Name: Aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino para el análisis de expresión génica y proteica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Aprende a aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino mediante digestión enzimática y separación con iodixanol al 6%. Este protocolo permite análisis precisos de expresión génica y proteica sin contaminación celular.

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Z. Lin fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud HL138454-01 y los fondos del Instituto de Investigación Médica Masónica.

Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Investigación Médica Masónica (IACUC). UCP1::Cre9 y Rosa 26tdTomato ratones líneas13 fueron reportados previamente. Todos los ratones se mantuvieron a temperatura ambiente con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
1. Preparación de las soluciones y el tejido adiposo marrón (MTD)
<ol><li>Prepare la solución de digestión y la solución de separación en tubos centrífugos de 15 ml.</li>
	<li>10 ml de solución de digestión BAT: Para 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS), agregue 3,5 mg/ml de dispasa II, 1 mg/ml de colagenasa II y 10 mM de CaCl2 para hacer una solución de digestión BAT.</li>
	<li>10 ml de solución de iodixanol al 12% (solución de separación): Mezclar 1 mL de 10x PBS, 2 mL de iodixanol al 60%, 0.01 mL de 1 M MgCl 2, 0.025 mL de 1 M KCl, 0.1 mL de ácido etilendiaminotetraacético0.2 M (EDTA) y 6.865 mL de ddH2O para obtener12% de iodixanol.</li>
	<li>Eutanasia a un ratón adulto con sobredosis deCO2 . Brevemente, llene la jaula del ratón con 100% deCO2 a una tasa de desplazamiento del 10-30% de volumen de la jaula por minuto. 5 minutos más tarde, confirme la muerte verificando la ausencia de respiración visible.</li>
	<li>Diseccionar al animal y recoger las MTD interescapulares. Retire WAT y las capas musculares bajo un microscopio estéreo.</li>
	<li>Para tener suficiente digestión, cortar cada lóbulo BAT en ~ 3 mm3 partes y colocarlos en un matraz limpio de 50 ml con una barra de agitación de metal y una solución de digestión de 5 ml. Antes de comenzar la digestión, deje reposar sobre hielo el matraz que contiene MTD y tampón de digestión. NOTA: En los siguientes pasos, se utilizaron alrededor de 80 mg de BAT para el aislamiento de adipocitos marrones.</li>
</ol>2. Procedimiento de aislamiento de BA
<ol><li>Coloque el matraz en un agitador magnético que esté encerrado en una incubadora. Ajuste la velocidad de agitación a 60 rpm y la temperatura de la incubadora a 35 °C, respectivamente. La digestión durará alrededor de 30 minutos. Si las rodajas BAT forman grupos alrededor de la barra de agitación durante la digestión, use una punta de pipeta de 1 ml para interrumpir los tejidos agregados.</li>
	<li>Coloque un filtro filtrador de 70 μm encima de un tubo de centrífuga limpio de 50 ml. Pipetear alrededor de 4 ml de suspensión celular a través del filtro. Lave el colador con 4 ml de solución de iodixanol al 12%. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar las células y la solución de iodixanol. Transfiera la mezcla celular a dos tubos de ensayo de poliestireno transparente de 5 ml. NOTA: Al final de la digestión, la solución de digestión debe estar turbia, lo que indica suficiente digestión. Use una solución de digestión fresca cada vez. Una vez preparada, la solución de digestión debe usarse dentro de las 2 h.</li>
	<li>Repita los pasos 2.2 y 2.3 una vez más si la digestión no es suficiente.</li>
	<li>Dejar los tubos de poliestireno transparente que contienen la solución de separación y los BA en hielo durante 1 h. Los BA formarán una capa en la parte superior.</li>
	<li>Saque 20 μL de los BA aislados para examinarlos con microscopio.</li>
</ol>3. Aislamiento de ARN y proteínas de BA
<ol><li>Pipetear la capa de BA en dos tubos de microcentrífuga de 1,7 ml para el aislamiento de ARN y proteínas. Retire con cuidado la solución excesiva de iodixanol sin interrumpir la capa de BAs.</li>
	<li>Agregue 1 ml de Trizol para aislar simultáneamente el ARN, el ADN y la proteína en la solución celular. Mezclar lo suficiente para lisar las células.</li>
	<li>Añadir 200 μL de cloroformo para separar las fases.</li>
	<li>Centrifugar el tubo durante 9.981 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Después de la centrifugación, use la fase acuosa para el aislamiento de ARN. En este estudio, se utilizó ARN total para la transcripción inversa y se realizó RT-PCR cuantitativa con PCR en tiempo real. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla de materiales.</li>
	<li>Transfiera 300 μL de la fase orgánica a un tubo de microcentrífuga de 2 ml.</li>
	<li>A la fase orgánica, agregue 2.5 volumen 100% etanol y vórtice durante 10 s.</li>
	<li>Añadir 200 μL de 1-Bromo-3-cloropropano y vórtice durante 10 s.</li>
	<li>Añadir 600 μL de agua destilada doble y vórtice durante 10 s.</li>
	<li>Deje reposar la solución mezclada durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugar a 9.981 x g durante 10 min a 4 °C. En este paso, las fases se separarán. La fase proteica se localiza en la capa media.</li>
	<li>Retire la solución acuosa superior. Agregue 1 ml de etanol 100% en la solución restante.</li>
	<li>Centrífuga durante 10 min, 9,981 x g, 4 °C. Después de la centrifugación, se formará el pellet de proteína. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Lave el pellet con 1 mL 100% etanol.</li>
	<li>Centrífuga durante 10 min, 9981 x g, 4 °C. Guarde el pellet y deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Secar al aire el pellet durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mida el peso del pellet húmedo. Añadir una solución de SDS al 1% en una proporción de 20 μL/mg de pellet.</li>
	<li>Disuelva el pellet colocando el tubo en una coctelera caliente. Ajuste la temperatura a 55 °C y la velocidad a 11 x g. Por lo general, se tarda de 5 a 10 minutos en disolver completamente el pellet de proteína. NOTA: La concentración de la proteína disuelta puede medirse mediante el ensayo BCA14.</li>
</ol>

