Name: Montaje con temperatura controlada y caracterización de una bicapa de interfaz de gota (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Aprende a montar y caracterizar bicapas de interfaz de gota con control térmico preciso. Este método permite estudiar propiedades de membranas biomiméticas a diferentes temperaturas usando extractos lipídicos naturales.

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El apoyo financiero fue proporcionado por la Subvención de la Fundación Nacional de Ciencias CBET-1752197 y la Beca de la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea FA9550-19-1-0213.

Los autores no tienen conflictos de intereses.

El protocolo descrito aquí proporciona instrucciones para ensamblar y operar un sistema experimental para controlar la temperatura del aceite y las gotas utilizadas para formar DIBs. Es especialmente beneficioso para permitir la formación de DIB utilizando lípidos que tienen temperaturas de fusión por encima de RT. Por otra parte, variando con precisión la temperatura del depósito de aceite, la temperatura de la bicapa puede ser manipulada para estudiar los efectos de las temperaturas elevadas sobre diversas propiedades ...

Las membranas celulares son barreras selectivamente permeables compuestas por miles de lípidos tipo1,proteínas, carbohidratos y esteroles que encapsulan y subdividen todas las células vivas. Comprender cómo sus composiciones afectan sus funciones y revelar cómo las moléculas naturales y sintéticas interactúan, se adhieren, interrumpen y translocan las membranas celulares son, por lo tanto, áreas importantes de investigación con implicaciones de amplio alcance en biología, medicina, química, física e ingeniería de materiales.
Estos objetivos para el descubrimiento se benefician directamente de las técnicas probadas para ensamblar, manipular y estudiar las membranas modelo, incluidas las bicapas lipídicas ensambladas a partir de lípidos sintéticos o naturales, que imitan la composición, la estructura y las propiedades de transporte de sus contrapartes celulares. En los últimos años, el método2,3,4 de la bicapa de interfaz de gotitas (DIB) para construir una bicapa lipídica plana entre gotas de agua recubiertas de lípidos en aceite ha recibido una atención significativa5,6,7,8,9,10, 11,12,13, 14,15, 16,17, 18,19,20,21,22,23,y ha demostrado ventajas prácticas sobre otros enfoques para la formación de membranas modelo: el método DIB es fácil de realizar, no requiere fabricación o preparación sofisticada (por ejemplo, "pintura") de un sustrato para soportar la membrana, produce consistentemente membranas con membranas superiores longevidad, permite mediciones electrofisiología estándar, y simplifica la formación de membranas modelo con composiciones asimétricas de foliolos3. Debido a que la bicapa se forma espontáneamente entre las gotitas y cada gotita se puede adaptar en posición y composición, la técnica DIB también ha atraído un interés considerable en el desarrollo de sistemas de materiales inspirados en las células que se basan en el uso de membranas sensibles a losestímulos18,24,25, 26,27, 28,29,compartimentación y transporteequilibrados 14,30, 31,y materiales similares a los tejidos17,23,32,33,34,35,36.
La mayoría de los experimentos publicados en membranas modelo, incluidas aquellas con DIBs, se han realizado a temperatura ambiente (RT, ~ 20-25 ° C) y con un puñado de lípidos sintéticos (por ejemplo, DOPC, DPhPC, etc.). Esta práctica limita el alcance de las preguntas biofísicas que se pueden estudiar en membranas modelo y, basándose en la observación, también puede restringir los tipos de lípidos que se pueden utilizar para ensamblar DIBs. Por ejemplo, un lípido sintético como dppc, que tiene una temperatura de fusión de 42 °C, no ensambla monocapas apretadas ni forma DIBs aRT 37. La formación de DIB a temperatura ambiente también ha resultado difícil para los extractos naturales, como los de mamíferos (por ejemplo, extracto lipídico total cerebral, BTLE)38 o bacterias (por ejemplo, extracto lipídico total de Escherichia coli, ETLE)37,que contienen muchos tipos diferentes de lípidos y se originan en células que residen a temperaturas elevadas (37 °C). Por lo tanto, permitir el estudio de diversas composiciones brinda oportunidades para comprender los procesos mediados por membranas en condiciones biológicamente relevantes.
Elevar la temperatura del aceite puede servir para dos propósitos: aumenta la cinética del ensamblaje de monocapas y puede hacer que los lípidos se sometan a una transición de fusión para alcanzar una fase desordenada líquida. Ambas consecuencias ayudan en el montaje monocapa39, un requisito previo para un DIB. Además del calentamiento para la formación de bicapas, el enfriamiento de la membrana después de la formación se puede utilizar para identificar transiciones dermatotrópicas en bicapas lipídicas individuales38,incluidas las de mezclas lipídicas naturales (por ejemplo, BTLE) que pueden ser difíciles de detectar mediante calorimetría. Además de evaluar las transiciones termotrópicas de los lípidos, la variación precisa de la temperatura del DIB se puede utilizar para estudiar los cambios inducidos por la temperatura en la estructura de la membrana38 y examinar cómo la composición lipídica y la fluidez afectan a la cinética de las especies activas en la membrana (por ejemplo, péptidos formadores de poros y proteínas transmembrana37),incluidas las membranas modelo de mamíferos y bacterias a una temperatura fisiológicamente relevante (37 °C).
Aquí, se explicará una descripción de cómo ensamblar un depósito de aceite DIB modificado y operar un controlador de temperatura de retroalimentación para permitir el ensamblaje de monocapas y la formación de bicapas a temperaturas superiores a RT. A diferencia de un protocolo anterior40,se incluye detalle explícito respecto a la integración de la instrumentación necesaria para medir y controlar la temperatura en paralelo al montaje y caracterización del DIB en el depósito de aceite. Por lo tanto, el procedimiento permitirá a un usuario aplicar este método para formar y estudiar DIBs en un rango de temperaturas en una variedad de contextos científicos. Además, los resultados representativos proporcionan ejemplos específicos para los tipos de cambios medibles tanto en la estructura de la membrana como en el transporte de iones que pueden ocurrir a medida que se varía la temperatura. Estas técnicas son adiciones importantes a los muchos estudios biofísicos que se pueden diseñar y realizar con eficacia en DIBs, incluyendo el estudio de la cinética de especies membrana-activas en diversas composiciones de la membrana.

