Name: μTongue: Una plataforma de imágenes funcionales basada en microfluídica para la lengua in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende a realizar microscopía de fluorescencia intravital de células gustativas in vivo usando el sistema µTongue con microfluídica integrada. Este método permite el análisis funcional de respuestas a sabores dulce, umami y salado en ratones anestesiados.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Ciencias Básicas (IBS-R015-D1), la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2019M3A9E2061789) y por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2019M3E5D2A01058329). Agradecemos a Eunsoo Kim y Eugene Lee su asistencia técnica.

Todos los procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Sungkyunkwan y la Universidad Nacional de Seúl.
1. Preparación de soluciones: saliva artificial y saborizantes
<ol><li>Preparar saliva artificial disolviendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0.25 mM CaCl2, 0.25 mM MgCl2, 0.12 mM K2HPO4, 0.12 mM KH2PO4y 1.8 mM HCl en agua destilada (>1 L), y ajustar el pH de la solución a 7 (ver Tabla de Materiales)12.</li>
	<li>Prepare saborantes, como ácidos: 10 mM de ácido cítrico; salado: 400 mM NaCl, opcionalmente con amilorida de 50 μM; dulce: 40 mM acesulfamo K; amargo: una mezcla de 5 mM de quinina, 5 mM de denatonio y 20 μM de cicloheximida, disolviendo el producto químico de sabor en la saliva artificial preparada en la etapa 1.1.</li>
</ol>2. Preparación del sistema microfluídico
NOTA: Los tastantes se administraron a la lengua del ratón utilizando un sistema de administración fluídica multicanal presurizado (consulte la Figura 1 y la Tabla de Materiales).
<ol><li>Llene los depósitos del sistema de perfusión de flujo presurizado con saliva artificial y saborizantes.</li>
	<li>Conecte la línea de aire comprimido a la entrada del regulador y ajuste la presión de aire entre 30 y 50 psi en el sistema de suministro fluídico.</li>
	<li>Ajuste la presión de salida del regulador a 0,4 psi y compruebe si sale líquido del tubo bajo esta presión.</li>
	<li>Conecte el colector desde los depósitos al puerto de entrada de μTongue.</li>
	<li>Conecte el puerto de salida de μTongue a una bomba de jeringa y retire el líquido con ~300 μL∙min-1 para establecer la condición de estado estacionario. Observe el volumen constante de una gota colgante debajo de la μTongue. Ajuste el valor del parámetro de ajuste en función de la altura de la muestra.</li>
	<li>Desconecte la línea de aire comprimido y detenga la bomba de la jeringa hasta que se complete el paso 3 del protocolo.</li>
</ol>3. Preparación del ratón para imágenes in vivo (Figura 2).
NOTA: Todas las preparaciones de animales se llevaron a cabo durante el día en condiciones asépticas en un banco de trabajo de laboratorio.
<ol><li>Anestesia de ratón<ol>
<li>Prepare un ratón de 7 semanas de edad o más de cualquier sexo. Use una línea de ratón modificada genéticamente que exprese proteínas de fluorescencia sensibles al calcio en las células gustales.</li>
		<li>El ratón está sujeto para la anestesia. Se inyecta una mezcla de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina por vía intraperitoneal en elratón 13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>TRITC-dextrano (500 kDa) en solución salina tampón de fosfato al 2,5% W/V se administra por vía intravenosa en el ratón a través de una ruta retroorbital para observar la circulación sanguínea durante una sesión de imágenes.</li>
	<li>Coloque un fijador de cabeza en el cráneo del ratón para minimizar los artefactos de movimiento.<ol>
<li>La cabeza del ratón se rocía con un 70% de ETOH mientras que el ratón se coloca en posición supina. Levante la piel de la cabeza ligeramente con fórceps y recorte aproximadamente 7 mm2 con tijeras.</li>
		<li>Limpie el cabello alrededor del cuero cabelludo, retire el periostio debajo de la piel, aplique un adhesivo instantáneo al cráneo y coloque un fijador de cabeza personalizado.</li>
		<li>Después de endurecer el adhesivo instantáneo, aplique pegamento dental alrededor del fijador de cabeza e ilumine con una luz azul para solidificar el pegamento dental.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque la lengua del ratón en la unidad inferior de μTongue.<ol>
<li>Fije el labio inferior del ratón a la unidad inferior de μTongue con un adhesivo instantáneo.</li>
		<li>Coloque el ratón en la placa (tablero de preparación del ratón en la Figura 1B)y coloque la unidad inferior de la μTongue en los postes (μTongue hold post en la Figura 1B). Asegúrese de que los orificios en el borde de la unidad inferior estén alineados con el poste.</li>
