Name: Preparación y micromecanizado Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Crio-Tomografía Electrónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Aprende a preparar Saccharomyces cerevisiae mediante micromecanizado criogénico con haz de iones enfocados para tomografía electrónica criogénica. Este protocolo detallado permite estudiar estructuras celulares internas con alta resolución.

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Este trabajo fue apoyado por Instruct-Ultra (Grant 731005), iNEXT-Discovery (Grant 871037) financiado por el programa Horizon 2020 de la Comisión Europea, y la infraestructura de investigación CIISB, un Centro Instruct-ERIC (LM2018127). Agradecemos el apoyo obtenido de Thermo Fisher Scientific Brno.

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Los autores no tienen nada que revelar.

La preparación de las muestras celulares para crio-ET es un flujo de trabajo complejo que requiere la utilización de varios instrumentos de alta gama. La calidad de la muestra puede verse comprometida durante cada paso de preparación que influye en el rendimiento de todo el protocolo. Además, la necesidad de la transferencia de muestras entre instrumentos individuales plantea un riesgo adicional de contaminación o desvitrificación de la muestra. Por lo tanto, la optimización de los pasos individuales en el flujo de trabajo de preparación de muestras es de gran importancia para aumentar el rendimiento y la reproducibilidad del flujo de trabajo de preparación de láminas. El protocolo aquí presentado describe la preparación optimizada de Saccharomyces cerevisiae para la caracterización estructural de complejos macromoleculares in situ por crio-ET.
El protocolo describe la preparación de dos tipos de muestras de levadura que difieren principalmente en la concentración de las células en la cuadrícula TEM. Ambas muestras de levadura produjeron láminas de alta calidad para crio-ET y la selección del tipo de muestra se puede hacer de acuerdo con los objetivos del estudio en particular. La levadura forma grupos aislados de pocas células dispersas aleatoriamente sobre la superficie de la rejilla en el primer caso, mientras que una monocapa continua de células está presente en la superficie de la rejilla TEM para el segundo tipo de muestra. El primero es adecuado para la preparación rápida de láminas gracias al pequeño volumen del material que debe ser fresado. La lámina final es bastante corta y, por lo tanto, contiene solo 2-4 secciones transversales celulares. Las áreas adecuadas para la preparación de muestras se distribuyen aleatoriamente sobre la superficie de la rejilla, incluidos los cuadrados de la cuadrícula, lo que puede restringir parcialmente la automatización del flujo de trabajo de preparación de láminas. Este último tipo de muestra requiere la utilización de corrientes más grandes durante la fase inicial de molienda para retener el tiempo total de molienda. Además, este tipo de muestra es más propensa a los artefactos que se derivan de la molienda desigual (cortinas). Por lo tanto, el SIG se pulveriza sobre la superficie de la muestra durante un período 50% más largo que en el caso de la muestra con pequeños grupos celulares para formar una capa protectora más gruesa. A continuación, la muestra se pulveriza con una capa adicional de iridio (alternativamente platino u oro) para curar la capa SIG, hacerla más rígida y aumentar la conductividad de la superficie de la muestra. FiBM de áreas adicionales a cada lado de la lámina (~ 2-5 μm desde el borde de la lámina) durante el primer paso de la molienda de láminas rugosas se encontró beneficioso para disminuir el número de láminas rotas muy probablemente debido a la disminución de la tensión en la sección transversal final23. La lámina final es larga y contiene ~ 10 secciones transversales celulares, lo que aumenta el número de regiones adecuadas para crio-ET. La vitrificación inadecuada del medio o tampón entre las células se puede atenuar fácilmente mediante la adición del crioprotetente a la solución tampón (5% de glicerol utilizado en este estudio). Dado que la mayoría de los cuadrados son adecuados para la preparación de láminas, la muestra con células organizadas en una monocapa continua es muy adecuada para la preparación de láminas sin supervisión.
Otro aspecto importante en el flujo de trabajo de preparación de la lámina es la transferencia al microscopio electrónico de transmisión y el posicionamiento adecuado de la lámina al eje de inclinación de la etapa del microscopio. De manera óptima, el eje principal de la lámina es perpendicular al eje de inclinación del microscopio, lo que permite rastrear y enfocar a la altura de la región fotografiada y evita que los bordes de la lámina protejan el campo de visión en ángulos de inclinación altos. Al recoger los datos crio-ET utilizando el esquema simétrico de dosis,18 la muestra debe girarse inicialmente en el microscopio para compensar la inclinación de la lámina con respecto al plano de la rejilla.

