Protocolo de preparación y transferencia de muestras para cristalografía de longitud de onda larga en vacío en Beamline I23 en Diamond Light Source

La cristalografía macromolecular de longitud de onda larga explota la señal anómala de los átomos de luz presentes de forma nativa en proteínas y ácidos nucleicos. Esta técnica se utiliza para resolver experimentalmente el problema de la cara cristalográfica y para determinar la identidad y la ubicación de estos elementos. Beamline I23 en Diamond Light Source es un instrumento de sincrotrón único optimizado para experimentos en longitudes de onda largas de hasta cinco angstrom.

Permite acceder a los bordes de absorción de elementos de alta relevancia biológica, como calcio, potasio, cloro, azufre y fósforo. Debido a la absorción significativa de rayos X por el aire en el régimen de longitud de onda larga, estos experimentos se realizan en un entorno de vacío. Para mantener las muestras a temperaturas criogénicas dentro del entorno de vacío, los cristales se montan en soportes de muestra dedicados y térmicamente conductores.

La transferencia de muestra criogénica del nitrógeno líquido a la estación final de vacío es muy similar a las técnicas utilizadas en la microscopía crioelectrónica. Este protocolo presenta el procedimiento para transferir cristales al entorno de vacío utilizando las herramientas y equipos desarrollados en Diamond Light Source. Comience separando la tapa de la base del CombiPuck de modo que los soportes de la muestra permanezcan unidos a la base y los viales se conserven en la tapa.

Sumerja la tapa con viales en nitrógeno líquido, luego conecte un soporte de muestra y un adaptador a una varita magnética y recolecte los cristales. Enjuague cada muestra directamente en el CombiPuck, anotando la posición de la muestra. Para cerrar el disco, use una varita de disco para unir la base a la tapa.

Transfiera el CombiPuck del nitrógeno líquido al cargador seco o al almacenamiento. Coloque la base del disco de bloque ya poblado con bloques de transferencia vacíos sobre su base de soporte en un recipiente de espuma, luego llene con nitrógeno líquido. Luego, coloque el CombiPuck en el recipiente de espuma lleno de nitrógeno líquido, asegurándose de que la base del disco esté asegurada al soporte magnético dentro del recipiente de espuma.

Pre-enfríe todas las herramientas necesarias en nitrógeno líquido. Luego, separe la tapa de la base utilizando la herramienta separadora de discos en el ajuste alto, de modo que la base permanezca unida al soporte magnético, exponiendo los soportes de muestra dentro del nitrógeno líquido. Coloque la varita separadora sobre el soporte de la muestra y el adaptador lo más abajo posible, asegurándose de que la varita sea vertical.

Mueva la pequeña palanca de la varita separadora hacia abajo con el pulgar hasta que haga clic para asegurar el soporte de la muestra en el interior y tire del soporte de la muestra del adaptador. Baje el separador sobre la posición deseada del bloque de transferencia, asegurándose de que una de las tres puntas quepa dentro del orificio central del bloque de transferencia. Suelte el soporte de muestra moviendo la palanca hacia arriba.

Para cargar muestras en el siguiente bloque de transferencia, utilice la herramienta de llave de carrusel para girar un bloque de transferencia vacío en la posición horizontal. Una vez que se transfieran todos los soportes de muestra, cierre el disco de bloque colocando la tapa en nitrógeno líquido. Espere a que la temperatura se equilibre, y luego coloque la tapa sobre la base y levántela suavemente para liberarla del carrusel.

Conecte el servicio de transporte a la estación. Abra las válvulas de gas nitrógeno y aire y asegúrese de que los gases fluyan. Luego, encienda el CTS.

Enfríe tanto el baño como el transbordador con nitrógeno líquido. Coloque el embudo suministrado en el puerto de llenado del transbordador y vierta lentamente nitrógeno líquido en el embudo mientras monitorea el nivel en la pantalla. Deténgase cuando el indicador cambie de rojo a azul.

Llene el baño con nitrógeno líquido usando el embudo. Transfiera un disco de bloque de nitrógeno líquido al baño CTS utilizando la herramienta separadora de disco adjunta. Retire la tapa del disco de bloque y cierre la tapa del baño CTS.

Para introducir un bloque de transferencia en el transbordador, desbloquee el mango del transbordador girando 90 grados en el sentido de las agujas del reloj y avance hacia el baño para que la pista guiada en el mango haga cumplir el camino correcto de viaje. Una vez que la cubierta del bloque esté enfriada, avance el mango para introducir el bloque en el transbordador. Para bloquear el bloque de transferencia en el transbordador, gire el mango 180 grados en el sentido de las agujas del reloj.