<table><tbody><tr><td>25 mm x 40 mm x 1 mm caucho aislante (x2)</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Aísla la parte inferior del accesorio de aluminio de la platina del microscopio</td></tr><tr><td>25 mm x 40 mm x 6 mm caucho aislante (x2)</td><td>Cualquiera</td><td></td><td>Protege los elementos calefactores de daños causados por los clips de la platina del microscopio y aísla la parte superior de los elementos calefactores.</td></tr><tr><td>Ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3183</td><td>Agente amortiguador para solución lipídica</td></tr><tr><td>Sustrato acrílico</td><td>Fabricado internamente</td><td></td> <td>HTD_STG_2~1000 uL pozo acrílico con un perfil exterior poka-yoke para fijar la orientación</td></tr><tr><td>Accesorio de aluminio</td><td>Fabricado en casa</td><td>HTD_STG_1</td><td>Accesorio base con un pozo de aceite que sostiene el accesorio acílico e incluye dos almohadillas planas adyacentes al pozo de petróleo para los elementos calefactores&nbsp;</td></tr><tr><td>Extracto de lípidos totales para el cerebro</td><td>Avanti</td><td>131101C-100mg</td><td>25 mg/mL extracto de lípidos porcinos&nbsp;</td></tr><tr><td>Chasis DAQ compacto (cDAQ)</td><td>National Instruments&nbsp;</td><td>cDAQ-9174&nbsp;</td><td>Chasis para alojar múltiples tipos de sensores, medición o módulos de salida</td></tr><tr><td>Sistema de Adquisición de Datos (DAQ)</td><td>Dispositivos Moleculares&nbsp;</td><td>Digidata 1440A&nbsp;</td><td>Convertidor de analógico a digital de alta resolución</td></tr><tr><td>Amplificador/fuente de alimentación de ganancia fija</td><td>Hewlitt Packard</td><td>HP 6826A</td><td>Amplifica la salida de voltaje de CC desde el módulo de salida de voltaje</td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio Deslizamiento</td><td>Corning</td><td>CLS284525</td><td>Sella la parte inferior de la base de aluminio y permite la caracterización óptica de la bicapa</td></tr><tr><td>Elemento calefactor (x2)</td><td>Omega</td><td>KHLV-101/5</td><td>Elemento calefactor kapton de película de poliamida de 25 mm x 25 mm con un límite de potencia de 5 vatios.</td></tr><tr><td>Tornillo de acero inoxidable M3</td><td>McMaster Carr</td><td>90116A150</td><td>Asegura el termopar al accesorio de aluminio</td></tr><tr><td>Amplificador de abrazadera de parche</td><td>Dispositivos moleculares&nbsp;</td><td>AxoPatch 200B&nbsp;</td><td>Mide la corriente y emite el voltaje a la cabecera</td></tr><tr><td>Computadora personal</td><td>Cualquier</td><td></td><td>computadora con múltiples puertos usb de alta velocidad y un mínimo de 6 Gb de RAM</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>Solución electrolítica de iones disociados Módulo de</td></tr><tr><td>entrada de temperatura</td><td>National Instruments&nbsp;</td><td>NI 9211</td><td>Permite mediciones de termopar de unión abierta y fría para el chasis cDAQ</td></tr><tr><td>Termopar</td><td>Omega</td><td>JMTSS-020U-6&nbsp;</td><td>Termopar tipo U con un diámetro de 0,02 pulgadas y 6 pulgadas de largo</td></tr><tr><td>Adhesivo curable UV</td><td>Loctite</td><td>19739</td><td>Asegura el cubreobjetos de vidrio al accesorio de base de aluminio</td></tr><tr><td>Módulo de salida de voltaje</td><td>National Instruments&nbsp;</td><td>NI 9263</td><td>Módulo de salida de voltaje analógico para usar con el generador de forma de onda del chasis cDAQ</td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>33210A&nbsp;</td><td>Se utiliza para emitir una forma de onda sinusoidal de 10 mV 10 Hz</td></tr></tbody></table>

