Name: Análisis de la composición lipídica de micobacterias por cromatografía de capa delgada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende a extraer y analizar lípidos y ácidos micólicos de micobacterias mediante cromatografía de capa delgada. Este protocolo rápido permite caracterizar perfiles lipídicos específicos de especies como Mycobacterium bovis BCG y M. abscessus.

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Esta investigación fue financiada por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (RTI2018-098777-B-I00), los Fondos FEDER y la Generalitat de Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido es beneficiaria de un contrato de doctorado (FI) de la Generalitat de Catalunya.

1. Extracción del total de lípidos no ligados a covalentes de micobacterias (Figura 1)
<ol><li>Rasque 0,2 g de micobacterias de un medio sólido y agréguelo a un tubo de vidrio con un tapón de rosca de revestimiento de politetrafluoroetileno (PTFE). Añadir una solución compuesta por 5 ml de cloroformo y 10 ml de metanol (cloroformo:metanol, 1:2). NOTA: Cuando se utilizan disolventes orgánicos, solo se debe usar un recipiente de vidrio. No se permiten envases de plástico. Además, se necesitan tapones de rosca de revestimiento de PTFE para botellas. PRECAUCIÓN: El cloroformo es una sustancia potencialmente tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). PRECAUCIÓN: El metanol es una sustancia potencialmente tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).</li>
	<li>Deje el tubo en agitación constante durante la noche para extraer lípidos no ligados a covalentes de la superficie celular micobacteriana. NOTA: Si una plataforma de agitación orbital no está disponible, la agitación constante se puede reemplazar por agitación manual periódica con la mayor frecuencia posible.</li>
	<li>Cubra un embudo de vidrio con un papel de filtro, filtre los disolventes orgánicos y recójalos en un tubo de vidrio.</li>
	<li>Use un flujo de gas nitrógeno para evaporar la fase líquida en el tubo. Llene el tubo con gas nitrógeno, cúbralo y guárdelo a 4 °C. NOTA: Conecte una pipeta Pasteur de vidrio a la corriente de gas nitrógeno para evaporar específicamente el tubo deseado. Además, mantenga el tubo dentro de un calentador de bloque seco para tubos a 37 °C. Cuando el disolvente se evapore, llene el tubo con gas nitrógeno antes de cerrarlo.</li>
	<li>Añadir 15 ml de una solución de cloroformo:metanol (2:1) a los desechos celulares. Deje el tubo en agitación constante durante la noche para extraer lípidos no ligados a covalentes de la superficie celular micobacteriana. NOTA: Si una plataforma de agitación orbital no está disponible, la agitación constante se puede reemplazar por agitación manual periódica con la mayor frecuencia posible.</li>
	<li>Deja reposar la mezcla durante 1 h. Con una pipeta Pasteur, recupera los disolventes orgánicos. Cubra un embudo de vidrio con un papel de filtro y filtre los disolventes orgánicos y recójalos en el mismo tubo de vidrio utilizado anteriormente en el paso 1.3. Use un flujo de gas nitrógeno para evaporar la fase líquida en el tubo. Llene el tubo con gas nitrógeno, ciérdelo y guárdelo de nuevo a 4 °C.</li>
</ol>2. Extracción de ácido micólico por metanolisis ácida (Figura 2A)
<ol><li>Agregue 2-5 ml de solución esterificante en un tubo de vidrio hermético con una tapa de rosca de revestimiento de PTFE. Agregue 0,2 g de biomasa de micobacterias en el tubo de vidrio. NOTA: La solución esterificante se forma mezclando 30 ml de metanol, 15 ml de tolueno y 1 ml de ácido sulfúrico. Las células de micobacterias se pueden tomar de cultivos sólidos o, incluso, de células deslipidas después de realizar la extracción de lípidos totales no ligados a covalentes de micobacterias (células restantes después del filtrado en el paso 1.6). PRECAUCIÓN: El tolueno es una sustancia inflamable y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico es una sustancia corrosiva y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).</li>
	<li>Mezclar el contenido mediante vórtice. Deje reposar la mezcla dentro de un baño seco a 80 °C durante la noche.</li>
	<li>Deje que el tubo se enfríe hasta que alcance la temperatura ambiente y luego agregue 2 ml de n-hexano al tubo. Mezclar el contenido mediante vórtice durante 30 s y dejar que el tubo se asiente hasta que aparezcan dos fases claras. PRECAUCIÓN: El n-hexano es una sustancia potencialmente inflamable, irritante, perjudicial para el medio ambiente y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).</li>
	<li>Recuperar la fase superior correspondiente a la fase n-hexano. Transfiéralo a un tubo nuevo.</li>
	<li>Repita el paso 2.3. Recupere la fase superior de nuevo y transfiérala al mismo tubo utilizado en el paso 2.4.</li>
	<li>Evaporar el contenido del tubo utilizando un flujo de gas nitrógeno. Llene el tubo con gas nitrógeno, ciérdelo y guárdelo a 4 °C.</li>
</ol>3. Extracción de ácido micólico por saponificación y metilación (Figura 2B)
<ol><li>Rasca 0,2 g de micobacterias de un medio sólido y añádelo a un tubo de vidrio con un tapón de rosca de PTFE.</li>
	<li>Añadir 2 ml de solución de metanol-benceno (80:20) que contenga hidróxido de potasio al 5%. Mezclar el contenido mediante vórtice. Calentar la mezcla durante 3 h a 100 °C. PRECAUCIÓN: El benceno es una sustancia inflamable, cancerígena y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).</li>
	<li>Deje que el tubo se enfríe a temperatura ambiente. Añadir un 20% de ácido sulfúrico para acidificar las muestras y lograr un pH = 1.</li>
	<li>Añadir 3 ml de éter dietílico. Mezcle suavemente el contenido mediante vórtice.</li>
	<li>Deje que las dos fases se formen asentándose. Recuperar la fase de éter dietílico y transferir a un nuevo tubo. Repita el paso de lavado por un total de tres veces.</li>
	<li>Lave el extracto de éter dietílico con 2 ml de agua destilada y transfiera la parte superior correspondiente al éter dietílico a un nuevo tubo. Repita el paso de lavado por un total de tres veces.</li>
	<li>Agregue 2 g de sulfato de sodio anhidro sobre el extracto de éter dietílico para secarlo.</li>
	<li>Filtra la suspensión. Evaporar el contenido utilizando un flujo de gas nitrógeno.</li>
