Generación de Xenoinjertos Larvales de Pez Cebra y Análisis de Comportamiento Tumoral

Xenoinjertos de pez cebra están siendo ampliamente utilizados para la investigación del cáncer. Puede tomar células tumorales humanas e inyectarlo en pequeñas larvas de pez cebra, o incluso en adultos. Aquí, lo que estamos presentando es un protocolo paso a paso del modelo larval, donde podemos estudiar varios sellos de cáncer humano en un animal vivo.

Se puede estudiar la proliferación, se puede estudiar la angiogénesis, se puede estudiar la metástasis, y también las interacciones dentro del microambiente tumoral. Y una gran ventaja es que se puede estudiar esto en un período de tiempo muy corto. Solo cuatro días, por ejemplo.

Otra gran ventaja es que se puede estudiar este vivo con resolución unicelular, utilizando un microscopio confocal o de lámina de luz. Usted puede estudiar cómo las células migran, cómo las células interactúan entre sí, o incluso cómo se hablan entre sí. Así que es un modelo muy poderoso para estudiar la biología del cáncer.

Los xenoinjertos de pez cebra se pueden usar para estudiar la respuesta a las terapias contra el cáncer, como la quimioterapia, la radioterapia o incluso las terapias dirigidas con anticuerpos. Y por último, también, este protocolo también se puede adaptar para utilizar células derivadas del paciente de una muestra quirúrgica, o incluso de biopsias, y luego generar los avatares del pez cebra. Configuración para inyección.

Dos semanas antes de la inyección, expandir las células en cultivo. Comience con el exceso de células y el exceso de peces hasta llegar a ser competente con la técnica, ya que muchas células y peces se perderán durante el entrenamiento. La tabla uno del PDF adjunto tiene una guía detallada de los porcentajes óptimos de confluencia in vitro para inyección de varias líneas celulares.

Tres días antes de la inyección, cruzar el pez cebra del fondo deseado. 24 horas antes de la inyección. Limpie las placas de embriones de pez cebra.

Deseche todos los embriones muertos y no desarrollados y actualice el medio E3. En la sala de cultivo celular, deseche el medio de cultivo celular. Lavar una vez con PBS 1X para eliminar las células muertas y añadir el medio fresco.

Prepare las herramientas para el procedimiento de inyección, como agujas de microinyección, placas de agarosa y horquillas para alinear los embriones para la inyección. Para la preparación del plato, vierta una capa de agarosa disuelta al 2% en la tapa de una placa de Petri limpia. Déjalo polimerizar y con la ayuda de una regla, haz de tres a cuatro líneas rectas de agarosa para la alineación de los embriones.

Día de la inyección. Separe los embriones eclosionados de los huevos no incubados. La adición de pronasa al medio embrionario en esta etapa puede aumentar la eclosión.

Coloque los embriones en la incubadora a 28 grados Centígrados hasta la inyección. Etiquetado celular para inyección. Para ayudar en el establecimiento de una técnica de etiquetado celular reproducible, revise las tablas uno y dos del protocolo escrito para una compilación de una lista de líneas celulares y varias soluciones de etiquetado.

Retire el medio de cultivo celular y lave el matraz dos veces con PBS 1X. Etiquete las células con un tinte lipofílico, evitando la exposición a la luz, e incube el matraz a 37 grados. También puede optar por etiquetar las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml al desprendimiento.

Retire la solución de etiquetado celular y lave las células con PBS 1X para eliminar el exceso de tinte. Agregue el agente de desprendimiento correspondiente e incube las células a 37 grados Centígrados. Facilitar el proceso de desprendimiento cepillando el matraz con un raspador de células estériles y recoger las células con una pipeta serológica.

Transferir las células a 1,5 ml de tubos de microcentrífuga y centrífuga. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con medio de cultivo celular. Cuantifique la viabilidad celular utilizando una cámara Neubauer con exclusión de azul tripano u otro método de elección.