		<li>Apriete el fijador de cabeza del ratón al soporte del fijador de cabeza en la placa. Luego, ajuste la distancia entre la cabeza del mouse y el dispositivo. Gire la cabeza del ratón suavemente aproximadamente 45° con el soporte fijador de cabeza. Este proceso evita el contacto físico de la nariz del ratón con el objetivo del microscopio.</li>
		<li>Dibuje la lengua del ratón suavemente con pinzas de plástico y fije el lado ventral de la lengua a la parte superior de la unidad inferior de la μTongue. Luego, limpie la superficie de la lengua del ratón con un hisopo de algodón húmedo.</li>
		<li>Remoje un pedazo de papel en la saliva artificial y colóquelo en la superficie expuesta de la lengua del ratón para mantener una condición húmeda.</li>
		<li>Coloque las arandelas curvas en los postes que sujetan ambos extremos de la parte inferior de μTongue.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque la preparación del ratón en el escenario del microscopio. Coloque la lengua de ratón expuesta debajo del centro aproximado del área objetivo del microscopio. Asegúrese de no desviarse del rango dinámico del escenario. Luego, apriete la placa del mouse en el escenario con tornillos.</li>
	<li>Coloque la almohadilla térmica debajo del cuerpo del ratón y mantenga la temperatura a 36.5 °C-37.5 °C. Controle la temperatura corporal del ratón con un sensor de temperatura y controle la temperatura de la almohadilla térmica utilizando una señal de retroalimentación del sensor de temperatura.</li>
	<li>Gire un trozo delgado de papel y colóquelo en la boca del ratón para evitar que el líquido entre en la tráquea del ratón.</li>
	<li>Retire el tejido húmedo de la lengua del ratón y coloque la μTongue preparada sobre la lengua del ratón. Coloque un canal microfluídico en la lengua y ajuste su posición para observar la superficie de la lengua a través de la ventana de imágenes.</li>
	<li>Asegure la μTongue atornillando suavemente en ambos extremos con una presión de compresión mínima.</li>
</ol>4. Adquisición de imágenes
<ol><li>Encienda el láser de dos fotones de 920 nm y el microscopio antes de su uso.</li>
	<li>Monte el objetivo de inmersión en agua (16x, NA 0.80 o 25x, NA 1.1) en el microscopio. Deje caer el agua destilada en la ventana de imagen de la μTongue y sumerja el objetivo.</li>
	<li>En el modo de cámara, encienda la luz con la lámpara de mercurio e ilumine la superficie de la lengua.</li>
	<li>Al ajustar el eje Z, busque la señal autofluorescente de las papilas filiformes para encontrar el plano focal aproximado. Luego, usando la perilla de ajuste X e Y, ubique una papila gustativa.</li>
	<li>Cambie al modo multifotón. Establezca las condiciones de adquisición de la imagen de la siguiente manera: longitud de onda de excitación: 920 nm; conjunto de filtros de emisión: 447/60 nm, 525/50 nm y 607/70 nm; modo de escaneo ráster bidireccional, tamaño de fotograma: 512 x 512.</li>
	<li>Ajuste las posiciones X e Y para colocar la papilas gustativas en el centro de la ventana de la imagen.</li>
	<li>Busque los vasos sanguíneos que rodean la papilas gustativas a aproximadamente dos tercios de altura de la papilas gustativas. Visualice la circulación sanguínea mediante la inyección de TRITC-dextrano (500 kDa) a partir del paso 3.2 del protocolo. Si el flujo sanguíneo se obstruye, afloje ligeramente los tornillos de fijación para permitir el flujo sanguíneo.</li>
	<li>Ajuste el eje Z y encuentre el plano Z de la papila gustativa que contenga un número adecuado de células gustativas.</li>
	<li>Proceda con imágenes de calcio con 2-6 Hz durante 80 s. Proporcione una solución de sabor de 20 s encendiendo el depósito del sistema fluídico después de que comiencen las imágenes. Después de 20 s de estimulación del gusto, cambie el reservorio de nuevo a saliva artificial.</li>
	<li>Una vez finalizada la toma de imágenes secuenciales, espere unos 3-4 minutos antes de la siguiente sesión de imágenes. Mantenga la saliva artificial fluyendo a la lengua del ratón para eliminar el remanente sabroso de la sesión de imágenes anterior. Dependiendo del diseño del experimento, repita la sesión según sea necesario.</li>
	<li>Cuando se completen las imágenes de calcio in vivo, eutanasiar al ratón de acuerdo con el procedimiento IACUC. El ratón bajo anestesia se sacrifica en la cámara de CO2. NOTA: Compruebe la profundidad de la anestesia utilizando un reflejo de pellizco del dedo del dedo del dedo del tudo. Durante una sesión de imágenes, la saliva artificial de los reservorios debe proporcionarse de manera consistente. Si aparecen burbujas en la ventana de imagen de la μTongue, retire las burbujas empujándolas a través de la entrada o la salida de la μTongue utilizando una fuerte presión de líquido.</li>