	<li>Para realizar la etapa de metilación, disolver 3 g de N-nitroso-N-metil urea en una solución preenfriada formada por 45 mL de éter dietílico y 9 mL de KOH al 40% en agua destilada. PRECAUCIÓN: La N-nitroso-N-metilurea es una sustancia tóxica, irritante, cancerígena y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante (diazometano) a un nuevo matraz enfriado en hielo que contenga gránulos de hidróxido de potasio (aproximadamente 30 g). NOTA: Si el sobrenadante no se utiliza inmediatamente, se puede almacenar a -20 °C durante un máximo de 1 h. PRECAUCIÓN: Los gránulos de hidróxido de potasio son una sustancia irritante y corrosiva. Este material debe utilizarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (capa de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). PRECAUCIÓN: El diazometano es altamente tóxico y potencialmente explosivo. Debe usarse en una campana de flujo laminar con vidrio de seguridad que use el equipo de protección personal apropiado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).</li>
	<li>Añadir 2 ml de la solución de éter que contiene diazometano, obtenida en el paso 3.10, en el extracto de éter dietílico seco que contiene ácidos micólicos, obtenido en el paso 3.8. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Evaporar la suspensión a 40 °C. Llene el tubo con gas nitrógeno, ciérdelo y almacene los lípidos metilados a 4 °C. NOTA: Evapore el diazometano de la solución de éter debajo de la campana de flujo laminar, hasta que el éter pierda el color amarillo.</li>
</ol>4. Análisis de cromatografía en capa fina (TLC)
<ol><li>Saturar la cámara TLC de vidrio. Para ello, cubra una de las paredes de la cámara TLC con un trozo de papel de filtro y deje que esté en contacto con la fase móvil compuesta por la mezcla de disolventes. Coloque el volumen restante del disolvente en la parte inferior de la cámara TLC. NOTA: La parte inferior de la cámara TLC debe estar cubierta por al menos 1 cm de la fase móvil. En los presentes experimentos, se utilizaron diferentes fases móviles para desarrollar los TMIC. Consistieron en 85 ml de n-hexano más 15 ml de éter dietílico; 100 ml de diclorometano; 90 ml de cloroformo, 10 ml de metanol y 1 ml de agua; 30 ml de cloroformo, más 8 ml de metanol y 1 ml de agua; 60 ml de cloroformo, más 35 ml de metanol y 8 ml de agua; 95 ml de cloroformo más 5 ml de metanol; y 90 ml de éter de petróleo (60-80 °C) más 10 ml de éter dietílico. NOTA: En el TLC bidimensional, use n-hexano:acetona (95:5) en la primera dirección tres veces, y use un solo desarrollo con tolueno:acetona (97:3) en la segunda dirección para analizar la composición del ácido micólico. Para analizar los PPY, use cloroformo: metanol: agua (60: 30: 6) en la primera dirección una vez, y use cloroformo: ácido acético: metanol: agua (40: 25: 3: 6) en la segunda dirección. Para analizar PDIM y AG, use éter de petróleo (60-80 ° C): acetato de etilo (98: 2) en la primera dirección tres veces, y use un solo desarrollo con éter de petróleo (60-80 ° C): acetona (98: 2) en la segunda dirección. PRECAUCIÓN: El éter dietílico es una sustancia potencialmente tóxica y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). PRECAUCIÓN: El diclorometano es una sustancia potencialmente tóxica y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). PRECAUCIÓN: El éter de petróleo es una sustancia potencialmente inflamable, perjudicial para el medio ambiente y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). PRECAUCIÓN: El ácido acético es una sustancia potencialmente inflamable y corrosiva. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). PRECAUCIÓN: El acetato de etilo es una sustancia inflamable y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). PRECAUCIÓN: La acetona es una sustancia inflamable y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).</li>
	<li>Cierre la cámara TLC para saturarla durante al menos 20 min. Mientras tanto, disuelva los lípidos presentes en el tubo de vidrio en 0.2-1 ml de cloroformo. NOTA: El volumen utilizado para disolver los lípidos puede modificarse dependiendo de la concentración deseada o esperada de la muestra.</li>
	<li>Aplique 10 μL de cada suspensión utilizando un tubo de vidrio capilar directamente sobre la placa TLC y deje secar la muestra durante 5 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Las muestras deben aplicarse en la parte inferior de la placa dejando 1 cm a cada lado. Las muestras deben separarse unas de otras durante al menos 0,5 cm. Una vez que la muestra se aplica en la placa, los tubos se pueden evaporar nuevamente con gas nitrógeno y almacenarse a 4 ° C para su uso posterior.</li>
	<li>Inserte la placa en la cámara TLC saturada que contiene la fase móvil. Permita que la fase móvil se ejecute a través del TLC. NOTA: Cualquier movimiento aplicado a la cámara TLC afecta al disolvente en funcionamiento en la placa y afecta la movilidad de los lípidos. En el caso de realizar TLC bidimensional, se requieren dos cámaras TLC para contener ambos sistemas de elución.</li>
	<li>Retire la placa de la cámara TLC cuando el disolvente alcance 1 cm de distancia del extremo superior de la placa. Deje la placa bajo flujo laminar hasta que la sílice esté totalmente seca. NOTA: En el caso de analizar la composición del ácido micólico, utilizando n-hexano y dietil-éter (85:15), repita los pasos 4.4 y 4.5 dos veces más, hasta ejecutar la fase móvil tres veces sobre la placa TLC.</li>
	<li>Revelar la placa con la mancha requerida; calentar la placa si es necesario. NOTA: En el presente experimento, se utilizaron 15-20 ml de las siguientes soluciones para rociar las placas TLC: 10% de ácido molibdatofosfórico hidratado en etanol hasta que la placa sea de color amarillo brillante, seguido de calentar la placa a 120 ° C; 5% en etanol de 20% α-naftol en ácido sulfúrico seguido de calentar la placa a 120 °C; Reactivo de molibdeno azul (1,3% de óxido de molibdeno en ácido sulfúrico de 4,2 M) hasta que aparecieron bandas de fosfato o antrono al 1% en ácido sulfúrico. PRECAUCIÓN: El hidrato de ácido molibdatofosfórico es una sustancia inflamable y corrosiva. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). PRECAUCIÓN: El etanol es una sustancia potencialmente inflamable y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). PRECAUCIÓN: El 1-naftol es una sustancia inflamable, corrosiva y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo). PRECAUCIÓN: El reactivo de pulverización azul de molibdeno es una sustancia corrosiva, tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).</li>
</ol>