<ol><li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological%2C+and+functional+diversity+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li>
<li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).</li>
<li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White%2C+brown%2C+beige%2Fbrite%3A+Different+adipose+cells+for+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li>
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<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li>
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<li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodixanol%3A+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li>
<li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+%28OptiPrep%29+density+gradient-based+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674(2019).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li>
<li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELi+protocol%3A+Optimization+for+protein+extraction+from+white%2C+brown%2C+and+beige+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li>
<li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+Review%3A+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li>
<li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li>
</ol>

En este estudio, se desarrolló un nuevo método para aislar BA para el análisis de expresión génica y proteica.
En un protocolo de aislamiento de BA publicado, se utilizó una solución BSA al 3% para enriquecer los BA12. Sin embargo, los BA enriquecidos logrados por este protocolo publicado no pudieron usarse directamente para el análisis de expresión de proteínas. Esto se debe a que la BSA concentrada existente en la solución de BA interfiere con la extracción de proteín...

Tanto los ratones como los humanos tienen dos tipos de tejidos adiposos: tejido adiposo blanco (WAT) y tejido adiposo marrón (BAT)1. WAT almacena energía en forma de triglicéridos en los adipocitos blancos, y los adipocitos marrones (BA) de BAT disipan la energía química en forma de calor2. Según su origen en el desarrollo, los BA se clasifican en BA clásicos (cBA) que se formaron durante el desarrollo embrionario y BA derivados de adipocitos blancos (células beige / brite, convertidas de adipocitos blancos en condiciones de estrés)3. Los BA son multiloculares y expresan la proteína termogénica de desacoplamiento 1 (UCP1)4. El depósito interescapular de BAT (iBAT) es uno de los principales depósitos de cBA en pequeños mamíferos5, mientras que las células beige se dispersan dentro de WAT6. 
Debido a su naturaleza de disipación de energía, los BA han recibido mucha atención como una diana terapéutica para reducir la obesidad7. Para explotar los BA con el propósito de tratar la obesidad, es esencial comprender los mecanismos moleculares que controlan la función, la supervivencia y el reclutamiento de los BA. Los tejidos adiposos, incluidos BAT y WAT, son heterogéneos. A excepción de los adipocitos, los tejidos adiposos contienen muchos otros tipos de células, como las células endoteliales, las células madre mesenquimales y los macrófagos8. Aunque existen herramientas genéticas para agotar específicamente los genes candidatos en ratones BA, como UCP1::Cre línea9, las técnicas para purificar BAT o WAT son limitadas, lo que dificulta el estudio de BA a nivel de tipo unicelular. Además, sin obtener BA puros, la relación entre BA y no BA no estará claramente delineada. Por ejemplo, el receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) se ha utilizado como marcador para células mesenquimales indiferenciadas, y se expresa en las células endoteliales e intersticiales de BAT. En las MTD estresadas por frío, las células progenitoras PDGFRα positivas dan lugar a nuevas BAs10. PDGFRα es activado por su ligando PDGF, un factor de crecimiento que regula el crecimiento y la proliferación de células mesenquimales11; sin embargo, no está claro si las BA influyen en el comportamiento de las células progenitoras PDGFRα positivas mediante la secreción de PDGF. 
Recientemente, se ha publicado un protocolo de aislamiento de BAs, que se basa en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)12. En este protocolo, se utilizó una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 3% para separar los BA de los no BA, y los BA enriquecidos se purificaron aún más mediante FACS. La aplicación de este protocolo está limitada por el requisito del proceso FACS, que se basa tanto en el equipo como en las experiencias de operación del FACS. En este estudio, se desarrolló un nuevo protocolo para aislar los BAT de las MTD. Los BA aislados por este protocolo se pueden utilizar directamente para estudios de expresión génica y proteica. Además, los datos de este estudio sugieren que los BA son un recurso importante de PDGF.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Antígeno</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Catálogo</fuerte></td><td></td></tr><tr><td>PPAR&gamma;</td><td>LSBio</td><td>Ls-C368478</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRa</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-398206</td><td></td></tr><tr><td>UCP1</td><td>R& Sistema D</td><td>IC6158P</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Químico y soluciones</colagenas>a fuerte</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Tipo II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>1-bromo-3-cloropropano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B62404</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)&nbsp;</td><td>Goldbio</td><td>A-421-10</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Bio Basic</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05040</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II, proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5693</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>EB0107</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>IBI Scientific IB15724</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td><td>LifeSct</td><td>LS01131905Y</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de Magnesio Hexahidratado</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-855</td><td></td></tr><tr><td>OneScrip Plus Síntesis de ADNc SuperMix</td><td>ABM</td><td>G454</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (Iodixanol)</td><td>Cosmo Bio USA</td><td>AXS-1114542</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL07</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-1435</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue safe Stain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo Trizol</td><td>Tecnologías de la vida</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>PrimersNombre del</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>gen (Especie)&nbsp;</td><td>Avance</td><td>inverso</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfra (ratón)</td><td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td><td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfa (ratón)</td><td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td><td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td><td></td></tr><tr><td>36B4(ratón)</td><td>TGCTGAACATCCCCCCCTTCTC</td><td>TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td><td></td></tr><tr><td>ucp1</td><td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td><td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td><td></td></tr><<tr><td> strong>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Aplicación</fuerte></td><td></td></tr><tr><td>Keyence BZ-X700</td><td>Keyence</td><td>Imaging adipocitos</td><td></td>marrones</tr><tr><td>Agitador magnético</td><td></td><td>VWR Disociate BAT</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR en tiempo real QuantStudio 6 Flex</td><td>aplicado Biosystem</td><td>Quantitative PCR</td><td></td></tr><tr><td>The Odyssey Fc Sistema de imagen</td><td>LI-COR</td><td>Western blot immaging</td><td></td></tr></tbody></table>

aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino para el análisis de expresión génica y proteica