</ol>5. Análisis de imágenes (Figura 3)
<ol><li>Conversión de imágenes<ol>
<li>Abra los archivos de imagen sin procesar utilizando Fiji14 o un software de análisis de imágenes similar.</li>
		<li>Convierta el archivo de imagen en un archivo de pila RGB para utilizar el código NPL Bud Analyzer.<ol>
<li>Imagen > color > canales divididos</li>
			<li>
Imagen > Color > Combinar canales y seleccione la imagen en el paso 5.2.1.</li>
			<li>Imagen > color > pila a RGB</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registro de imágenes Nota : utilice el código escrito personalizado para el análisis de datos. Consulte https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.<ol>
<li>Ejecute el código denominado Taste_GUI.m; aparecerá una ventana de GUI llamada NPL Bud Analyzer. Haga clic en el botón Nuevo análisis en la esquina superior derecha y, a continuación, cargue la imagen convertida del paso 5.1. Establezca la velocidad de fotogramas por encima de la imagen cargada.</li>
		<li>Dibuje la región de interés (ROI) sobre la imagen cargada para el registro. Haga doble clic en el ROI seleccionado y se iniciará un registro calculado automáticamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Obtener los cambios relativos de intensidadde fluorescencia (ΔF/F)<ol>
<li>Vuelva a la ventana NPL Bud Analyzer para mostrar automáticamente la imagen registrada del paso 5.2. Si el usuario ya tiene un archivo reg, haga clic en el botón Cargar datos y seleccione el archivo _reg.tif.</li>
		<li>Haga clic en el botón CIRCLE o POLYGON y coloque el ROI de la célula gustativa sobre la imagen de la papilas gustativas.</li>
		<li>Esto presenta la intensidad de fluorescencia en bruto y el rastro de calcio (ΔF/F)de la célula gustativa seleccionada automáticamente debajo de la imagen de la papilas gustativas.</li>
		<li>Haga clic en Guardar rastro para presentar el rastro de calcio (ΔF/F)en el lado derecho de la GUI, mientras que el ROI se muestra sobre la imagen de la papila gustativa. Repita los pasos 5.3.2-5.3.4 hasta que finalice la selección del ROI. NOTA: Haga clic en el botón Eliminar seguimiento si el ROI está mal seleccionado para eliminar el último ROI y el seguimiento de calcio seleccionados.</li>
		<li>Una vez finalizada la selección del ROI, escriba el nombre del archivo en la esquina inferior derecha y haga clic en el botón Finalizar para exportar el rastro de calcio ΔF/F como un formato .xls, y la imagen tase bud con ROI en un formato .bmp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Análisis del rastro de calcio<ol>
<li>Analizar el rastro de calcio obtenido del paso 5.3. Considere que las células gustales han reaccionado al sabor cuando la intensidad de fluorescencia aumenta más de dos desviaciones estándar de la línea de base después de que se entrega elsaborante 4, y los valores de pson inferiores a 0.01, utilizando pruebas t pareadas o no emparejadas10.</li>
		<li>Considere la célula gusta gustante como una célula respondedora, si responde a un determinado sabor más de dos veces de tres ensayos (~ 60%)15.</li>
		<li>Obtenga los rastros de calcio representativos promediando los rastros de calcio individuales adquiridos a partir del paso 5.4.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li>
<li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+microscopy%3A+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li>
<li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Ca2%2B+imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li>
<li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li>
<li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li>
<li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li>
<li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+salt+recruits+aversive+taste+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li>
<li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li>
<li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li>
<li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li>
<li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+%2F+6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BME+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li>
<li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+anion+in+salt+%28NaCl%29+detection+by+mouse+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li>
<li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran intereses financieros contrapuestos: J. Han y M. Choi son inventores de la tecnología patentada μTongue descrita en este artículo, y el sistema μTongue está disponible comercialmente a través de SciTech Korea.