<ol><li>Watanabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+functional+groups+in+mycobacterial+meromycolate+chains%3B+the+recognition+of+new+structural+principles+in+mycolic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids.</a> Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).</li>
<li>Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO%22">WHO</a>. , (2019).</li>
<li>Jackson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mycobacterial+cell+envelope-lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Mycobacterial cell envelope-lipids.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).</li>
<li>Jankute, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+hydrophobicity+in+tuberculosis+evolution+and+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1315(2017).</li>
<li>Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+W-Beijing+lineage+of+Mycobacterium+tuberculosis+overproduces+triglycerides+and+has+the+DosR+dormancy+regulon+constitutively+upregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated.</a> Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).</li>
<li>Ly, A., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+virulence+factors%3A+Surface-exposed+lipids+and+secreted+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985(2020).</li>
<li>Szulc-Kielbik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+inhibition+of+lipooligosaccharide+synthesis+induces+TLR2-dependent+elimination+of+Mycobacterium+marinum+from+THP1-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 217(2017).</li>
<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+lipooligosaccharide+biosynthetic+gene+cluster+from+Mycobacterium+marinum%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum.</a> Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).</li>
<li>Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+fate+of+smooth+and+rough+Mycobacterium+abscessus+variants+inside+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages.</a> Open Biology. 6 (11), 160185(2016).</li>
<li>Guallar-Garrido, S., Julián, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+Calmette-Gu%C3%A9rin+%28BCG%29+therapy+for+bladder+cancer%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22ImmunoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update.</a> ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).</li>
<li>Bach-Griera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycolicibacterium+brumae+is+a+safe+and+non-toxic+immunomodulatory+agent+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment.</a> Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).</li>
<li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpathogenic+Mycobacterium+brumae+inhibits+bladder+cancer+growth+in+vitro%2C+ex+vivo%2C+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22European+Urology+Focus%22%5BJournal%5D)">Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo.</a> European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).</li>
<li>Noguera-Ortega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+emulsified+in+olive+oil-in-water+trigger+a+robust+immune+response+in+bladder+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment.</a> Scientific Reports. 6, 27232(2016).</li>
<li>Rodríguez-Güell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+a+new+extracellular+putative+long-chain+saturated+polyester+by+smooth+variants+of+Mycobacterium+vaccae+interferes+with+Th1-cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production.</a> Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).</li>
<li>Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underestimated+manipulative+roles+of+Mycobacterium+tuberculosis+cell+envelope+glycolipids+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, (2019).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+major+cell+envelope+components+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+in+vitro+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth.</a> Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).</li>
<li>Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Each+mycobacterium+requires+a+specific+culture+medium+composition+for+triggering+an+optimized+immunomodulatory+and+antitumoral+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect.</a> Microorganisms. 8 (5), 734(2020).</li>
<li>Venkataswamy, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+In+vitro+culture+medium+influences+the+vaccine+efficacy+of+Mycobacterium+bovis+BCG%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG.</a> Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).</li>
<li>Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisited+mycolic+acid+pattern+of+Mycobacterium+confluentis+using+thin-layer+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography.</a> Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).</li>
<li>Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMinnikin%2C+DE+%22Topics+in+Lipid+Research%3A+From+Structural+Elucidation+to+Biological+Function%22">Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function</a>. , CPC Press. London, UK. 139-143 (1986).</li>
<li>Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+of+methanolysates+of+mycolic+acid-containing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria.</a> Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).</li>
<li>Minnikin, D. E., Goodfellow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+composition+in+the+classification+and+identification+of+acid-fast+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Applied+Bacteriology+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria.</a> Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).</li>
<li>Muñoz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+an+antigenic+triacyl+trehalose+in+clinical+isolates+and+reference+strains+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis.</a> FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).</li>
<li>Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphthienoyl+trehalose%2C+glycolipids+specific+for+virulent+strains+of+the+tubercle+bacillus%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus.</a> European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).</li>
<li>Singh, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+a+protocol+for+extraction+of+mycobacterial+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mycobacteriology%22%5BJournal%5D)">Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids.</a> International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).</li>
<li>Camacho, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+phthiocerol+dimycocerosate+locus+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Evidence+that+this+lipid+is+involved+in+the+cell+wall+permeability+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).</li>
<li>Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+lipid+constituents+during+growth+of+Mycobacterium+smegmatis+CDC+46+and+Mycobacterium+phlei+ATCC+354%5BTitle%5D)+AND+%22Microbios%22%5BJournal%5D)">Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354.</a> Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).</li>
<li>Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+age+on+the+lipids+of+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Chest+Diseases+%26+Allied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of age on the lipids of mycobacteria.</a> Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).</li>
<li>Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+to+understand+mycobacterial+lipids+and+use+of+lipid-based+nanoformulations+for+tuberculosis+management%5BTitle%5D)+AND+%22NanoBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management.</a> NanoBioMedicine. , Springer. Singapore. (2020).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+lipidome+profile+of+sensitive+and+resistant+Mycobacterium+tuberculosis+strain%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Current+Microbiology+and+Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).</li>
<li>Slayden, R. A., Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+lipids+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mycobacterium+tuberculosis+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis.</a> Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).</li>
<li>Ojha, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Mycobacterium+tuberculosis+biofilms+containing+free+mycolic+acids+and+harbouring+drug-tolerant+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria.</a> Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).</li>
<li>Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+hydrolysis+of+trehalose+dimycolate+releases+free+mycolic+acids+during+mycobacterial+growth+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).</li>
<li>Layre, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycolic+acids+constitute+a+scaffold+for+mycobacterial+lipid+antigens+stimulating+CD1-restricted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells.</a> Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).</li>
<li>Llorens-Fons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+polyphleates%2C+external+cell+wall+lipids+in+Mycobacterium+abscessus%2C+are+associated+with+the+formation+of+clumps+with+cording+morphology%2C+which+have+been+associated+with+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li>
<li>Butler, W. R., Guthertz, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycolic+acid+analysis+by+high-performance+liquid+chromatography+for+identification+of+mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).</li>
<li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mycolic+acids+in+total+fatty+acid+methyl+ester+fractions+from+Mycobacterium+species+by+high+resolution+MALDI-TOFMS%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS.</a> Mass Spectrometry. 4 (1), 0035(2015).</li>
<li>Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomic+analyses+of+Mycobacterium+tuberculosis+based+on+accurate+mass+measurements+and+the+novel+%22Mtb+LipidDB%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB".</a> Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).</li>
<li>Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+chromatography+and+mass+spectrometry+in+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).</li>
<li>Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Thin-Layer+Chromatography-Flame+Ionization+Detection+%28TLC-FID%29+to+total+lipid+quantitation+in+mycolic-acid+synthesizing+Rhodococcus+and+Williamsia+species%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670(2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se presenta un protocolo simple considerado como el método estándar de oro para la extracción de compuestos lipídicos no unidos covalentemente de la pared celular micobacteriana. Se muestra una visualización adicional por TMIC unidimensionales y bidimensionales de los lípidos extraídos de cuatro micobacterias diferentes.
Dos mezclas combinadas consecutivas de cloroformo y metanol para recuperar el contenido lipídico de las células micobacterianas es la mezcla de disolventes más utilizada<sup c...