Los recientes desarrollos tecnológicos y de software han hecho de la crio-microscopía electrónica (crio-EM) de especímenes biológicos vitrificados una de las técnicas clave en la investigación de biología estructural en la última década1,2. La preparación de una muestra para crio-EM generalmente consiste en la aplicación de una proteína purificada o un complejo de proteína con ácido nucleico en el portador de la muestra (rejilla TEM), seguida de la eliminación de la mayor parte del líquido con un papel de filtro y la congelación por inmersión de la rejilla con la capa delgada residual de una muestra en etano líquido o propano3 . Por lo tanto, la muestra se fija en una capa delgada (típicamente <80 nm) de tampón amorfo en un estado completamente hidratado, en condiciones casi nativas y sin necesidad de ninguna fijación química o contraste de metales pesados. Las imágenes de la muestra estructuralmente homogénea en el microscopio electrónico de transmisión producen datos que pueden utilizarse para la determinación de la estructura tridimensional de la macromolécula a una resolución casi atómica utilizando un protocolo de análisis de partículasúnicas 2. Tal estructura in vitro corresponde a la representación de la macromolécula en las condiciones y el tratamiento utilizados durante la preparación de la muestra. Aunque las estructuras determinadas bajo las condiciones in vitro generalmente corresponden al estado completamente funcional de la macromolécula, la capacidad de obtener imágenes de relaciones espaciales entre varias macromoléculas dentro de la célula proporcionaría un contexto funcional adicional a los datos estructurales.
La crio-tomografía electrónica (cryo-ET) se utiliza para reconstruir volúmenes 3D de objetos pleomórficos o complejos macromoleculares in situ4,5. La ventaja de crio-ET es que la información tridimensional se obtiene mediante la obtención de imágenes de una sola entidad. Sin embargo, la resolución a la que se observan complejos macromoleculares u orgánulos individuales es muy limitada. Por lo tanto, el promedio de las macromoléculas (sub-tomogram averaging, STA) con la misma estructura a partir de un mayor número de tomogramas es necesario para alcanzar modelos de resolución de 4-8 Å a partir de los datos crio-ET6,7. Recientemente se ha demostrado que cryo-ET y STA también se pueden aplicar para determinar estructuras de alta resolución de máquinas macromoleculares como los ribosomas en el contexto del entorno celular7. Sin embargo, la utilización de la microscopía electrónica de transmisión está limitada por el grosor de la muestra. En general, esto no es un problema para la crio-EM de una sola partícula, donde la optimización de las condiciones de vitrificación puede eventualmente resultar en la incrustación de la muestra en una capa delgada de hielo. Por otro lado, la mayoría de las células no son de hecho transparentes por electrones para el haz de electrones de 300 keV. La trayectoria libre media inelástica en los especímenes biológicos vitrificados para los electrones de 300 keV es de aproximadamente 395 nm8,lo que significa que los estudios crio-ET se limitan a la periferia celular para la mayoría de las células.
Se desarrollaron diferentes técnicas para adelgazar la muestra hasta un espesor suficiente para crio-ET. La crio-ultramicrotomía utiliza el corte mecánico de la muestra con un cuchillo de diamante a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 ° C) para proporcionar secciones de 60-80 nm de espesor adecuadas para crio-ET9,10,11. Se pueden preparar múltiples secciones a partir de una sola celda y el análisis de datos puede eventualmente producir información estructural 3D para la mayor parte de la celda. Sin embargo, el corte mecánico puede causar varios artefactos, como secciones curvas, grietas o compresión de muestras, lo que puede influir en la estructura resultante y sesgar los datos crio-ET10,11,12. El micromecanizado de haz de iones crioenfocado (crio-FIBM) representa un enfoque alternativo en el que se prepara una sección celular delgada mediante la ablación gradual de la muestra utilizando un haz enfocado de iones Ga+ (FIB) en un proceso de varios pasos, que puede resultar en una sección transversal celular (lámina) de 80-300 nm de espesor13,14,15 . A diferencia de la crio-ultramicrotomía, solo se prepara una lámina a partir de una sola célula, lo que representa ~ 0.3-3% de su volumen, y el micromecanizado de múltiples células generalmente es necesario para encontrar una región