Aquí se describe un protocolo detallado para aplicar μTongue a la investigación de las actividades funcionales de las células gustativas in vivo. En este protocolo, se realiza la imagen funcional en las células gustales utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente. Además del uso de ratones transgénicos, la carga electroforética de colorantes de calcio (o colorantes sensibles al voltaje) en las células gustativas puede ser una opción alternativa.
En este experimento se u...

El microscopio de fluorescencia intravital se utiliza ampliamente para estudiar la dinámica espaciotemporal en los tejidos vivos. Los investigadores están desarrollando rápidamente sensores codificados genéticamente que proporcionan transformaciones específicas y sensibles de los procesos biológicos en señales de fluorescencia, que se pueden registrar fácilmente utilizando microscopios de fluorescencia que están ampliamente disponibles1,2. Aunque la mayoría de los órganos internos en roedores se han investigado utilizando el microscopio, su aplicación exitosa a la lengua aún no ha tenido éxito3.
Estudios previos sobre la imagen de calcio de las células gustativas se realizaron ex vivo mediante la sección delgada de un tejido de la lengua para obtener papilas gustativas circunvaladas4,5,6 omediante la descamación del epitelio gustativo para obtener papilas gustativas fungiformes7,8. La preparación de estas muestras fue inevitablemente invasiva, por lo que los microambientes naturales, como la inervación nerviosa, las barreras de permeabilidad y la circulación sanguínea, se perturbaron en gran medida. La primera ventana de imágenes de la lengua intravital fue reportada en 2015 por Choi et al., pero no se pudo lograr un registro funcional confiable debido al movimiento y los artefactos ópticos causados por los estímulos de sabor fluídico9.
Recientemente, se introdujo la microfluídica en una lengua (μTongue)10. Este dispositivo integra un sistema microfluídico con una ventana de imágenes en la lengua del ratón. Al lograr un flujo de estado cuasi-estacionario de estímulos saborantes a lo largo del período de imagen, los artefactos del movimiento fluídico podrían minimizarse(Figura 1). El puerto de entrada es alimentado por una serie de controladores de presión multicanal, mientras que el puerto de salida está conectado a una bomba de jeringa, que mantiene 0,3 ml / min. Además, los artefactos ópticos causados por la diferencia en los índices de refracción de las soluciones de sabor se minimizaron mediante el análisis ratiométrico introduciendo un indicador insensible al calcio (tdTomato), así como el indicador de calcio (GCaMP6)11. Este diseño proporcionó estabilidad microscópica de las células gustales in vivo incluso con un cambio abrupto entre canales fluídicos. En consecuencia, la μTongue implementa un cribado funcional fiable de múltiples saborantes a las papilas gustativas del ratón in vivo.
En este protocolo, los procedimientos experimentales se explican en detalle para la obtención de imágenes de calcio de las papilas gustativas fungiformes del ratón in vivo utilizando μTongue. En primer lugar, se describe la preparación de saliva artificial y soluciones sabrosas. En segundo lugar, se introduce la configuración del sistema microfluídico para lograr el flujo de estado cuasi estacionario. En tercer lugar, se delinean los procedimientos utilizados para montar la lengua del ratón en la lengua μ para permitir la adquisición de imágenes. Por último, se especifica cada paso para el análisis de imágenes, incluida la corrección de artefactos de movimiento lateral y la ratiometría. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a cualquier laboratorio de investigación con una instalación de ratón y un microscopio de dos fotones o equipo equivalente.