Mycobacterium es un género que comprende especies patógenas y no patógenas, caracterizadas por tener una pared celular altamente hidrofóbica e impermeable formada por sus peculiares lípidos. Específicamente, la pared celular micobacteriana contiene ácidos micólicos, que son ácidos grasos α-alquilo y β-hidroxi, en los que la rama α es constante en todos los ácidos micólicos (excepto en la longitud) y la cadena β, llamada cadena de meromycolate, es una cadena alifática larga que puede contener diferentes grupos químicos funcionales descritos junto con la literatura (α-, α'-, metoxi-, metoxi-, κ-, epoxi-, carboxi-, y ω-1-metoxi-micolatos), produciendo así siete tipos de ácidos micólicos (I-VII)1. Además, otros lípidos con una importancia incuestionable también están presentes en la pared celular de las especies de micobacterias. Especies patógenas como Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis2 producen factores de virulencia específicos basados en lípidos como dilipocerol dimycocerosatos (PDIMs), glicolípidos fenólicos (PGL), di-, tri-, y penta-aciltrehalosas (DAT, TAT y PAT), o sulfolípidos, entre otros.3. Su presencia en la superficie micobacteriana se ha asociado con la capacidad de modificar la respuesta inmune del huésped y por tanto, la evolución y persistencia de la micobacteria dentro del huésped.4. Por ejemplo, la presencia de triacilgliceroles (TAG) se ha asociado con el fenotipo hipervirulento del linaje 2-Beijing sublinaje de M. tuberculosis, posiblemente debido a su capacidad para atenuar la respuesta inmune del huésped5,6. Otros lípidos relevantes son los lipooligosacáridos (LOS) presentes en micobacterias tuberculosas y no tuberculosas. En el caso de Mycobacterium marinum, la presencia de LOSs en su pared celular está relacionada con la motilidad deslizante y la capacidad de formar biopelículas e interfiere con el reconocimiento por parte de los receptores de reconocimiento de patrones de macrófagos, afectando la absorción y eliminación de las bacterias por los fagocitos del huésped.7,8. Además, la ausencia o presencia de algunos lípidos permite clasificar a los miembros de una misma especie en diferentes morfotipos con perfiles virulentos o atenuantes al interactuar con las células huésped. Por ejemplo, la ausencia de glicopeptidolípidos (GPL) en el morfotipo rugoso de Mycobacterium abscessus se ha asociado con la capacidad de inducir acidificación intrafagosómica y, en consecuencia, apoptosis celular9, a diferencia del morfotipo liso que posee G L GPL en su superficie. Además, el contenido de lípidos de la pared celular micobacteriana está relacionado con la capacidad de modificar la respuesta inmune en el huésped. Esto es relevante en el contexto del uso de algunas micobacterias para desencadenar un perfil inmune protector contra diferentes patologías.10,11,12,13. Se ha demostrado, por ejemplo, que Mycolicibacterium vaccae, una micobacteria saprófita, que actualmente se encuentra en ensayos clínicos de fase III como vacuna inmunoterapéutica para la tuberculosis, muestra dos morfotipos coloniales. Mientras que el fenotipo liso, que contiene un poliéster en su superficie, desencadena una respuesta Th2, el fenotipo rugoso desprovisto del poliéster puede inducir un perfil Th1 cuando interactúa con las células inmunes del huésped.14. El repertorio de lípidos presentes en la célula micobacteriana no solo depende de las especies de micobacterias, sino también de las condiciones de los cultivos de micobacterias: tiempo de incubación.15,16 o composición del medio de cultivo17,18. De hecho, los cambios en la composición del medio de cultivo afectan a la actividad antitumoral e inmunoestimuladora de M. bovis BCG y Mycolicibacterium brumae in vitro17. Además, el perfil inmune protector desencadenado por M. bovis BCG contra M. tuberculosis El desafío en modelos de ratones también depende de los medios de cultivo en los que M. bovis BCG crece17. Estos podrían estar relacionados con la composición lipídica de las micobacterias en cada condición de cultivo. Por todas estas razones, el estudio del contenido lipídico de las micobacterias es relevante. Se presenta un procedimiento visual para extraer y analizar la composición lipídica de la pared celular micobacteriana.