de interés en la sección transversal molida. Además, el rendimiento de todo el flujo de trabajo sigue siendo hoy en día bastante bajo, a menudo limitado a 6-8 láminas de alta calidad de una sesión crio-FIBM de 8 horas. Por otro lado, las secciones transversales crio-FIBM están desprovistas de cualquier artefacto de compresión y proporcionan una entrada adecuada para crio-ET de alta resolución. Además, la transferencia de la lámina al portador de la muestra para crio-ET no es necesaria, ya que la muestra se retiene en la rejilla TEM durante todo el proceso de preparación de la lámina y la misma rejilla se puede transferir posteriormente a TEM. Esperamos que el rendimiento del crio-FIBM mejore significativamente pronto, principalmente por la disponibilidad de software para el fresado de láminas no supervisado16,17 y la utilización de FIB que operan según el principio de plasma de pareja de carga, lo que permitirá una ablación más rápida del material.
Saccharomyces cerevisiae (levadura) son células eucariotas de forma esférica y diámetro de ~2-5 μm. Gracias a su tamaño, accesibilidad, genética, tiempo de generación y manipulación simple, la levadura es ampliamente estudiada como un organismo modelo eucariota en la investigación de biología celular y molecular similar a Escherichia coli,que está bien estudiado como un organismo modelo procariota en bacteriología. La levadura se puede cultivar fácilmente en suspensión y se genera una gran cantidad de células en poco tiempo (tiempo de duplicación 1 – 2 horas). Más importante aún, la levadura comparte una estructura celular interna compleja con células animales y vegetales, al tiempo que conserva un pequeño genoma compuesto por un bajo contenido de ADN no codificante. La caracterización estructural del proteoma de levadura a partir de los datos in situ de alta resolución puede ayudar a proporcionar una descripción mecanicista de la gran cantidad de datos funcionales disponibles en la literatura.
Aquí, proporcionamos un protocolo integral para la adquisición de datos crio-ET in situ en la muestra de levadura, que cubre todos los pasos desde el cultivo de la muestra hasta la preparación de la lámina crio-FIBM, y la transferencia de muestras a TEM para la adquisición de datos crio-ET.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Himedia</td><td>MB053</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>PENTA</td><td>12020-31000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>etano Messer</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>LN2</td><td>Lineq</td><td>LN2-1L</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Merck</td><td>P5905-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>cepa BY4741</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Dumont</td><td>T539</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Desechable</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papeles secantes</td><td>Ted Pella</td><td>47000-10</td><td></td></tr><tr><td>C-clip</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97551</td><td></td></tr><tr><td>Anillo</td> <td>C-clipThermoScientific</td><td>9432 909 97561</td><td></td></tr><tr><td>Varillas de esparcimiento</td><td>Merck</td><td>Z376779-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Asas de inoculación estériles</td><td>BRAND</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico estériles</td><td>Sigma</td><td>SIAL0166</td><td></td></tr><tr><td>Rejillas TEM</td><td>Quantifoil</td><td>4420G-XA</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balanzas de autoclave</td><td>Systec</td><td>101291545</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BEL</td><td>M124A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Cryo-FIB/SEM Microscopio</td><td>ThermoScientific</td><td>1006123</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-TEM</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 057 03301</td><td></td></tr><tr><td>Caja de flujo laminar</td><td>Telstar</td><td>AH5</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Gatan</td><td>955.82001</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de agitación</td><td>New Brunswick</td><td>M1282-0002</td><td></td></tr><tr><td>espectrofotómetro UV/VIS</td><td>WPA</td><td>S800</td><td></td></tr><tr><td>robot de vitrificación</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 053 50621</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación y micromecanizado crio-fib de saccharomyces cerevisiae para crio-tomografía electrónica