<table><tbody><tr><td>acesulfamo K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04054-25G</td><td>Saliva artificial / solución</td></tr><tr><td>de cloruro de calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>Saliva artificial / ácido</td></tr><tr><td>cítrico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-100G</td><td>Saliva artificial /</td></tr><tr><td>cicloheximida</td> tastant <td>Sigma Aldrich</td><td>01810-5G</td><td>Saliva artificial / tastant</td></tr><tr><td>denatonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5765-5G</td><td>Saliva artificial / Tastant</td></tr><tr><td>Pegamento dental</td><td>Denkist</td><td>P0000CJT-A2</td><td>Preparación animal</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td>Análisis de datos</td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57510-5G</td><td>Saliva artificial / saborizante</td></tr><tr><td>Adhesivo instantáneo</td><td>Loctite Loctite</td><td>4161, Henkel</td><td>Preparación animal</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-100G</td><td>Saliva artificial / tasant</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td>Saliva artificial / tastant</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Yuhan</td><td>Ketamine 50</td><td>Preparación animal</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td>Saliva artificial / tastant</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>237205-500G</td><td>Artificial saliva / tastant</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathwork</td><td>MATLAB</td><td>Análisis de datos</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>Saliva artificial / tastant</td></tr><tr><td>MPG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>Saliva artificial / tastant</td></tr><tr><td>Microscopio Mutiphoton</td><td>Thorlab</td><td>&nbsp; Microscopio Bérgamo II</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Saliva artificial / tastant</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>792519-500G</td><td>Saliva artificial / tastant</td></tr><tr><td>Objetivo</td><td>Nikon</td><td>Microscopio</td><td>N16XLWD-PF</td></tr><tr><td>Octaflow</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>OCTAFLOW II</td><td>Control de fluidos</td></tr><tr><td>PC</td><td>LG</td><td>Lg15N54</td> Medidor de pH de <td>control de fluidos</td></tr><tr><td></td><td>Thermoscientific</td><td>ORION STAR AZ11</td><td>Saliva artificial / tasante</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806562</td><td>Saliva artificial / Quinina Tastant</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>Q1125-5G</td><td>Saliva artificial / Bomba</td>de</tr><tr><td>jeringa</td><td>Havard Apparatus</td><td>PHD ULTRA 4400</td><td>Control de fluidos</td></tr><tr><td>TRITC-dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52194-1G</td><td>Preparación animal</td></tr><tr><td>Láser de fibra ultrarrápido</td><td>Toptica</td><td>FFultra920 01042</td><td>Microscopio</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Bayer Corea</td><td>Rompun</td><td>Preparación animal</td></tr></tbody></table>

μtongue: una plataforma de imágenes funcionales basada en microfluídica para la lengua in vivo

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

La microscopía de fluorescencia intravital es una herramienta ampliamente utilizada para estudiar la dinámica multicelular en un animal vivo. Sin embargo, no se ha utilizado con éxito en el órgano sensorial del gusto. Al integrar la microfluídica en la ventana de imágenes de la lengua intravital, la μTongue proporciona imágenes funcionales confiables de las células gustativas in vivo bajo exposición controlada a múltiples saborantes. En este documento, se presenta un procedimiento detallado paso a paso para utilizar el sistema μTongue. Hay cinco subsecciones: preparación de soluciones de sabor, configuración de un módulo microfluídico, montaje de muestras, adquisición de datos de imágenes funcionales y análisis de datos. También se presentan algunos consejos y técnicas para resolver los problemas prácticos que pueden surgir al usar la μTongue.