<table><tbody><tr><td>Ácido acético Merck</td><td></td><td>100063</td><td>PRECAUCIÓN. Anhidro para análisis EMSURE&reg; ACS, ISO, Reag. ph eur</td></tr><tr><td>acetona</td><td>carlo erba</td><td>400971N</td><td>PRECAUCIÓN. ACETONA RPE-ACS-ISO PARA ANALYS ml 1000</td></tr><tr><td>Anthrone</td><td>Merck</td><td>8014610010</td><td>Anthrone para síntesis.</td></tr><tr><td>Benceno</td><td>, Carlo Erba</td><td></td>, <td>426113 PRECAUCIÓN. Benceno RPE - Para análisis - ACS 2,5 l</td></tr><tr><td>Tubo de vidrio capilar</td><td>Merck</td><td>BR708709</td><td>BRAND&reg; &nbsp; desechable BLAUBRAND&reg; &nbsp; micropipetas, Cloroformo intraMark</td></tr><tr><td>Carlo</td><td>Erba</td><td>412653</td><td>PRECAUCIÓN. Cloroformo RS - Para HPLC - Grado isocrático - Estabilizado con etanol 2,5 L</td></tr><tr><td>Calentador de bloque seco</td><td>J.P. Selecta</td><td>7471200</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Carlo Erba</td><td>412622</td><td>PRECAUCIÓN. Diclorometano RS - Para HPLC - Grado isocrático - Estabilizado con amileno 2,5 L</td></tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Carlo Erba</td><td>412672</td><td>PRECAUCIÓN. Éter dietílico RS - Para HPLC - Grado isocrático - No estabilizado 2,5 L</td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Panreac</td><td>1313181211</td><td>ATENCIÓN. El acetato de etilo (Reag. USP, Ph. Eur.) para el análisis, ACS, ISO</td></tr><tr><td>Alcohol etílico absoluto</td><td>Carlo Erba</td><td>4146072</td><td>PRECAUCIÓN. Etanol absoluto anhidro RPE - Para análisis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L</td></tr><tr><td>Embudo de vidrio</td><td>VidraFOC</td><td>DURA.2133148 1217/1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de vidrio</td><td>VidraFOC</td><td>VFOC.45066A-16125</td><td>Tubo de vidrio con tapón de PTFE recuperado</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td>412722 ATENCIÓN. Metanol RS - Para HPLC - ORO - Grado ultragradiente 2,5 L</td></tr><tr><td>Hidrato de ácido molibdatofosfórico</td><td>Merck</td><td>51429-74-4</td><td>ATENCIÓN.</td></tr><tr><td>Reactivo de aerosol azul de molibdeno, 1.3%</td><td>Sigma</td><td>M1942-100ML</td><td>PRECAUCIÓN.</td></tr><tr><td>n-hexano</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td>446903 PRECAUCIÓN. n-Hexano 99% RS - ATRASOL - Para análisis de trazas 2.5 L</td></tr><tr><td>n-nitroso-n-metilurea</td><td>Sigma</td><td>N4766</td><td>PRECAUCIÓN</td></tr><tr><td>Plataforma de agitación orbital</td><td>DDBiolab 995018</td><td></td><td>NB-205L incubadora de agitación de sobremesa</td></tr><tr><td>Éter de petróleo (60-80&ordm; C)</td> <td>Carlo Erba</td><td>427003</td><td>PRECAUCIÓN. Éter de petróleo 60 - 80&deg; C RPE - Para análisis 2,5 L</td></tr><tr><td>Pulverizador</td><td>VidraFOC</td><td>712/1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sodio anhidro</td><td>Merck</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico 95-97%</td><td>Merck</td><td>1007311000</td><td>ATENCIÓN. Cámara de ácido sulfúrico 95-97%</td></tr><tr><td>TLC</td><td>Merck</td><td>Z204226-1EA</td><td>Tanques de desarrollo TLC rectangulares, L y tiempos completos; H y tiempos; W 22 cm y veces; 22 cm y tiempos; Placa TLC de 10 cm</td></tr><tr><td></td><td>Merck</td><td>1057210001</td><td>TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u</td></tr><tr><td>Calentador de placas TLC</td><td>CAMAG</td><td>223306</td><td>CAMAG Calentador de plataforma TLC III</td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Carlo Erba</td><td>488551</td><td>ATENCIÓN. Tolueno RPE - Para análisis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>10132562</td><td>IKA&nbsp; Agitador IKA v&oacute; rtex 3</td></tr><tr><td>1-naftol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102269427</td><td>PRECAUCIÓN.</td></tr></tbody></table>