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Hoy en día, la crio-tomografía electrónica (crio-ET) es la única técnica que puede proporcionar datos estructurales de resolución casi atómica sobre complejos macromoleculares in situ. Debido a la fuerte interacción de un electrón con la materia, los estudios crio-ET de alta resolución se limitan a especímenes con un grosor de menos de 200 nm, lo que restringe la aplicabilidad del crio-ET solo a las regiones periféricas de una célula. Durante la última década se introdujo un flujo de trabajo complejo que comprende la preparación de secciones transversales celulares delgadas mediante micromecanizado de haz de iones crioenfocado (crio-FIBM) para permitir la adquisición de datos crio-ET del interior de células más grandes. Presentamos un protocolo para la preparación de láminas celulares a partir de una muestra vitrificada por congelación por inmersión utilizando Saccharomyces cerevisiae como ejemplo prototípico de una célula eucariota con amplia utilización en investigación de biología celular y molecular. Describimos protocolos para la vitrificación de S. cerevisiae en parches aislados de unas pocas células o una monocapa continua de las células en una rejilla TEM y proporcionamos un protocolo para la preparación de láminas por crio-FIB para estas dos muestras.

El cultivo de Saccharomyces cerevisiae fue cosechado en medio de la fase de crecimiento exponencial. Preparamos dos tipos de especímenes en los que las células se distribuyeron como pequeños grupos de varias celdas sobre la superficie de la cuadrícula TEM(Figura 1A,C)o formaron una monocapa continua sobre cuadrados de cuadrícula individuales de la cuadrícula TEM(Figura 1B,D). El factor discriminativo para la preparación de la muestra con islotes celulares distintos o la monocapa celular es la concentración del cultivo celular aplicado a la cuadrícula TEM. El cultivo celular cosechado se concentró en OD600 = 1.0 para el primer caso, o a OD600 = 30 a 60 para el segundo caso, respectivamente. La muestra para la preparación de la monocapa celular se complementó además con glicerol al 5% v/v antes de la vitrificación. El glicerol es crítico para la vitrificación de la solución tampón, que llena el espacio entre las células(Figura 2),ya que las reflexiones del tampón cristalino pueden ser perjudiciales para el seguimiento posicional adecuado y el enfoque durante la recopilación de datos crio-ET.
Además, el cultivo de suspensión de levadura se secó contra el material no absorbente, como la almohadilla de borrado de PTFE o la almohadilla impresa en 3D personalizada hecha de material FlexFill 98A. El papel secante se colocó solo en la parte posterior de la rejilla con respecto a la aplicación de muestra (back-blotting). Se recomienda la estrategia de retrosofiltración para la congelación por inmersión del cultivo en suspensión, ya que la filtración con el papel de filtro de ambos lados da como resultado la adhesión de las células al papel secante(Figura 1E).
El protocolo descrito aquí utiliza rejillas TEM recortadas en el cartucho de rejilla, que forma un soporte estable para la rejilla y facilita el manejo de la muestra de la muestra después de la vitrificación. Esto hace cumplir la necesidad de que otros soportes de muestras y lanzaderas en el microscopio FIB / SEM y TEM puedan aceptar un cartucho de rejilla de este tipo.
Tras la transferencia de la muestra al microscopio FIB/SEM, la muestra se recubrió primero con una capa de 0,3-1,0 μm de metilciclopentadienil platino utilizando el sistema de inyección de gas (SIG) del microscopio. Se verificó una capa adicional del iridio inorgánico en la superficie de la muestra para endurecer la capa SIG y hacer que la superficie fuera conductora. Las láminas se fresaron en múltiples pasos(Figura 3)donde (I) la corriente de fresado, (II) el ancho de la lámina y (III) la distancia del área de fresado por encima y por debajo de las muestras se redujeron de manera gradual. El paso final de fresado ("pulido") se llevó a cabo a baja corriente (10-30 pA) solo desde la parte superior de la lámina y con la muestra inclinada por un 1° adicional hacia la viga de Ga+. La utilización del protocolo descrito ha dado como resultado en promedio 8-10 láminas preparadas en dos cuadrículas TEM dentro de una sesión de 6-8 horas.