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

El tejido adiposo marrón (BAT) es responsable de la termogénesis sin temblores en los mamíferos, y los adipocitos marrones (BA) son las unidades funcionales de BAT. Las BA contienen gotitas lipídicas multiloculares y abundantes mitocondrias, y expresan la proteína de desacoplamiento 1 (UCP1). Los BA se clasifican en dos subtipos según su origen: BA clásicos derivados de embriones (cBA) y BA derivados de adipocitos blancos. Debido a su densidad relativamente baja, los BA no pueden aislarse de las MTD con el método de centrifugación tradicional. En este estudio, se desarrolló un nuevo método para aislar BA de ratones para el análisis de expresión génica y proteica. En este protocolo, el BAT interescapular de ratones adultos se digirió con solución de colagenasa y dispase, y los BA disociados se enriquecieron con solución de iodixanol al 6%. Los BA aislados se lisaron con el reactivo Trizol para el aislamiento simultáneo de ARN, ADN y proteína. Después del aislamiento del ARN, la fase orgánica del lisado se utilizó para la extracción de proteínas. Nuestros datos mostraron que la solución de iodixanol al 6% enriqueció eficientemente los BA sin interferir con los estudios de seguimiento de expresión génica y proteica. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es un factor de crecimiento que regula el crecimiento y la proliferación de células mesenquimales. En comparación con el tejido adiposo marrón, los BA aislados tenían una expresión significativamente mayor de Pdgfa. En resumen, este nuevo método proporciona una plataforma para estudiar la biología de los adipocitos marrones a nivel de tipo celular único.

Preparación de MTD interacapular para el aislamiento de adipocitos marrones El proceso de aislamiento de los adipocitos marrones (BA) se muestra en la Figura 1A. Todo el proceso, desde la preparación de las MTD y las soluciones de digestión/separación hasta la obtención de BA aislados, tomará alrededor de 4 h.
En ratones adultos, existe abundante BAT en la región interescapular. Este BAT interescapular (iBAT) está cubierto por capas musculares ...

Este estudio describe un nuevo método para aislar adipocitos marrones murinos para el análisis de expresión génica y proteica.

Aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino para el análisis de expresión génica y proteica