análisis de la composición lipídica de micobacterias por cromatografía de capa delgada

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

Las especies de micobacterias pueden diferir entre sí en la tasa de crecimiento, la presencia de pigmentación, la morfología de la colonia mostrada en los medios sólidos, así como otras características fenotípicas. Sin embargo, todas tienen en común el carácter más relevante de las micobacterias: su pared celular única y altamente hidrofóbica. Las especies de micobacterias contienen un complejo unido a la membrana covalente que incluye arabinogalactano, peptidoglicano y cadenas largas de ácidos micólicos con tipos que difieren entre las especies de micobacterias. Además, las micobacterias también pueden producir lípidos que se localizan, no unidos covalentemente, en sus superficies celulares, como los dicicocerosatos de fteocerol (PDIM), los glicolípidos fenólicos (PGL), los glicopptidolípidos (GPL), las aciltrehalosas (AT) o los narizidos de fosfatidil-inositol (PIM), entre otros. Algunos de ellos se consideran factores de virulencia en micobacterias patógenas, o lípidos antigénicos críticos en la interacción huésped-micobacterias. Por estas razones, existe un interés significativo en el estudio de los lípidos micobacterianos debido a su aplicación en varios campos, desde la comprensión de su papel en la patogenicidad de las infecciones por micobacterias, hasta una posible implicación como agentes inmunomoduladores para el tratamiento de enfermedades infecciosas y otras patologías como el cáncer. Aquí, se presenta un enfoque simple para extraer y analizar el contenido total de lípidos y la composición de ácido micólico de las células de micobacterias cultivadas en un medio sólido utilizando mezclas de solventes orgánicos. Una vez obtenidos los extractos lipídicos, se realiza cromatografía de capa fina (TLC) para monitorizar los compuestos extraídos. El experimento de ejemplo se realiza con cuatro micobacterias diferentes: mycolicibacterium brumae y Mycolicibacterium fortuitum de rápido crecimiento ambiental, el bacilo atenuado de crecimiento lento Mycobacterium bovis Calmette-Guérin (BCG) y el patógeno oportunista de rápido crecimiento Mycobacterium abscessus, lo que demuestra que los métodos mostrados en el presente protocolo se pueden utilizar para una amplia gama de micobacterias.