montaje con temperatura controlada y caracterización de una bicapa de interfaz de gota

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

El método de la bicapa de interfaz de gotitas (DIB) para ensamblar bicapas lipídicas (es decir, DIB) entre gotitas acuosas recubiertas de lípidos en aceite ofrece beneficios clave en comparación con otros métodos: los DIB son estables y a menudo duraderos, el área de la bicapa se puede ajustar reversiblemente, la asimetría de las valvas se controla fácilmente a través de composiciones de gotitas, y las redes de bicapas similares a tejidos se pueden obtener al contiguas muchas gotitas. La formación de DIBs requiere el ensamblaje espontáneo de lípidos en monocapas lipídicas de alta densidad en las superficies de las gotitas. Mientras que esto ocurre fácilmente a temperatura ambiente para los lípidos sintéticos comunes, una monocapa suficiente o bicapa estable no puede formarse en condiciones similares para los lípidos con puntos de fusión por encima de la temperatura ambiente, incluyendo algunos extractos celulares del lípido. Este comportamiento probablemente ha limitado las composiciones y quizás la relevancia biológica de los DIB en los estudios de membranas modelo. Para abordar este problema, se presenta un protocolo experimental para calentar cuidadosamente el depósito de aceite que alberga gotas dib y caracterizar los efectos de la temperatura sobre la membrana lipídica. Específicamente, este protocolo muestra cómo utilizar un accesorio de aluminio térmicamente conductor y elementos de calentamiento resistivos controlados por un bucle de retroalimentación para prescribir temperaturas elevadas, lo que mejora el ensamblaje de monocapas y la formación de bicapas para un conjunto más amplio de tipos de lípidos. Las características estructurales de la membrana, así como las transiciones de fase termotrópicas de los lípidos que componen la bicapa, se cuantifican midiendo los cambios en la capacitancia eléctrica del DIB. En conjunto, este procedimiento puede ayudar en la evaluación de fenómenos biofísicos en membranas modelo a lo largo de varias temperaturas, incluida la determinación de una temperatura de fusión efectiva(TM)para mezclas de lípidos multicomponente. Por lo tanto, esta capacidad permitirá una replicación más cercana de las transiciones de fase naturales en las membranas modelo y fomentará la formación y el uso de membranas modelo de una franja más amplia de componentes de la membrana, incluidos aquellos que capturan mejor la heterogeneidad de sus contrapartes celulares.