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Para investigar los aspectos biológicos del tejido adiposo marrón, es esencial eliminar el tamaño adiposo marrón purificado. Actualmente no viene en purificación de tamaño adiposo marrón y las masas están disponibles. En este estudio, desarrollamos un protocolo sencillo para abordar este problema.Ahora, se requieren habilidades para este protocolo. Necesita muchos menos materiales de estudio que otros métodos y el tamaño adiposo marrón purificado se puede utilizar directamente para el análisis de expresión génica y proteica. Este protocolo proporciona un nuevo método para estudiar la biología del tamaño adiposo marrón clásico.También se puede aplicar para estudiar el proceso de pardeamiento de los adipocitos blancos. Demostrando el procedimiento estará Amanda, una asistente de investigación de mi laboratorio. Comience colocando el matraz con MTD y solución digestiva en un agitador magnético a 60 rotaciones por minuto en una incubadora de 35 grados centígrados durante 30 minutos.Use una pipeta de un mililitro para interrumpir los grupos de tejido agregados de las rodajas BAT alrededor de la barra de agitación. Después de la digestión, coloque un filtro de filtro de 70 micrómetros sobre un tubo de centrífuga limpio de 50 mililitros y pipete alrededor de cuatro mililitros de suspensión celular a través del filtro. Luego lávelo con cuatro mililitros de solución de iodixanol al 12%.Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar las células con solución de iodixanol y luego transferir la mezcla celular a dos tubos de ensayo de poliestireno transparente de cinco mililitros. Coloque los tubos de poliestireno que contienen la mezcla celular en hielo durante una hora, haciendo que los BA formen una capa en la parte superior. Saque 20 microlitros de los BA aislados para examinarlos con microscopio.Para el aislamiento de ARN y proteínas, pipetear la capa de BA en dos tubos de microcentfuga de 1,7 mililitros. Luego retire con cuidado la solución yodixonal excesiva sin interrumpir la capa de BA. Luego agregue un mililitro de TRIzol en la solución celular para aislar simultáneamente el ARN, el ADN y la proteína y mezclar lo suficiente como para afectar a las células.Para separar las fases, agregue 200 microlitros de cloroformo y centrifugar al tubo a 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, use la fase acuosa para el aislamiento de ARN. Transfiera 300 microlitros de la fase orgánica a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros y agregue 750 microlitros de etanol al 100%.Después de vortexing durante 10 segundos, agregue 200 microlitros de 1-Bromo-3-cloropropano y vortex nuevamente durante 10 segundos. Agregue 600 microlitros de agua destilada doble antes de vortex durante 10 segundos. Deje reposar la solución mezclada durante 10 minutos a temperatura ambiente.Después de la centrifugación, agregue 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Las fases se separarán con la fase proteica localizada en la capa media. Retire la solución acuosa superior y agregue un mililitro de etanol al 100% en la solución restante.Después de la centrifugación a 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados, deseche el sobrenadante y lave el pellet con un mililitro de etanol al 100%. Centrifugar a 9, 981 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de retirar el sobrenadante, seque al aire el pellet durante 10 minutos a temperatura ambiente y mida el peso del pellet húmedo.Agregue una solución de SDS al 1% en una proporción de 20 microlitros por miligramo de pellet. Disuelva el pellet completamente