Con el objetivo de mostrar una amplia gama de lípidos presentes en diferentes especies de micobacterias, se seleccionó M. bovis BCG por tratarse de micobacterias rugosas y de crecimiento lento. En el procedimiento se añadieron M. fortuitum y M. brumae rugosas y de rápido crecimiento y, finalmente, también se incluyó el morfotipo liso de M. abscessus. Estas cuatro especies nos permiten visualizar un amplio espectro de lípidos derivados de micobacterias como aciltrehalosas (AT), GGL, PD...

Se presenta un protocolo para extraer el contenido total de lípidos de la pared celular de una amplia gama de micobacterias. Además, se muestran protocolos de extracción y análisis de los diferentes tipos de ácidos micólicos. También se proporciona un protocolo cromatográfico de capa delgada para monitorear estos compuestos micobacterianos.

Análisis de la composición lipídica de micobacterias por cromatografía de capa delgada

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

Micobacterias Los lípidos son una característica importante del género y son críticos en las interacciones de las micobacterias huéspedes. Rapidez y versatilidad son las principales ventajas de este procedimiento. Este método se puede utilizar para comprender el papel de los lípidos y la patogenicidad de las micobacterias y su efecto inmunoestimulante.Para la extracción de lípidos ligados no covalentes, agregue 15 mililitros de una a dos soluciones de cloroformo a metanol a un tubo de vidrio con una tapa de rosca de revestimiento de PTFE debajo de una campana de flujo laminar. Luego, rasque 200 miligramos de micobacterias de un medio sólido y agregue las micobacterias al tubo de vidrio. Incubar el tubo durante la noche con agitación constante.Al día siguiente, filtre los disolventes orgánicos a través de un embudo de vidrio forrado con papel de filtro en un tubo de vidrio. Después de usar el flujo de gas nitrógeno, para evaporar la fase líquida en el tubo, llene el tubo con gas nitrógeno, para almacenar el tubo a cuatro grados centígrados. Luego, agregue 15 mililitros de una solución de cloroformo de dos a uno a metanol a los desechos celulares e incube el tubo durante la noche con agitación constante.A la mañana siguiente, deje reposar la mezcla durante una hora, antes de usar una pipeta Pasteur para transferir los disolventes orgánicos a un embudo de vidrio forrado de papel de filtro en el mismo tubo de recolección de vidrio. Luego, evapore la fase líquida como se ha demostrado, antes de rellenar el tubo con gas nitrógeno durante cuatro grados centígrados de almacenamiento. Para la extracción de ácido micólico, agregue de dos a cinco mililitros de una solución agitadora y 200 miligramos de biomasa de micobacterias a un tubo de vidrio hermético con una tapa de rosca de revestimiento de PTFE, y mezcle el contenido mediante vórtice.Incubar la mezcla dentro de un baño seco a 80 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, cuando el tubo se haya enfriado a temperatura ambiente, agregue dos mililitros de N hexano y mezcle el contenido durante 30 segundos mediante vórtice. Deje que el tubo se asiente hasta que aparezcan dos fases claras y transfiera la fase superior de hexano N a un nuevo tubo.Mezcle dos mililitros adicionales de N hexano con el contenido del tubo y recoja la capa superior nuevamente. Luego, evapore el contenido del tubo por el flujo de nitrógeno y almacene la muestra cubierta de nitrógeno a cuatro grados centígrados como se ha demostrado. Para analizar las muestras de TLC, cubra una pared de la cámara TLC con un trozo de papel de filtro, agregue vaselina en las esquinas de la cámara para sellar la cámara, para entablar la mezcla de solvente sobre el papel de filtro y agregar el volumen restante del solvente a la parte inferior de la cámara TLC.Cierre la cámara TLC durante al menos 20 minutos para que se sature. Mientras tanto, disuelva los lípidos en el tubo de vidrio en 200 a 1000 microlitros de cloroformo y use un tubo de vidrio capilar para aplicar 10 microlitros de la suspensión de cloroformo lipídico directamente sobre la placa TLC. Después de dejar que la muestra se seque durante cinco minutos, inserte la placa en la cámara TLC saturada y permita que la fase móvil pase a través del TLC.Cuando el disolvente alcance un centímetro del extremo superior de la placa, coloque la placa debajo del flujo laminar hasta que la sílice esté completamente seca. Luego, rocíe la placa seca con 15 a 20 mililitros de hidrato de ácido fosfórico de datos molares al 10% en etanol hasta que la placa esté de color amarillo brillante, y caliente la placa durante dos a cinco minutos a 120 grados centígrados. En este análisis representativo, el ácido micólico extraído de diversas especies de micobacterias, se analizó a través de TLC unidimensional utilizando dos sistemas de elución diferentes y TLC bidimensional.También se realizaron dos tipos de procedimientos de metilación para confirmar la presencia de ácido micólico tipo cinco. En ambos sistemas de elución, los ácidos micólicos se localizaron aproximadamente en el centro de la placa, aunque, la mancha correspondiente al ácido micólico tipo cinco, se observó solo después de la saponificación. El TLC bidimensional también permite la identificación de tipos individuales de ácido micólico.Por ejemplo, mycobacterium brumae expresa solo ácidos micólicos tipo uno, mycobacterium bovis BCG expresa tipos uno y cuatro, mycobacterium fortuitum expresa tipos uno y cinco, y mycobacterium abcessus expresa perfiles de ácido micólico tipo uno y dos. Los extractos lipídicos totales de varias especies de micobacterias se analizaron en función de su polaridad y tamaño. Revela que la mayoría de los lípidos polares A, como los PDIM, están presentes en mycobacterium bovis BCG, pero no en mycobacterium fortuitum, mycobacterium brumae y el morfotipo liso de M abcessus.Los glicolípidos fenólicos están presentes solo en mycobacterium bovis BCG, mientras que los lipídidos de GlycoPeptido se observan solo en muestras de mycobacterium abcessus. Al igual que los ácidos micólicos, los acilgliceroles y PDIMs, PIMs, también se pueden visualizar fácilmente a través del análisis unidimensional TLC o 2D TLC. Se utilizaron dos tipos de manchas para revelar PIMs en TLC unidimensional.Lo más importante que debe recordar al intentar este protocolo es no usar ningún instrumento de plástico durante todo el procedimiento.