El ratón Pirt-GCaMP6f-tdTomato se utilizó para obtener una imagen de papilas gustativas. La superficie de la lengua del ratón estaba cubierta con papilas filiformes autofluorescentes. Las papilas gustativas se extienden escasamente sobre la superficie de la lengua(Figura 4A). Las imágenes de la papilas gustativas y su estructura se adquirieron utilizando tres detectores de filtro diferentes. Utilizando el conjunto de filtros de 607/70 nm, se obtuvo la señal tdTomato de las células gustales p...

El artículo presenta el dispositivo μTongue (microfluídica en una lengua) para imágenes funcionales de células gustativas in vivo mediante la integración de microfluídica en una ventana de imágenes intravitales en la lengua.

μTongue: Una plataforma de imágenes funcionales basada en microfluídica para la lengua in vivo

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Este protocolo permite observar las funciones de las células gustales en un microambiente natural con conexiones neuronales y circulación sanguínea que permanecen intactas. Usando esta técnica, la comunicación de célula a célula se puede investigar in vivo. Para comenzar, llene los reservorios del sistema de perfusión de flujo presurizado con saliva artificial y saborizantes.Conecte la línea de aire comprimido a la entrada del regulador y ajuste la presión de aire en el sistema de suministro fluídico a 30 a 50 libras por pulgada cuadrada. Ajuste la presión de salida del regulador a 0.4 libras por pulgada cuadrada y verifique si el líquido comienza a fluir desde el tubo. Conecte el colector de los depósitos al puerto de entrada de la micro lengua, luego conecte el puerto de salida de la micro lengua a una bomba de jeringa y retire el líquido a aproximadamente 300 microlitros por minuto para establecer una condición de estado estacionario.Confirme que el volumen de la gota que cuelga debajo de la micro lengua permanezca constante y ajuste la presión de aire y el caudal para obtener la altura de muestra deseada. Una vez que se haya configurado el sistema microfluídico, desconecte la línea de aire comprimido y apague la bomba de la jeringa hasta que el ratón se haya preparado para la obtención de imágenes in vivo. Después de administrar anestesia al ratón, inyecte TRITC-dextrano por vía intravenosa a través de una ruta retroorbital para observar la circulación sanguínea durante las imágenes.Con el ratón colocado en posición supina, rocíe etanol al 70% en su cabeza. Use pinzas para levantar la piel de la cabeza ligeramente, luego use tijeras para cortar aproximadamente siete milímetros cuadrados de piel. Después de limpiar el cabello alrededor del cuero cabelludo, retire el periostio de debajo de la piel y aplique un adhesivo instantáneo en el cráneo.A continuación, conecte el fijador de cabeza personalizado. Una vez que el adhesivo instantáneo se endurece, aplique pegamento dental alrededor del fijador de cabeza y solidifíquelo mediante iluminación con una luz azul. Usando adhesivo instantáneo para pegar el labio inferior del ratón a la unidad inferior de la micro lengua, luego coloque el ratón en la placa de preparación del ratón y asegure la unidad inferior en la micro lengüeta a los postes de sución alineando los orificios en el borde de la micro lengua con los postes.Apriete el fijador de cabeza del ratón en el soporte del fijador de cabeza en la placa y ajuste la distancia entre el cabezal del ratón y el dispositivo. Luego, usando el soporte fijador de cabeza, gire la cabeza del mouse suavemente en aproximadamente 45 grados. Después de asegurar el mouse a la tabla, use pinzas de plástico para dibujar su lengua suavemente.Luego, usando adhesivo instantáneo, conecte el lado ventral de la lengua al lado superior de la unidad inferior de la micro lengua. Para mantener la lengua húmeda, limpie la superficie con un hisopo de algodón húmedo, luego coloque un trozo de tejido empapado en saliva artificial en la superficie expuesta de la lengua. Coloque las arandelas curvas en los postes, sosteniendo la parte inferior de la micro lengua, luego mueva la preparación del mouse a la etapa de microscopio.Coloque la lengüeta expuesta del ratón debajo del centro aproximado del área objetivo del microscopio, asegurándose