriba sobre un pedazo de tejido de laboratorio y retire cualquier tampón de lavado residual de la muestra. A continuación, coloque el explante en el centro del campo de visión del microscopio y adquiera imágenes utilizando la cámara conectada.La inmunoperoxidasa y la inmunofluorescencia se pueden usar para la tinción de tejido de montaje completo. Además, la tinción viva / muerta se puede realizar en tejido fresco y obtener imágenes antes o después de la fijación. La tinción de montura completa de las heridas se puede utilizar para determinar las tasas de cierre de la herida de una manera reproducible.En este análisis representativo, se observó un cierre de la herida cutánea sana después de cuatro a cinco días, mientras que las heridas cutáneas diabéticas no se cerraron por completo dentro del período de análisis de siete días. La expresión de K14 alcanzó su punto máximo en el segundo día en heridas cutáneas sanas antes de disminuir rápidamente con una mayor diferenciación epidérmica. Esta reepilecialización y posterior diferenciación epidérmica se retrasó en las heridas cutáneas diabéticas.La reforma de la barrera epidérmica temprana excluye la penetración de anticuerpos K14 dentro de las capas epidérmicas diferenciadas. Al principio del proceso de reepilialización, los queratinocitos de capa basal K14 positivos migran hacia adentro sobre la herida abierta, de modo que la epidermis más cercana al borde externo de la herida se forma antes que la epidermis más cerca del borde interno de la herida. Más adelante en la etapa de reparación, la tinción de K14 se pierde a medida que la epidermis se diferencia del exterior hacia adentro.La tinción de montura entera también se puede utilizar para estudiar la expresión y localización de otros marcadores relevantes de la herida en la piel, así como la presencia de células inmunes de interés en el sitio de la herida en diferentes etapas de curación. Generar heridas por escisión reproducibles puede ser un desafío al principio. Aconsejamos practicar el procedimiento de herida utilizando el excedente de piel.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La vascularización es clave para enfoques en la ingeniería de tejidos éxito. Por lo tanto, se requieren tecnologías fiables para evaluar el desarrollo de las redes vasculares en los tejidos-construcciones. Aquí presentamos un método simple y rentable para visualizar y cuantificar la vascularización in vivo.

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Durante el desarrollo de los mamíferos, las heridas tempranas de la piel durante la gestación se curan sin cicatriz. Aquí detallamos un modelo fiable y reproducible de cicatrización de heridas fetales sin cicatrices en el dorso cutáneo de embriones de ratón E16.5 (sin cicatrices) y E18.5 (cicatrizantes).

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Aquí se describe el establecimiento de un modelo de cirugía de catarata simulada ex vivo clínicamente relevante que se puede utilizar para investigar los mecanismos de la respuesta a la lesión de los tejidos epiteliales dentro de su microambiente nativo.

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Describimos una invasiva en vivo imagen protocolo que es sencilla y económica, utilizando L-012, un análogo de quimioluminiscente luminol, para visualizar y cuantificar las especies de oxígeno reactivo (ROS) generadas en un modelo de ratón por escisión de la herida.

En Vivo Proyección de imagen de especies reactivas de oxígeno en un murino herida modelo

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de arañazos in vitro utilizando fibroblastos primarios y para un ensayo de cicatrización de heridas de piel in vivo en ratones. Ambos ensayos son métodos sencillos para evaluar la cicatrización in vitro e in vivo de heridas.

Ensayo de migración de arañazos y cámara dorsal Skinfold para análisis In Vitro e In Vivo de sanación de heridas

Aquí, se describen dos modelos de cicatrización de heridas murinas, uno diseñado para evaluar las respuestas de cicatrización de heridas celulares y citoquinas y el otro para cuantificar la tasa de cierre de heridas. Estos métodos se pueden utilizar con modelos de enfermedades complejas como la diabetes para determinar los mecanismos de varios aspectos de la cicatrización deficiente de heridas.

Evaluación de la cicatrización aguda de heridas utilizando los modelos de esponja de alcohol de polivinilo subcutáneo dorsal y modelos de herida sin piel de cola excisional.

El objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo murino de cicatrización de la quemadura. Se indujo una quemadura térmica en la piel dorsal de los ratones utilizando una plantilla de latón precalentada. El tejido quemado fue desbridado y superpuesto con un injerto de piel cosechado de la cola de un ratón donante genéticamente similar.

Un modelo murino de una herida de quemadura reconstruida con un injerto de piel alogénico

Este protocolo describe cómo generar heridas de escisión bilaterales de espesor completo en ratones y cómo monitorear, cosechar y preparar las heridas para el análisis morfométrico. Se incluye una descripción detallada de cómo utilizar secciones histológicas seriales para definir, cuantificar y detectar defectos morfométricos con precisión.

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Se describe un modelo de herida cutánea de rata que permite la evaluación de diversos agentes terapéuticos bajo condiciones fisiológicas o patológicas a lo largo de las distintas etapas del proceso de curación. Además, se detalla un protocolo para realizar planimetría manual que monitorize la tasa de contracción de la herida durante la reparación tisular.

Un modelo de herida cutánea quirúrgica de rata: un enfoque para estudios de cicatrización de heridas y evaluación de biomateriales

Aprende un protocolo ex vivo de heridas en piel humana para evaluar la reparación cutánea con alta precisión. Este método permite comparar la cicatrización entre piel sana y diabética mediante tinción de montaje completo.

Modelo de herida humana ex vivo y enfoque de tinción de montaje completo para evaluar con precisión la reparación de la piel

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