La Figura 1 muestra cómo el accesorio de aluminio y el depósito de aceite acrílico se preparan en la etapa de microscopio para la formación de DIB. Los pasos de montaje 1.2-1.4 sirven para aislar térmicamente el accesorio del escenario para una calefacción más eficiente. Los pasos 1.5-1.7 muestran cómo conectar correctamente el termopar al accesorio y colocar el depósito de aceite, y los pasos 1.8-1.9 muestran las ubicaciones recomendadas para dispensar aceite en estos pedazos.
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Este protocolo detalla el uso de un sistema de calentamiento de temperatura controlada de retroalimentación para promover el ensamblaje de monocapas lipídicas y la formación de bicapas de interfaz de gotitas para lípidos con temperaturas de fusión elevadas, y mediciones de capacitancia para caracterizar los cambios impulsados por la temperatura en la membrana.

Montaje con temperatura controlada y caracterización de una bicapa de interfaz de gota

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

Este protocolo permite a los investigadores calentar con precisión una bicapa de interfaz de gotas, o DIB, modelo de membrana, lo que permite estudiar una variedad de efectos relacionados con la temperatura que ocurren en entornos celulares. La ventaja principal se deriva de la capacidad de medir y controlar localmente la temperatura del baño en un depósito de bajo volumen sin obstruir el acceso para las caracterizaciones eléctricas u ópticas del DIB. La capacidad de calentar con precisión el baño de fluidos abre la posibilidad de estudiar las propiedades de transporte y señalización en dibs formados a partir de una variedad mucho más amplia de componentes de membrana, incluyendo extractos celulares naturales.Este es un protocolo de varios pasos que aprovecha múltiples equipos que deben seguirse de cerca para lograr suficiente precisión experimental, por lo que cualquier ambigüedad en el proceso escrito se puede aclarar a través de la demostración visual. Para comenzar, reúna dos piezas de caucho aislante de un milímetro de espesor recortadas a 25 por 40 milímetros de longitud, dos piezas de una goma de seis milímetros de espesor que también son de 25 por 40 milímetros, un conjunto de accesorios de base de aluminio preparados y un depósito de aceite acrílico que cabe en la ventana de visualización del accesorio de base de aluminio. Coloque las piezas de goma más delgadas en la etapa del microscopio de tal manera que el borde largo de cada pieza sea tangencial a la abertura de la etapa.Coloque el accesorio de base de aluminio en la parte superior de las almohadillas aislantes con la ventana de visualización del accesorio centrada sobre la lente objetivo. Coloque una pieza de goma más gruesa en la parte superior de cada elemento de calentamiento resistivo, luego use un clip de etapa de microscopio para mantenerlo en su lugar para proteger los elementos de calefacción de los daños causados por los clips de la etapa y para aislar contra el cortocircuito eléctrico accidental. Doble cuidadosamente el extremo de medición de un termopar para lograr un ángulo de 90 grados a unos cuatro milímetros del extremo.Inserte la punta doblada del termopar en la esquina inferior izquierda del accesorio de aluminio y alíquelo suavemente con un tornillo de bloqueo. Coloque el depósito de acrílico en el pozo del accesorio de aluminio antes de agregar aceite de hexadecano al pozo del accesorio de aluminio para minimizar el riesgo de atrapar burbujas de aire entre la ventana de visualización y la parte inferior del depósito de acrílico. Dispense alrededor de 1, 000 microlitros de aceite de hexadecano en el pozo del accesorio de aluminio para proporcionar un área de superficie máxima para que se produzca la transferencia de calor, sin permitir que el