de no desviarse del rango dinámico del escenario, luego apriete los tornillos para unir firmemente la placa del mouse en el escenario. Coloque una almohadilla térmica debajo del mouse para mantener su temperatura corporal entre 36.5 y 37.5 grados centígrados. Para evitar que el líquido entre en la tráquea del ratón, coloque un trozo delgado de papel retorcido dentro de la boca del ratón, luego retire el tejido húmedo colocado en la superficie de la lengua y coloque la micro lengua preparada en la lengua del ratón, de modo que la superficie de la lengua sea visible a través de la ventana de imágenes.Asegure la micro lengüeta atornillando suavemente ambos extremos con una presión de compresión mínima. Para comenzar a adquirir imágenes, abra el software del microscopio y luego encienda el láser de dos fotones de 920 nanómetros. Monte el objetivo de inmersión en agua en el microscopio, luego baje el objetivo en la ventana de imágenes de la micro lengua y sumerja el objetivo.En el modo de cámara, ilumine la superficie de la lengua encendiendo la luz azul de una lámpara de mercurio. Para encontrar el plano focal aproximado, ajuste el eje Z y busque una señal de autofluorescencia de las papilas filiformes. Luego, usando la perilla de ajuste X e Y, ubique una papila gustativa.Cambie al modo multi fotones y, a continuación, configure la longitud de onda de excitación, el conjunto de filtros de emisión, el modo de escaneo y el tamaño del fotograma para la adquisición de imágenes. Con la papila gustativa en el centro de la ventana de imágenes, ubique los vasos sanguíneos que rodean la papila gustativa a aproximadamente dos tercios de la altura de la papila gustativa y visualice la circulación sanguínea. Si el flujo sanguíneo está obstruido, afloje ligeramente los tornillos de fijación para reanudar el flujo sanguíneo.Ajuste el eje Z para encontrar el plano Z de una papila gustativa que contenga un número adecuado de células gustativas, luego proceda con imágenes de calcio de dos a seis Hertz durante 80 segundos. Después de que comiencen las imágenes, encienda el depósito del sistema fluídico para proporcionar una solución de sabor durante 20 segundos. Después de 20 segundos de estimulación del gusto, cambie el reservorio de nuevo a saliva artificial.Durante la obtención de imágenes, espere entre tres y cuatro minutos entre sesiones proporcionando saliva artificial constantemente para mantener la lengua húmeda y lavar el sabor restante de la sesión anterior. La superficie de la lengua del ratón Pirt-GCaMP6f-tdTomato está cubierta con papilas filiformes autofluorescentes y papilas gustativas escasamente extendidas. Las papilas filiformes en amarillo se capturan utilizando un fotodetector a 500 a 550 nanómetros y se pueden observar desde la superficie misma de la lengua hasta aproximadamente 25 micrómetros de profundidad.Las señales GCaMP en verde detectadas por el filtro de 500 a 550 nanómetros y las señales tdTomato en rojo, detectadas por el filtro de 607 a 670 nanómetros, representan las células gustales. La señal tdTomato se obtiene para el análisis métrico de la relación. Los vasos sanguíneos que rodean la papilas gustativas se adquieren utilizando el filtro de 500 a 550 nanómetros establecido en el tejido conectivo de colágeno, que estructuralmente soporta la papilas gustativas, se adquiere utilizando el conjunto de filtros de 447 a 460 nanómetros.En este ejemplo representativo de detección de sabor in vivo utilizando imágenes de calcio, cada célula gusta gusta gustar está demarcada por líneas discontinuas. En este ensayo, la célula 2 respondió a los sabores dulces y umami. Y la celda 3 respondió a los sabores bajos y altos en sal.Ninguna de las células de esta papila gustativa respondió a los sabores agrios. Dado que el propósito de este experimento es observar la función celular de los sabores en el entorno natural, es importante administrar los fluorescentes en los vasos sanguíneos en la etapa de preparación y confirmar su circulación durante el experimento.

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μTongue: Una plataforma de imágenes funcionales basada en microfluídica para la lengua in vivo

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