Retraiga el mango a la posición original de atrás y bloquéelo en su lugar girando 90 grados en sentido contrario a las agujas del reloj. Presione Cerrar la bomba de válvula de lanzadera en la pantalla de visualización para iniciar la evacuación de la lanzadera. Una vez que los mensajes Shuttle listo para mover y No mover la varilla, la válvula cerrada se muestran en la pantalla táctil, presione la palanca debajo de la lanzadera y levántela con cuidado usando el mango en la parte superior.

Lleve el transbordador a la esclusa de aire en la estación de extremo de vacío en posición vertical y conéctelo. Seleccione una posición de bloque vacía dentro del recipiente presionando el botón correspondiente en la pantalla táctil y moviendo el hotel de muestra a la posición de carga correcta. Una vez que un hotel de muestra esté en posición, presione el botón Abrir para iniciar la secuencia de enclavamiento de vacío.

Después de que se complete la secuencia y el estado cambie a Airlock abierto, bloquee en el transbordador, gire el mango 90 grados en el sentido de las agujas del reloj para desbloquear la varilla. Empuje suavemente la varilla hacia el recipiente para que la pista guiada haga cumplir el camino correcto de viaje hacia el hotel de muestra. Inserte lentamente el bloque de transferencia en el hotel utilizando la fuente de video que se muestra en la pantalla para obtener orientación, asegurándose de que el icono de posición del bloque en la pantalla táctil esté activado.

Una vez activado, gire el mango 180 grados en sentido contrario a las agujas del reloj para liberar el bloque de transferencia y sacar la varilla del recipiente. Una vez que esté completamente retraído, gire el mango 90 grados en sentido contrario a las agujas del reloj para bloquear la varilla. Presione el botón Cerrar para cerrar la válvula de vacío de la estación final y ventilar el espacio entre el transbordador y el recipiente a la presión atmosférica.

Retire la lanzadera cuando la pantalla de la esclusa de aire muestre el estado OK para separar. Devuelva el transbordador al baño CTS y presione Open Shuttle Valve para evacuar el transbordador antes de cargar el siguiente bloque de muestra. Una vez que el semáforo está en verde y aparece el mensaje OK to move rod, se puede introducir el siguiente bloque de transferencia en el transbordador.

Para preparar el siguiente bloque de transferencia, gire el disco de bloque dentro del baño. Empuje la llave de rotación incorporada en la parte superior de la tapa de acrílico hacia abajo en la cerradura en el centro del disco de bloque. Mientras lo mantiene presionado, gire la llave para colocar el bloque de transferencia deseado en la posición de recogida.

Una vez que se hayan transferido todos los bloques, asegúrese de que la válvula de transporte esté abierta, presione el botón Hornear en la pantalla táctil, seleccione Baño y Lanzadera y, a continuación, presione Iniciar hornear. La línea de haz de cristalografía macromolecular de longitud de onda larga I23 en Diamond Light Source puede acceder a los bordes de absorción de elementos de alta importancia biológica, como calcio, potasio, cloro, azufre y fósforo, dando una señal anómala mejorada que se puede utilizar para escalonar o localizar estos elementos dentro de macromoléculas. Los datos de difracción se recopilaron de un solo cristal de taumatina a una longitud de onda de 2,75 angstrom, elegido como un compromiso entre el aumento de la señal anómala y los efectos de absorción de muestras en longitudes de onda más largas.

La configuración de vacío garantiza que solo los rayos X dispersos por la muestra lleguen al detector, proporcionando un fondo bajo alrededor de los reflejos de Bragg. El conjunto de datos produjo una señal anómala muy fuerte, facilitando la solución de la estructura mediante la tubería de fase automática CRANK2. La alta calidad del mapa de densidad de electrones resultante permitió la construcción automática exitosa del modelo, con la colocación correcta para el 100% de la secuencia de aminoácidos de la taumatina.

Los 16 residuos de cisteína dentro de la taumatina forman ocho puentes disulfuro, que son claramente visibles en el mapa de densidad de electrones. Dado que la cristalografía de proteínas de longitud de onda larga en vacío es un campo nuevo, hemos desarrollado nuevas herramientas y equipos de manejo de muestras. Este protocolo guía a los usuarios en la transferencia segura de muestras a la estación final de vacío en la línea de haz I23 en Diamond Light Source.

El entorno de vacío abre oportunidades únicas para realizar experimentos de difracción en un rango de longitud de onda no accesible en otras líneas de haz. La cristalografía de rayos X de longitud de onda larga permite la fase experimental de macromoléculas directamente a partir de cristales nativos. También permite la identificación inequívoca de iones unidos a las moléculas.