Las rejillas TEM con las láminas se transfirieron posteriormente a un microscopio electrónico de transmisión. Las láminas se examinaron por primera vez y solo se seleccionaron aquellas que mostraban una cortina mínima (artefactos derivados de un fresado desigual a través de la superficie de la lámina), un bajo nivel de contaminación superficial y un buen contraste celular (generalmente observado para las láminas con un espesor de &lt;200 nm) para la adquisición de los datos crio-ET. Además, las láminas que contenían grietas en toda la longitud se descartaron de la recopilación de datos. En general, alrededor del 50% de las láminas transferidas a TEM eran adecuadas para la adquisición de datos. Las series tilt se recogieron en el detector de electrones directo K2 post-GIF con la ranura de selección de energía establecida en 20 eV. La recolección de datos se realizó en el software SerialEM18 y las series de inclinación se recolectaron utilizando un esquema simétrico de dosis19 con el rango de inclinación de ±60° y el incremento de 3°. Los datos se adquirieron con el aumento correspondiente al tamaño de píxel de 3,47 A/px. La dosis global de 65 e/Å2 se distribuyó uniformemente en los submarcos individuales. Las imágenes de inclinación se recopilaron como un conjunto de tres fotogramas, que posteriormente se corrigieron para el daño de movimiento y radiación durante la adquisición de datos utilizando el programa MotionCor220. Los parámetros de la función de transferencia de contraste se estimaron utilizando Ctffind421. Las series tilt se procesaron en eTomo18. Se utilizó la rutina de seguimiento de parches para alinear las imágenes. El tomograma se reconstruyó utilizando un algoritmo de retroproyección ponderada después de 2x binning de las imágenes, y posteriormente se filtró utilizando un filtro similar a SIRT (establecido en 8 iteraciones) en IMOD18. La segmentación del tomograma se realizó manualmente en el software Amira22. Los tomogramas reconstruidos proporcionan una representación de alta resolución del interior celular de la levadura y nos permiten observar orgánulos como vacuolas o mitocondrias con un alto nivel de detalle o estudiar complejos macromoleculares como microtúbulos, o complejos de poros nucleares in situ y en condiciones casi nativas (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig1.jpg"> Figura 1: Imágenes FIB y SEM de S. cerevisiae vitrificadas Imágenes FIB (A) y SEM (C) de los pequeños grupos de levadura vitrificados en la cuadrícula TEM. Imágenes FIB (B) y SEM (D) de la levadura formando una monocapa continua en la superficie de la rejilla. La muestra se recubrió con SIG y capa de Irridium antes de la obtención de imágenes. Las barras de escala en los paneles A-B corresponden a 10 μm. La muestra de levadura se borra contra material no absorbente como PTFE o FlexFill 98A (verde) y con el papel secante colocado desde la parte posterior de la rejilla (blanco, E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig2.jpg"> Figura 2: S. cerevisiae lamellae Una imagen TEM de una lámina micromecanizada de la muestra con levadura monocapa continua sobre la superficie de la rejilla. Las reflexiones observadas entre las células contenían un medio/tampón inadecuadamente vitrificado(A,resaltado con círculos rojos). Una imagen TEM de la lámina generada en la levadura vitrificada en una monocapa continua con la adición de glicerol al 5% en el medio/tampón (B). La barra de escala corresponde a 2 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig3.jpg"> Figura 3: Flujo de trabajo cryo-FIBM Representación esquemática del proceso de molienda de láminas. Los pasos iniciales de fresado en bruto se realizan a altas corrientes FIB desde ambos lados de la posición tentativa de la lámina (resaltada en verde), mientras que el paso final de pulido se realiza solo desde el lado superior y a baja corriente FIB (resaltado en naranja, vea el video adjunto a las 6:33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig4.jpg"> Figura 4: Orgánulos de levadura y complejos macromoleculares representados por crio-ET Rebanadas de los tomogramas reconstruidos que representan una vacuola (A, barra de escala: 200 nm), ribosomas (B, barra de escala: 200 nm), un núcleo paracristalino de peroxisoma (C, barra de escala: 100 nm), microtúbulo (flecha blanca) en la proximidad de una estructura fibrosa no identificada (flecha negra, D, barra de escala: 100 nm), detalles de múltiples microtúbulos (E, barra de escala: 50 nm), una membrana nuclear con poros indicados por flechas (F, barra de escala 200nm), mitocondria (G, H, barra de escala: 100 nm, las flechas indican cristae individual), un haz de estructuras filamentosas no identificadas (I, barra de escala: 100 nm). Los paneles B, C, D, E, G contienen una sección de tomogramas preparados a partir de pequeños grupos de células, mientras que las secciones de tomogramas recogidas en láminas de una monocapa de las células se muestran en los paneles A, F, H, I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Presentamos un protocolo para la preparación de láminas de especímenes biológicos congelados por inmersión mediante micromecanizado de haz de iones crioenfocado para estudios estructurales de alta resolución de macromoléculas in situ con tomografía crio-electrónica. El protocolo presentado proporciona pautas para la preparación de láminas de alta calidad con alta reproducibilidad para la caracterización estructural de macromoléculas dentro de las Saccharomyces cerevisiae.

