Generación de un modelo tridimensional simplificado de piel en un chip en una plataforma microfluídica micromecanizado

Este es un protocolo novedoso y libre de litografía para modelar una piel en chip 3D utilizando capas de vinilo adhesivos micromecanizado y una metodología de flujo paralelo para la generación de compartimentos dérmicos. El vinilo micromecanizado proporciona más simplicidad en el proceso de fabricación y versatilidad en el diseño del dispositivo, superando algunas de las limitaciones de PDMS y enfoques litográficos tradicionales. Esta piel en un chip de múltiples capas se puede utilizar para enfoques de pruebas de medicamentos y cosméticos, ya que permite la detección de alto rendimiento a costos más bajos y podría usarse para modelar varias enfermedades.

Comience por diseñar un chip microfluídico utilizando el software Brother Canvas Workspace. Cree un espacio de trabajo de 30 por 30 centímetros y llénelo con los patrones de diseño para las diferentes capas del chip antes de almacenarlo en un archivo svg. Corta las láminas de vinilo de 30 por 30 centímetros.

Péguelo a una alfombra adhesiva de baja adherencia y elimine todas las burbujas de aire, según sea necesario. Con una unidad USB, cargue el archivo svg en el trazador de bordes y establezca los parámetros de corte como presión de corte en el nivel cero, cuchilla de corte en el nivel tres y nivel uno para la velocidad de corte. Cuando se establezcan los parámetros, coloque la alfombra adhesiva con el vinilo en el trazador y comience el proceso de corte de los patrones de canal en vinilo de 95 micrómetros de espesor.

Ensamble todo el dispositivo utilizando un alineador para obtener canales de ajuste, entradas y salidas adecuados. Apilar para capas de vinilo con un diseño de micromáquina correspondiente para ensamblar el canal inferior, manteniendo la cinta de cubierta de la capa inferior para evitar que se pegue al alineador. Corte y coloque la membrana porosa de policarbonato en la parte superior del canal inferior sin cubrir las entradas.

Agregue 10 capas de vinilo con el diseño de la cámara superior y pegue una capa final de cinta de doble cara en la parte superior. Retire el chip del alineador para pegarlo en el portaobjetos de vidrio. Coloque una lámina PDMS de dos milímetros de grosor sobre la capa de vinilo de cinta de doble cara.

Para asegurarse de que el chip sea completamente estanco, deje un peso encima del chip durante la noche. Al día siguiente, esterilice el chip enjuagándolo con etanol al 70% durante cinco minutos, seguido de un lavado con agua destilada. Conecte la bomba uno y la bomba dos a la entrada uno de la cámara superior y a la entrada dos de la cámara superior, respectivamente.

Conecte la bomba tres a la entrada de la cámara inferior y, a continuación, conecte las salidas de la cámara superior y de la cámara inferior a una tina de residuos. Conecte las jeringas a cada entrada mediante tubos de PTFE y conectores de acero inoxidable de calibre 18. Bombee PBS con bomba tres a través de la entrada de la cámara inferior a 50 microlitros por minuto, y con bomba dos a través de la entrada de la cámara superior dos a 100 microlitros por minuto.

Luego, cargue la jeringa con el pre-gel de fibrinógeno, colóquela inmediatamente en la bomba uno y ejecútela a 200 microlitros por minuto. Una vez que el pre-gel salga de la salida de la cámara superior, detenga las bombas uno y dos, luego, sin quitar el tubo, deje el chip para permitir la gotelación a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la gotellación, bloquee la entrada de la cámara superior con una tapa y bombee el medio de cultivo a través de la entrada de la cámara superior dos con la bomba tres a 50 microlitros por hora durante la noche.

24 horas después de la generación del compartimento dérmico, verifique que las células de fibroblastos primarios humanos se extiendan en el ensamblaje, luego introduzca cinco veces 10 a 6 HKC por mililitro a través de la entrada del canal superior dos a 40 microlitros por minuto durante un minuto. Para la fijación de la celda, coloque el chip durante la noche a 37 grados Celsius en una incubadora saturada de humedad. Comience a bombear medio de cultivo fresco con la bomba tres solo a través de la entrada de la cámara inferior a 50 microlitros por minuto.

En el análisis representativo, se muestra la altura del hidrogel a lo largo de la cámara superior del conjunto. Una altura media de 550 micrómetros fue óptima para el funcionamiento del gel a caudales de 100 y 200 microlitros por minuto para el PBS sacrificial y el pregel, respectivamente. La falta de lavado de PBS a través del canal inferior condujo a discrepancias entre la altura teórica del gel y la medida, con una diferencia del 40% Después de 24 horas desde el inicio del protocolo de flujo paralelo, se encontró que los fibroblastos primarios humanos se extendieron con éxito en el gel de fibrina en la cámara superior del ensamblaje, después de lo cual, los HKC que expresan proteínas fluorescentes verdes podrían sembrarse efectivamente sobre el hidrogel.

La extracción de tubos sin mantener el sistema cerrado durante la noche para permitir que el HKCS sedimente dio como resultado una monocapa de células no uniforme y confluente. El análisis confocal 3D del modelo de piel indiferenciada en el chip microfluídico mostró claramente la superficie del hidrogel que separa los HKC en la parte superior del fibroblasto incrustado en la parte inferior. La piel generada podría exponerse a la interfaz aire/líquido para obtener una epidermis madura y diferenciada, y además caracterizarse utilizando varios marcadores dérmicos y epidérmicos.

Esta técnica permite una fabricación de dispositivos más rápida y barata, y la generación de piel de múltiples capas utilizando microfluídica, proporcionando un enfoque más realista para las pruebas de medicamentos y cosméticos.