aceite se derrame sobre los bordes del accesorio en la etapa del microscopio o la lente objetiva.Dispense alrededor de 1,000 microlitros de aceite de hexadecano en el depósito de acrílico sin llenarlo en exceso. Mida la capacitancia nominal de la membrana mientras reduce la temperatura del baño de aceite desde un punto de ajuste que permita la formación de bicapas para identificar las transiciones de fase termotrópicas de los lípidos en la membrana. Haga clic con el botón derecho en el gráfico de temperatura de la GUI y borre los datos de visualización para asegurarse de que hay suficiente espacio disponible en el búfer para grabaciones posteriores.Utilizando el generador de forma de onda conectado al amplificador de abrazadera de parche, aplique una forma de onda de voltaje triangular a través de los electrodos de la interfaz de gota, o DIB, y registre la respuesta de corriente inducida a través de la bicapa. Enfríe la bicapa reduciendo la temperatura del punto de ajuste en incrementos de cinco grados, esperando un mínimo de cinco minutos a la nueva temperatura de estado estacionario entre los cambios de temperatura hasta que se logre la temperatura deseada. Después del baño de aceite y enfriar la bicapa a la temperatura mínima deseada, haga clic con el botón derecho en el gráfico de temperatura en la GUI nuevamente y exporte los datos de temperatura versus tiempo a un software de hoja de cálculo.Detenga la grabación actual. A partir de la corriente medida, calcule la capacitancia nominal de la respuesta de la corriente de onda cuadrada en comparación con el tiempo durante el período de enfriamiento. Trace la capacitancia nominal versus la temperatura para observar cómo cambió la capacitancia de la membrana, luego localice los cambios no monótonos en la capacitancia versus la temperatura para identificar la temperatura de fusión.Del mismo modo, evalúe la capacitancia cuasi estática específica de la bicapa a temperaturas fijas incrementando sucesivamente la temperatura del baño de aceite y el área de la bicapa. Cambie la temperatura del punto de ajuste en incrementos de 10 grados Celsius utilizando la GUI y permita que el sistema se equilibre con la nueva temperatura. Realice los pasos previamente descritos para iniciar la medida de la corriente capacitiva y de la grabación.Cambie el área de la bicapa ajustando cuidadosamente las posiciones de los electrodos utilizando los micro manipuladores. Permita que la corriente de onda cuadrada alcance una amplitud de estado estacionario y recopile imágenes del DIB para permitir el cálculo del área de la membrana frente al tiempo. Utilice una cámara montada en el microscopio para obtener imágenes de la bicapa como se ve desde la apertura.Agregue simultáneamente una etiqueta digital al software de grabación actual para marcar el punto de tiempo correspondiente para la recopilación de imágenes. Obtenga un total de cinco imágenes DIB y regiones de estado estacionario de corriente bicapa, luego restablezca la temperatura y repita la imagen. Analice las grabaciones actuales y las imágenes DIB en los puntos de tiempo etiquetados correspondientes a las áreas bicapa de estado estacionario, extraiga la capacitancia bicapa y el área para cada temperatura.Trace la capacitancia versus el área para cada temperatura y calcule la pendiente de la regresión de primer orden, que representa la capacitancia específica de la bicapa en cada temperatura. A continuación, trace los valores de capacitancia específica frente a sus respectivas temperaturas. Examine los datos de capacitancia específica frente a los datos de temperatura en busca de variaciones no monotónicas para identificar las temperaturas de fusión.Evalúe la dinámica de la formación de canales iónicos dependientes del voltaje generando una entrada de paso de voltaje de