Preparación y micromecanizado Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Crio-Tomografía Electrónica

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Este video se centrará en la preparación de la levadura salmonella para la crio-tomografía electrónica Recorreremos el flujo de trabajo desde el cultivo celular hasta la crio-tomografía electrónica Saccharomyces cerevisiae se cultivan para la preparación de muestras de iones en suspensión Se recomienda trabajar en condiciones estériles dentro de la caja de flujo laminar diez mililitros de levadura estéril extraída al medio para el cultivo celular se agrega al matraz de cultivo esterilizado un mililitro de glucosa estéril del veinte por ciento el matraz con medio de cultivo una colonia de levadura se recoge cuidadosamente de nuestra placa de cultivo y se transfiere al medio de crecimiento preparado en el matraz de cultivo El matraz de cultivo se cubre con papel de aluminio y se mezcla bien para dispersar las células El cultivo celular se coloca en la incubadora y se cultiva a treinta grados con agitación constante hasta que se alcanza la fase exponencial El cultivo celular de levadura se cultiva hasta la fase exponencial y la densidad física celular se mide por Mantener el medidor contra un medio limpio como muestra de referencia El cultivo celular se concentra en OD1 u OD30 además del cinco por ciento de glicerol antes de la congelación por blanche La superficie de las rejillas electromicroscópicas se limpia y activa para la aplicación de la suspensión celular mediante rejillas de plasma se colocan en la cámara de descarga de resplandor mirando hacia arriba y el procedimiento de limpieza por plasma se establece en treinta a cuarenta y cinco segundos las rejillas EM tienen ahora y están listas para la celda Aplicación de muestra La vitrificación de la suspensión de células de levadura en rejillas EM se realiza mediante la congelación por blanca en el etano líquido utilizando la máquina Vitrobot La preparación del etano líquido se lleva a cabo licuando el gas etano en una taza de metal enfriada con nitrógeno líquido Em rejilla con suspensión celular se borra con papel de filtro de la parte posterior y por plástico no adhesivo doblado desde el lado frontal de carbono La temperatura dentro de la cámara Vitrobot se establece en dieciocho grados y humedad al cien por cien tiempo de espera, tiempo de borrado y fuerza de borrado también se establecen en la pantalla de Vitrobot La rejilla de descarga de resplandor es recogida por pinzas Vitrobot y montada en el instrumento tres punto cinco microlitros de saccharomyces cerevisiae suspensión se aplica al lado de carbono de la rejilla dentro de la cámara climática Vitrobot La suspensión debe mezclarse adecuadamente antes de que cada aplicación de la rejilla de la rejilla se congele con blanche en las rejillas de electro-microscopía de etano líquido las rejillas con células vitrificadas se almacenan en condiciones de nitrógeno líquido o se montan en el cartucho de rejilla para cargar en el microscopio CRIO SEM La rejilla con celdas vitrificadas se asegura en el cartucho de rejilla adecuado para cargar en los microscopios SEM y TEM El anillo de clip C se monta en la herramienta de recorte y se enfría en la rejilla de nitrógeno líquido se coloca en el cartucho de carbono de la rejilla hacia abajo y se recorta con el La muestra del anillo C-clip se coloca en la caja de rejilla especial La muestra para la preparación de lamila se carga en el microscopio FIB / SEM de doble haz y se ajusta con la cámara de preparación crioestafilada La olla de carga se enfría correctamente y se llena con