colocando el tubo en una coctelera caliente a 55 grados centígrados y 11 g durante cinco a 10 minutos. En el protocolo, PBS que contenía 3% BSA se utilizó para separar los BA de BAT.Las células aisladas tenían forma de frambuesa con gotitas de lípidos multiloculares en el interior y eran tdTom positivo, lo que confirma que eran BA. La proteína se aisló de los BA con un protocolo GTPC mejorado y luego se examinó con un gel SDS-PAGE. Se observó una banda dominante asociada con BSA en la muestra de BA, lo que sugiere su interferencia en la extracción de proteínas.Para evitar la interferencia de BSA, se utilizó una solución de yododinonal al 6% para el aislamiento de BA, que tenía una forma típica de frambuesa y contenía gotas de lípidos multiloculares. Las proteínas extraídas de estos BA se separaron bien en el gel SDS-PAGE. Se encontró que estas células eran tdTomato positivas, mientras que las células recuperadas del pellet eran tdTomato negativas sin gotas de lípidos obvias, lo que sugiere una separación eficiente de las BA de las células no grasas.En el análisis de expresión génica, los niveles de ARNm de UCP1 y PDGFA fueron significativamente más altos en los BA aislados. Pero el ARNm de PDGFRA solo se detectó en BAT. Se encontró proteína UCP1 enriquecida en BA aisladas.Se detectó EDGFR alfa en las MTD, pero no en las BA aisladas. Estos resultados confirman la eficacia del método para aislar BA y demuestran que los BA aislados son adecuados para estudios de expresión génica y proteica. Al intentar este protocolo, use tampón de digestión fresco para disociar el tejido adiposo marrón y evitar la formación de grumos de tejido durante el período de digestión.Este nuevo método facilita la investigación de la biología del tejido adiposo marrón en un solo nivel de toma celular. Al aplicar este método, se pueden realizar estudios de GN y expresión de proteínas con adipocitos marrones puros que diseccionan con precisión el programa de expresión génica de los adipocitos marrones, sin preocuparse por la contaminación original de las células no grasas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Preadipocitos primarios blancas aisladas de tejidos adiposos blancos en ratones se pueden diferenciar en células beige / brite. Se presenta aquí un sistema fiable modelo celular para estudiar la regulación molecular de "color" de la grasa blanca.

Aislamiento y diferenciación de las células del estroma vascular a células Beige / Brite

Debido a la conexión drástico y negativo entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación sobre el papel adiposo desempeña en la enfermedad y la salud en general se justifica. Se presenta un protocolo para el aislamiento y la escisión de los depósitos de tejido adiposo que permitan el estudio de tejido adiposo usando in situ y métodos in vitro.

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Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.

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Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

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Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

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Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

Aquí, proporcionamos un procedimiento práctico para diseccionar y realizar análisis histológicos y de expresión génica del tejido adiposo marrón supraclavicular murino.

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Aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino para el análisis de expresión génica y proteica

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