CC a través de la bicapa. Establezca el voltaje inicial en el valor de paso deseado en milivoltios y el voltaje final y el tamaño del paso en un valor superior al paso deseado. Establezca un tiempo de duración deseado para la entrada de paso en segundos y, a continuación, elija la polaridad deseada para la entrada de paso.Cambie el amplificador de abrazadera de parche para enviar el voltaje de comando que se origina desde la vista de laboratorio o el módulo de salida de voltaje a la etapa de la cabeza, encienda el voltaje y registre la respuesta de corriente inducida, que debería inhibir una respuesta en forma de S a un voltaje crítico. Obtenga por separado relaciones dinámicas de voltaje de corriente para una membrana a las temperaturas deseadas para revelar relaciones dependientes de voltaje, como los comportamientos del canal iónico. Cambie el amplificador de abrazadera de parche para enviar el voltaje de comando que se origina desde el generador de forma de onda a la etapa de la cabeza e inicie las grabaciones de corriente.En el generador de forma de onda, genere una forma de onda sinusoidal continua con una amplitud, desplazamiento y frecuencia deseados. Registre la respuesta de corriente inducida a través de uno o varios ciclos y repita como desee para diferentes amplitudes de onda sinusoidal, frecuencias y temperaturas. El sistema de control de temperatura se utilizó para mostrar la dependencia de la temperatura de un DIB formado a partir de extracto de lípidos totales del cerebro, o BTLE, lípidos.Las mediciones de la corriente capacitiva y la temperatura frente al tiempo se muestran durante un ciclo de calentamiento desde la temperatura ambiente hasta aproximadamente 60 grados Centígrados. Se documentaron cambios en la capacitancia nominal versus la temperatura a lo largo de un ciclo completo de enfriamiento/calentamiento, después de la formación inicial de bicapa a 60 grados Celsius. Las mediciones cuasiestáticas de capacitancia específica a diferentes temperaturas se pueden utilizar para identificar la temperatura de fusión de lípidos.Trazar la capacitancia de un área de bicapa versus bicapa permite una regresión lineal, donde la pendiente representa el valor de capacitancia específica. La imagen DIB muestra que, cuando la temperatura está por debajo de la temperatura de fusión, la membrana adopta un estado altamente adhesivo, incluso bajo la tensión de gotitas estiradas causadas por electrodos bien separados. Las trazas de corriente versus voltaje mostradas se obtuvieron mediante la aplicación de tensiones de membrana sinusoidales, midiendo la corriente inducida a dos temperaturas diferentes.Las flechas y los números subsiguientes ayudan a visualizar los cuartos sucesivos del voltaje sinusoidal con respecto al tiempo. La densidad de corriente medida para una membrana BTLE dopada con monazomicina al mismo nivel de voltaje y dos temperaturas diferentes se muestra aquí. Es crucial dispensar el aceite de hexadecano en el pozo del accesorio de aluminio correctamente.Si esto se hace fuera de secuencia o no con cuidado, se formarán burbujas de aire debajo del pozo de acrílico, lo que obstruirá la vista de abajo hacia arriba del DIB. El usuario también debe recordar borrar el búfer de datos en el software de control de temperatura antes de cada medición para garantizar un registro completo. Este procedimiento permite caracterizar las membranas biomiméticas a través de un rango de temperaturas, que es necesario para estudiar la dependencia de la temperatura de la estructura de la membrana y el transporte.Además, esta capacidad podría utilizarse para revelar los efectos a nanoescala de otras especies activas en la membrana, como los canales iónicos biológicos y los nanomateriales de ingeniería.

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