Centrifugar y volver a suspender las células en el medio de inyección. Las concentraciones recomendadas de células en medio se pueden encontrar en la tabla uno del manuscrito. A partir de este punto, las células deben mantenerse en el hielo.

Procedimientos de inyección. Anestesiar los embriones en tricaína 1X durante 5 minutos. Luego, transfiera una pequeña cantidad de embriones anestesiados a una placa de agarosa y alinee con la ayuda de un lazo de horquilla.

Asegúrese de mantener la distancia entre los embriones. Sobre todo entre la yema de uno y la cabeza del siguiente. Para prevenir la mortalidad, asegúrese de que los embriones alineados no se sequen en la placa de agarosa agregando cuidadosamente una a tres gotas de solución de tricaína 1X a la placa.

Toque ligeramente el tubo de microcentrífuga para volver a suspender las células. Retrocargue la aguja de inyección con una suspensión celular utilizando una punta de Microcargador, evitando burbujas de aire, ya que pueden comprometer la integridad de los embriones. Abra la válvula de presión de aire, configure el microinyector y coloque cuidadosamente la aguja de microinyección en el soporte.

Corte la aguja de microinyección cerca de la punta. Perfore cuidadosamente la yema del embrión, bajando el ángulo de la aguja y empujando cautelosamente hasta que la punta de la aguja alcance el espacio de la perivitelina. Una vez que la punta está en el espacio de perivitelina, inyecte las células.

Trate de inyectar un volumen de células similar al tamaño del ojo del embrión, y lo más lejos posible del corazón para prevenir el edema cardíaco. Ajuste la presión del microinyector, si es necesario. Transfiera los embriones inyectados a una placa de Petri limpia con solución tricaína 1X y déjelos descansar durante cinco a 10 minutos.

Esto le dará tiempo a la herida para cerrarse. Retire la solución tricaine 1X y agregue el medio E3 fresco. Luego, incuba los embriones a 34 grados Centígrados.

Esta temperatura permitirá la supervivencia tanto de los embriones de pez cebra como de las células tumorales humanas. Ensayo metastásico. Si desea estudiar el potencial metastásico de sus líneas celulares, alrededor de una hora después de la inyección, examine los embriones inyectados en un esteremicroscopio de fluorescencia y clíquelos en dos grupos de acuerdo con la ausencia o presencia de células cancerosas en circulación.

Un día después de la inyección. En un estereomicroscopio de fluorescencia, analice cuidadosamente cada embrión y seleccione aquellos con tumores inyectados correctamente. Ordene los xenoinjertos seleccionados según el tamaño del tumor.

Utilice el tamaño del ojo para la comparación. Deseche cualquier embrión con morfología anormal, edema cardíaco o de yema de yema, xenoinjertos con muy pocas células cancerosas o aquellos con células cancerosas solo dentro de la yema. Distribuya los xenoinjertos de acuerdo con el diseño experimental deseado y comience el ensayo de fármacos.

Reemplace los medicamentos y el medio E3 diariamente. Incubar los xenoinjertos, manteniendo la temperatura de 34 grados centígrados hasta el final del ensayo. Cuatro días después de la inyección.

En el último día del ensayo, anestesiar los xenoinjertos con solución de tricaina 1X, y alinearlos cuidadosamente en la placa de agar. Deseche cualquier xenoinjerto muerto o hinchado. Estos xenoinjertos no se consideran para la cuantificación del injerto.

En un estereomicroscopio de fluorescencia, analice cuidadosamente cada xenoinjerto y evalúe la ausencia o presencia de tumores en el espacio de la perivitelina. Según la configuración experimental, seleccione los xenoinjertos de interés y eutanasiarlos con tricaine 25X. Fijarlos en formaldehído al 4% durante al menos 4 horas a temperatura ambiente para proceder con la inmunotensación.

De lo contrario, guarde durante la noche a cuatro grados centígrados y al día siguiente, reemplace el formaldehído con 100% metanol. Los xenoinjertos fijados en 100% metanol se pueden almacenar a 20 grados indefinidamente. Montaje entero immunostaining para la proyección de imagen confocal.

