Name: Un protocolo de extracción de ADN de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Aprende a extraer ADN de Aedes aegypti usando perlas magnéticas sin equipos automatizados costosos. Este protocolo económico genera ADN de alta calidad para secuenciación de genoma completo en laboratorios con recursos limitados.

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Reconocemos el apoyo financiero del Centro Regional de Excelencia para Enfermedades Transmitidas por Vectores del Suroeste del Pacífico financiado por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos (Acuerdo de Cooperación 1U01CK000516), la subvención nu50CK000420-04-04 del CDC, el Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA (proyecto Hatch 1025565), la beca del Laboratorio de Entomología Médica de Florida de la UF/IFAS para Tse-Yu Chen, la subvención NSF CAMTech IUCRC Fase II (AWD05009_MOD0030) y el Departamento de Salud de Florida (Contrato CODQJ). Los hallazgos y conclusiones de este artículo son los de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista del Servicio de Pesca y Vida Silvestre de los Estados Unidos.

1. Almacenamiento general de muestras y preparados antes de la extracción de ADN
<ol><li>Hidratar la muestra en 100 μL de agua de grado PCR durante 1 h (o durante la noche) a 4 °C si la muestra se ha almacenado en alcohol >70% para ablandar el tejido.</li>
</ol>2. Interrupción de la muestra
<ol><li>Establezca una incubadora o un bloque de calor de agitación a 56 °C.</li>
	<li>Haga la mezcla del almacenador intermediario/de la enzima de la proteinasa K (PK). Se requieren 2 μL de proteinasa K (100 mg/mL) y 98 μL de tampón de proteinasa K (total 100 μL) para cada extracción individual de mosquitos. Para preparar una mezcla maestra para múltiples especímenes, aumente la cantidad total (combinada para todos los especímenes individuales) en ~ 15% para garantizar la disponibilidad de un volumen adecuado.</li>
	<li>Si las muestras se hidrataron antes de la extracción, deseche el agua de cada tubo de muestra.</li>
	<li>En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga tejido de mosquito, agregue 100 μL de tampón PK/mezcla de enzimas.</li>
	<li>Homogeneizar el tejido usando el tubo de microcentrífuga pestle.</li>
	<li>Centrifugar las muestras durante 1 min a 9.600 x g a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar la muestra durante 2-3 h a 56 °C.</li>
	<li>Durante la incubación, prepare los otros reactivos utilizando la etapa de extracción de ADN (paso 3).</li>
</ol>3. Extracción de ADN
<ol><li>Hacer una mezcla maestra de cuentas magnéticas. Para cada muestra, mezcle 100 μL de tampón de lisis, 100 μL de isopropanol y 15 μL de perlas magnéticas (total 215 μL). Para preparar una mezcla maestra para múltiples reacciones, aumente la cantidad total (combinada para todas las muestras individuales) en ~ 20% para garantizar la disponibilidad de un volumen adecuado.</li>
	<li>Después del tiempo de incubación (paso 2.7), transferir cada lisato a un tubo de microcentrífuga limpio o a un pozo de microplacas utilizando pipeta.</li>
	<li>Agregue 100 μL de lisato y 215 μL de la mezcla maestra de perlas magnéticas a cada muestra.</li>
	<li>Use una pipeta para mezclarla bien durante 10-20 s y luego déjela reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Agite suavemente el tubo de vez en cuando para maximizar la unión de las perlas magnéticas y el ADN.</li>
	<li>Coloque el tubo/placa en el separador magnético de perlas y espere hasta que la solución esté clara.</li>
	<li>Deseche el líquido del tubo/placa usando pipeta. Al retirar el sobrenadante, trate de no tocar ni perturbar las perlas magnéticas que sostienen el ADN.</li>
	<li>Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 325 μL de tampón de lavado 1 a cada pozo.</li>
	<li>Mezclar bien por pipeteo e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita los pasos 3.5-3.6.</li>
	<li>Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 250 μL de tampón de lavado 1 a cada pozo.</li>
	<li>Mezclar bien por pipeteo e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita los pasos 3.5-3.6.</li>
	<li>Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 250 μL de tampón de lavado 2 a cada muestra.</li>
	<li>Mezclar bien e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita los pasos 3.5-3.6.</li>
	<li>Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 250 μL de tampón de lavado 2 a cada pozo.</li>
	<li>Mezclar bien e incubar durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita los pasos 3.5-3.6.</li>
	<li>Aleje el tubo/placa del separador magnético de perlas y agregue 100 μL de tampón de elución a cada pozo.</li>
	<li>Mezclar bien e incubar durante 2 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Mueva el tubo/placa sobre el separador magnético de perlas y espere hasta que la solución esté clara.</li>
	<li>Pipetee el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga limpia de 0,5 o un pozo de microplaca.</li>
	<li>Almacene las muestras de ADN a 4 °C (hasta 1 semana) o -80 °C.  Si se está utilizando una microplaca, cúbrala con parafilm.</li>
	<li>Determine los rendimientos de ADN utilizando cualquier método apropiado. NOTA: En este estudio, la lectura y la absorbancia del fluorómetro de la DNA en 260/280 nanómetro fueron utilizadas.</li>
</ol>

<ol><li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314(2015).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473(2019).</li>
<li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li>
<li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector%2C+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).</li>
<li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211(2016).</li>
<li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li>
<li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S%C3%A3o+Tom%C3%A9+island%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li>
<li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+%28Howardina%29+busckii+and+Aedes+%28Ochlerotatus%29+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li>
<li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí se puede adaptar para otras especies de insectos. La versión original del protocolo introducido en Nieman et al.1 ha sido probada en múltiples especies, incluyendo Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta, y Keiferia lycop...