analysis-lipid-composition-mycobacteria-thin-layer

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Preparación de la muestra de<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Extractos de Estudios de Resonancia Magnética Nuclear metabolómica

Este video muestra la separación de ácidos micólicos basada en cromatografía de capa fina. Esta técnica separa los diferentes ácidos micólicos (lípidos de cadena larga presentes en la pared celular de las micobacterias) en función de su polaridad.

Separación de variantes de ácido micólico basada en cromatografía de capa fina: un método para separar los lípidos de la pared celular micobacteriana en función de la polaridad

Aislamiento y caracterización del dominio lípido A del lipopolisacárido (LPS) de las bacterias gram-negativas proporciona información sobre los mecanismos de la superficie celular a base de resistencia a los antibióticos, la supervivencia bacteriana y la forma física, y cómo químicamente diversa lípido A las especies moleculares modulan diferencialmente acogida la respuesta inmune innata.

Aislamiento y Caracterización química del lípido A de bacterias gram-negativas

Tegumento de los mamíferos contiene lípidos extraíbles con disolventes que pueden proporcionar composiciones química característica de las especies individuales. Este trabajo presenta un método de rutina para separar grandes clases de lípidos aislados de tejidos tegumentarios utilizando cromatografía en capa fina y la determinación del perfil triacilglicérido por láser de desorción / ionización por espectrometría de masas de tiempo de vuelo asistida por matriz.

Perfiles de los Contenidos triacilglicérido en Bat Tegumentario lípidos por cromatografía preparativa en capa fina y MALDI-TOF espectrometría de masas

La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.

Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

Aquí, describimos un protocolo usando el microdissection de la captura del laser juntada con el análisis por LC/MS para cuantificar espacialmente la distribución de drogas dentro de granulomas de la tuberculosis pulmonar. El enfoque tiene amplia aplicabilidad para cuantificar concentraciones de medicamentos en los tejidos de alto detalle espacial.

Cuantificación espacial de fármacos en lesiones de Tuberculosis pulmonar por Laser Capture Microdissection líquido cromatografía espectrometría de masas (LCM-LC/MS)

Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido 14C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.

Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

Las vesículas bacterianas desempeñan un papel importante en la patogénesis y tienen aplicaciones biotecnológicas prometedoras. La heterogeneidad de las vesículas complica el análisis y el uso; por lo tanto, es necesario un método simple y reproducible para separar los diferentes tamaños de vesículas. Aquí, demostramos el uso de la cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas heterogéneas producidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografía de exclusión de tamaño para analizar la heterogeneidad de las vesículas de la membrana externa bacteriana

Este protocolo describe el cultivo, la recolección y la concentración de las proteínas secretadas de Mycobacterium tuberculosis. Las proteínas filtradas de cultivo (CFP) se cuantifican, se separan en 20 fracciones mediante enfoque isoeléctrico y se resuelven en 30 fracciones utilizando un SDS-PAGE preparativo y un sistema de electroelución.

Separación y fraccionamiento de proteínas filtradas de cultivo (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis

Este protocolo separa las proteínas insolubles de la pared celular y la membrana en fracciones simples (1-5 proteínas) utilizando un enfoque isoeléctrico preparativo (IEF) basado en el punto isoeléctrico, seguido de una separación por peso molecular. Las fracciones resultantes se pueden utilizar directamente para análisis inmunológicos y proteómicos sin necesidad de una mayor purificación.

Separación y fraccionamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis para el análisis de proteínas aguas abajo

Aprende a extraer y analizar lípidos y ácidos micólicos de micobacterias mediante cromatografía de capa delgada. Este protocolo rápido permite caracterizar perfiles lipídicos específicos de especies como Mycobacterium bovis BCG y M. abscessus.

Análisis de la composición lipídica de micobacterias por cromatografía de capa delgada

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