un soporte de muestra de nitrógeno líquido llamado lanzadera se coloca en el y se enfría, así como la caja de rejilla con muestra se transfiere del dewar de almacenamiento a la olla y las rejillas se colocan en dos ranuras en el lado de carbono del transbordador con celdas hacia arriba en caso de uso de cartuchos de rejilla FIB, el corte del cartucho de rejilla debe alinearse cuidadosamente a las doce en punto en las rejillas de transporte se aprietan con el tornillo y el transbordador se voltea hacia abajo hasta la posición de carga, la olla de carga se coloca en la estación de transferencia y se cubre con la tapa La cámara de transferencia con la olla de carga se coloca en la parte superior de la tapa y se bombea a través de la El transbordador de bajo vacío con rejillas se sujeta en la varilla y se cierra dentro de la pequeña cámara de transferencia Las cámaras recogidas a la cámara de preparación se bombean y el transbordador se inserta en la etapa crio-etapa en la etapa de cámara SEM de alto vacío se inclina a cuarenta y cinco grados y se mueve cuatro milímetros en la posición central de la rejilla insertando la aguja del sistema de inyección de gas crea una capa protectora de orgánico sobre muestra biológica contra el daño por radiación durante el enfoque Las rejillas de fresado de vigas de iones se recubren con un velo delgado de metal inorgánico para crear una capa conductora en material biológico El fresado de vigas de iones enfocadas de láminas en racimo celular o monocapa se realiza en pocos pasos La etapa se mueve al ángulo de fresado Región de interés se encuentra y se crean patrones de fresado superior e inferior Se crean láminas rugosas se fresan con una disminución gradual de la corriente FIB y el espesor de la lámina el pulido final de la lámina es realizado solo con patrón superior y baja corriente FIB para evitar daños en el extremo frontal y efecto de cortina en el haz de electrones de la superficie de la lámina muestra el progreso durante el proceso de fresado aquí podemos ver la lámina pulida final El grosor final de la lámina debe ser inferior a doscientos cincuenta nanómetros para ser transparente para la transmisión del haz de electrones la ilustración de la lámina fresada en cúmulo celular y monocapa con pros y contras de Ambos tipos de muestras, las rejillas con lamali se transfieren muy suavemente a través de la cámara de preparación de regreso a la olla de carga, se enfrían y se llenan con nitrógeno líquido fresco y limpio para evitar la contaminación por hielo de las rejillas de lamali molidas, se retiran del transbordador y se devuelven a la muestra de la caja de rejilla con lamali fresado, finalmente se transfiere a la transmisión de electrones, la rejilla criociscópico debe girarse noventa grados antes de la inserción en el cassette del cargador automático TEM Para garantizar la orientación adecuada de la lámina con respecto al acceso de inclinación TEM, los lamili se examinan y la región de interés para la adquisición de datos tomográficos crioeónicos se localiza El eje principal de la lámina es perpendicular al eje de inclinación del microscopio para ver el campo de visión derecho en ángulos de inclinación altos Se utiliza el método dosimétrico para recopilar datos de tomografía crioetrónica recopilados el tomograma que luego se procesa en el software Etomo y la monocapa segmentada en Amira Software En este protocolo le mostramos cómo preparar eficientemente una muestra de células de levadura para una micromáquina de láminas utilizando fresado de haz de iones crioenfocado y cómo preparar y procesar datos de tomografía electrónica y lamali celular