El desarrollo reciente de un protocolo mejorado de extracción de ADN1 ha permitido muchos estudios posteriores de alto impacto que involucran la secuenciación delgenoma completo2,3,4,5,6. Este protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas proporciona un rendimiento de ADN confiable de muestras individuales de mosquitos, lo que a su vez reduce el costo y el tiempo asociados con la adquisición de un número suficiente de muestras de colecciones de campo.
Los avances recientes en la genómica de la población y el paisaje están directamente correlacionados con la disminución de los costos de la secuenciación del genoma completo. Aunque el protocolo de extracción de ADN1 anterior aumenta las eficiencias asociadas con la secuenciación de alto rendimiento, los laboratorios / estudios más pequeños sin los fondos pueden optar por no usar estas nuevas y poderosas herramientas de genómica de poblaciones y paisajes debido a los costos de implementación del protocolo (por ejemplo, los costos de los instrumentos especializados).
Aquí, se presenta un protocolo de extracción de ADN modificado que utiliza un paso de extracción de perlas magnéticas similar al de Neiman et al.1 para obtener ADN de alta pureza, pero no depende de instrumentos de alto costo para la lisis tisular y la extracción de ADN. Este protocolo es adecuado para experimentos que requieren >10 ng de ADN de alta calidad.

<table><tbody><tr><td>Tampón AE</td><td>Qiagen</td><td>19077</td><td>Tampón de elución</td></tr><tr><td>Tampón AL</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td>Tampón de lisis</td></tr><tr><td>AW1 Tampón</td><td>Qiagen</td><td>19081</td><td>Tampón de lavado 1</td></tr><tr><td>Tampón AW2</td><td>Qiagen</td><td>19072</td><td>Tampón de lavado 2</td></tr><tr><td>Suspensión MagAttract G</td><td>Qiagen</td><td>1026901</td><td>perlas</td></tr><tr><td>magnéticas Separador de perlas magnéticas</td><td>Epigentek</td><td>Q10002-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Espectrofotómetro de microvolumen</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td></tr><tr><td>Tampón PK Tampón</td><td>ThermoFisher</td><td>4489111</td><td>Proteinasa K</td></tr><tr><td>Proteinasa K ThermoFisher</td><td></td><td>A25561</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>fluorímetro</td></tr></tbody></table>

un protocolo de extracción de adn de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Un protocolo de extracción de ADN recientemente publicado utilizando perlas magnéticas y un instrumento automatizado de extracción de ADN sugirió que es posible extraer ADN de alta calidad y cantidad de un mosquito individual bien conservado suficiente para la secuenciación del genoma completo aguas abajo. Sin embargo, la dependencia de un costoso instrumento automatizado de extracción de ADN puede ser prohibitiva para muchos laboratorios. Aquí, el estudio proporciona un protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas económico, que es adecuado para un rendimiento bajo a medio. El protocolo descrito aquí se probó con éxito utilizando muestras individuales de mosquitos Aedes aegypti. Los costos reducidos asociados con la extracción de ADN de alta calidad aumentarán la aplicación de la secuenciación de alto rendimiento a laboratorios y estudios de recursos limitados.

El rendimiento promedio de ADN por cabeza de mosquito individual/tejido de tórax fue de 4.121 ng/μL (N = 92, desviación estándar 3.513) medido usando un fluorómetro cuando se elutía usando 100 μL de tampón de elución. Esto es suficiente para los requisitos de entrada de ADN genómico de 10-30 ng necesarios para la construcción de la biblioteca del genoma completo1,7. La cantidad de ADN puede variar entre 0.3-29.7 ng/μL dependiendo del tamaño corporal del mosquito ...

Aquí se describe un protocolo de extracción de ADN que utiliza perlas magnéticas para producir extracciones de ADN de alta calidad de mosquitos. Estas extracciones son adecuadas para un enfoque de secuenciación de próxima generación aguas abajo.

Un protocolo de extracción de ADN de mosquitos a base de perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Este protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas económico hace que la secuenciación de alto rendimiento sea accesible para laboratorios y estudios de recursos limitados. Este protocolo no requiere equipos costosos para la extracción de ADN de alta calidad y puede ser útil en ciertas situaciones de diagnóstico o investigación donde la obtención de una cantidad suficiente de ADN con una calidad para la secuenciación de alto rendimiento es un desafío. Este protocolo es fácil de replicar con una demostración única.Primero se debe probar con un pequeño número de muestras para familiarizarse con el flujo de trabajo. Para empezar, hidratar las muestras de tejido del mosquito almacenadas en más del 70% de alcohol añadiendo 100 microlitros de agua de grado PCR e incubando durante una hora a cuatro grados centígrados para ablandar el tejido. Después de la incubación, deseche el agua y agregue 100 microlitros de la mezcla de enzimas tampón proteinasa K.A continuación, utilice un tubo de microcentrífuga pestle para homogeneizar el tejido. Después de la homogeneización, centrífuga el tejido se liste e incuba durante dos o tres horas a 56 grados centígrados. Para extraer el ADN,

a-magnetic-bead-based-mosquito-dna-extraction-protocol-for-next

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

Una forma rápida y asequible para extraer parásito calidad malaria y ADN del vector a partir de muestras de mosquitos se describe. Capitalizando en las propiedades quelantes de resina Chelex, el simple método permite el genotipado de parásitos de la malaria en mosquitos fases glándula del intestino medio y salivales, así como la identificación molecular de...

Un protocolo Chelex simple para la extracción de ADN a partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

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