La técnica de inmunofluorescencia de montaje completo dura tres días, divididos de la siguiente manera. El primer día es para la permeabilización de los xenoinjertos y la incubación de anticuerpos primarios. El segundo día, para lavado e incubación secundaria de anticuerpos.

Y el tercer día, para lavado, fijación de xenoinjertos y almacenamiento en el medio de montaje. Se pueden encontrar más detalles de este procedimiento en el PDF adjunto. Montaje de xenoinjertos.

Selle los bordes de un resbalón de cubierta con vaselina o grasa de silicona, para que el medio de montaje no se escape. Usando una pipeta Pasteur, transfiera los xenoinjertos al resguardo de la cubierta. Alinee cuidadosamente con una horquilla.

Agregue el medio de montaje a otro resbalón de la cubierta. Únase cuidadosamente ambos resbalones de la cubierta y colótelos encima de un portaobjetos de microscopio para permitir una manipulación más fácil. Imágenes confocales.

Una lente objetivo de inmersión apocromática 25X con corrección de agua es óptima para los tumores de imagen con una resolución unicelular. Adquiera las muestras utilizando la función Z-Stack con un intervalo de cinco micras entre cada rebanada. Abra los datos sin procesar en el software de Fiji.

Seleccione tres rebanadas representativas del tumor en la parte superior, media e inferior, por pila z, por xenoinjerto. Abra el plugin Cell Counter del software de Fiji. En la herramienta Contador de celdas, haga clic en Inicializar, seleccione un tipo de contador y haga clic en la imagen para iniciar el modo de recuento manualmente.

Por cada clic, el contador pregunta cuántas celdas se cuentan. Para obtener el número total de células en el tumor, use la siguiente fórmula. Para evaluar el número total o porcentaje de marcadores, como células inmunes, figuras mitóticas, caspasa activada, entre otros, cuantificar manualmente las células que son positivas para el etiquetado específico, marcador o transgén de interés a lo largo de todas las rebanadas de la z-stack con el plugin Cell Counter.

Tenga en cuenta que algunas celdas se ubicarán entre dos sectores. Ir y venir en la pila z para asegurarse de que no se cuenta ninguna celda dos veces. Resultados representativos.

Los xenoinjertos colorrectales de la variedades de células del cáncer de HCT 116 fueron generados según lo descrito en el protocolo. Xenografts fue distribuido aleatoriamente en controles no-tratados y quimioterapia de FOLFIRI. La inmunofluorescencia fue realizada para detectar las células apoptotic, usando el anticuerpo anti-hendido caspase-3 y DAPI para counterstaining nucleic.

La cuantificación del índice mitótico, del apoptosis, y del tamaño de tumor, reveló que FOLFIRI induce una disminución significativa de la mitosis y de una inducción significativa del apoptosis, acompañada por una reducción del 54% del tamaño de tumor. Estas características son útiles en pantallas fenotípicas de alto rendimiento de drogas, así como para probar los efectos intrínsecos y fisiológicos de la célula de varios tratamientos contra el cáncer en un corto período de tiempo. Otra gran ventaja del modelo xenoinjerto de pez cebra es que es posible estudiar las interacciones de diferentes células tumorales y analizar cómo cada tipo de célula puede influir en el comportamiento de la otra.

Se pueden coinyectar diferentes células cancerosas humanas, diferentes clones del mismo tumor o de diferentes tumores. En este ejemplo, dos variedades de células colorrectales del cáncer derivadas del mismo paciente fueron etiquetadas con diversos tintes lipofílicos y mezcladas en un ratio de uno a uno para la inyección. Esperamos que este protocolo pueda ayudar a los investigadores a convertirse en verdaderos expertos en la generación de xenoinjertos de pez cebra.

No es fácil. Necesitas practicar, practicar. No te rindas.

Estoy seguro de que llegarás allí. Buena suerte.