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Para preservar los procesos neuronales para el análisis ultraestructural, se describe un protocolo para la siembra de las neuronas primarias en rejillas de microscopía electrónica, seguido de congelación instantánea, dando muestras en suspensión en una capa de hielo vítreo. Estas muestras pueden ser examinados con un crio-microscopio electrónico para visualizar estructuras a escala nanométrica.

Preparación de las neuronas primarias para la visualización de neuritas en un Estado Frozen-hidratado con Cryo-tomografía electrónica

Cryo microscopios electrónicos, ya sea de barrido (SEM) o transmisión (TEM), son ampliamente utilizados para la caracterización de las muestras biológicas o de otros materiales con un alto contenido de agua 1. Un SEM / haz de iones focalizados (FIB) se utiliza para identificar las características de interés en muestras y extraer una lámina delgada, transparente-de electrones para la transferencia a un crio-TEM.

Cryo-Microscopía Electrónica de Preparación de Muestras por medio de un haz de iones focalizados

Este artículo describe la metodología de criomicroscopía electrónica, que se utiliza para obtener imágenes microscópicas de alta calidad de macromoléculas en su estado casi nativo. El método produce imágenes adecuadas para el procesamiento computarizado posterior utilizando el enfoque de partícula única, ideado para generar la reconstrucción 3D de una macromolécula.

Qué hacer y qué no hacer de crio-microscopía electrónica: Una introducción a la preparación de muestras y de alta calidad de recopilación de datos para la Reconstrucción de Macromoléculas 3D

Se presenta un protocolo sobre cómo utilizar la crio-tomografía electrónica de alto rendimiento para determinar alta resolución en las estructuras in situ de máquinas moleculares. El protocolo permite que grandes cantidades de datos a procesar, evita los cuellos de botella comunes y reduce el tiempo de inactividad de los recursos, lo que permite al usuario centrarse en cuestiones biológicas importantes.

Usando Tomoauto: Un protocolo para la de alto rendimiento automatizado tomografía crioelectrónica

Se presenta un instrumento y métodos para la preparación de volúmenes nanoliter-tamaño de la muestra para microscopía electrónica de transmisión. No se requieren, evitando las consecuencias perjudiciales que esto puede tener para las proteínas, significativamente reducir la pérdida de muestra y que permite el análisis de lisado de proteómica visual única célula pasos papel-blotting.

Preparación de muestras miniatura para microscopia electrónica de transmisión

Uso de molienda de haz de iones enfocado para producir láminas vítreas en la rejilla a partir de muestras biológicas congeladas por inmersión para tomografía crioelectrónica.

Preparación de laminillas a partir de muestras biológicas vítreas utilizando un microscopio electrónico de barrido de doble haz para la criotomografía electrónica

La creciente demanda de recopilación de datos a gran escala en la tomografía electrónica criogénica requiere rutinas de adquisición de imágenes de alto rendimiento. Aquí se describe un protocolo que implementa los desarrollos recientes de estrategias de adquisición avanzadas destinadas a maximizar la eficiencia del tiempo y el rendimiento de la recopilación de datos tomográficos.

Estrategias para la optimización de la adquisición de datos de tomografía electrónica criogénica

Aquí, presentamos una línea para el fresado de haces de iones enfocados correlativos en 3D para guiar la preparación de muestras celulares para la tomografía crioelectrónica. La posición 3D de las proteínas de interés marcadas con fluorescencia se determina primero mediante criofluorescencia y luego se dirige a la molienda. El protocolo es adecuado para células de mamíferos, levaduras y bacterias.

Preparación de muestras mediante fresado por haz de iones focalizado correlativo en 3D para tomografía crioelectrónica de alta resolución

El objetivo de este protocolo es dirigir la adhesión y el crecimiento celular a áreas específicas de rejillas para criomicroscopía electrónica. Esto se logra mediante la aplicación de una capa antiincrustante que se ablaciona en patrones especificados por el usuario seguido de la deposición de proteínas de matriz extracelular en las áreas modeladas antes de la siembra celular.

Micropatronaje Transmisión Microscopía Microscopía Rejillas para Dirigir el Posicionamiento Celular dentro de los Flujos de Trabajo de Tomografía Crioelectrónica de Celda Entera

Un chip micropatronado recientemente desarrollado con ventanas de óxido de grafeno se fabrica mediante la aplicación de técnicas de sistemas microelectromecánicos, lo que permite obtener imágenes de microscopía electrónica criogénica eficiente y de alto rendimiento de varias biomoléculas y nanomateriales.

Fabricación de chip micropatrón con espesor controlado para microscopía electrónica criogénica de alto rendimiento

Este método proporciona un protocolo accesible y flexible para la preparación de rejillas de microscopía electrónica (EM) para criotomografía celular in situ y microscopía óptica y electrónica correlativa (CLEM).

Preparación de muestras para criotomografía in situ de células de mamíferos

Aprende a preparar Saccharomyces cerevisiae mediante micromecanizado criogénico con haz de iones enfocados para tomografía electrónica criogénica. Este protocolo detallado permite estudiar estructuras celulares internas con alta resolución.

Preparación y micromecanizado Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Crio-Tomografía Electrónica

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