Name: Disección del saco endolinfático de ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: Aprenda a diseccionar el saco endolinfático de ratones mediante microdissección precisa. Este protocolo permite aislar el tejido para estudios moleculares, inmunohistoquímica y análisis transcriptómico en investigación del oído interno.

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<ol><li>Dror, A. A., Brownstein, Z., Avraham, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+human+and+mouse+genetics+reveals+pendrin+function+in+hearing+and+deafness%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Integration of human and mouse genetics reveals pendrin function in hearing and deafness.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 28 (3), 535-544 (2011).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td>Crystalgen</td><td>221-057</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa TUBERCULINA de 1 mL con BD 309623</td><td></td><td></td><td></td>27G x 13 mm</tr><tr><td>Placa de vidrio puntual de 9 pocillos</td><td>Pyrex</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-conjugada Faloidina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Arteria&nbsp; Tijeras&nbsp;- Punta de bola</td><td>Fine Science Tools</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Cámara para capturar imágenes en luz incidente</td><td>Leica</td><td>DFC 495</td><td></td></tr><tr><td>Cámara para capturar imágenes fluorescentes</td><td>Leica</td><td>DFC 7000 GT</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 15 mL</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa/Dispasa</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de vidrio</td><td>Corning</td><td>2940-223</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Pinzas</td><td>Herramientas de Ciencias Finas</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Herramientas de Ciencias Finas</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Bonn Extra Finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Alternativa: Tijeras de microdisección extrafinas; Recto; Puntas afiladas; Longitud de la hoja de 20 mm; 3 1/2" de longitud total</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario conjugado ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>MicroSlides Superfrost</td><td>VWR</td><td>48311-702</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital, por ejemplo Mini Shaker</td><td>Daigger</td><td>980275</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA) 16% Solución acuosa</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (10X) pH 7.4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Mountant Antidecolorante con DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpos anti-Pendrin</td><td>para</td><td></td> conejos <td>Interno RRID:AB_2713943, PB826 (Choi et al., 2011)</td></tr><tr><td>Pinzas de anillo</td><td>Fine Science Tools</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Agitador oscilante, por ejemplo Microscopio</td> estereoscópico GyroMini <td>Labnet</td><td>S0500</td><td></td></tr><tr><td>equipado con un objetivo PlanApo 1.0x</td><td></td> Cuchillas de un solo filo de acero inoxidable Leica<td></td><td></td></tr><tr><td>, .009"</td><td>GEM Personna</td><td>62-0176</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte</td><td></td><td></td> de uñas transparente<td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS Orgánicos</td><td>32737-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

disección del saco endolinfático de ratones

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

Cada paso de esta microdisección de un saco endolinfático de tipo salvaje de un ratón postnatal de día 5 (P5) se detalla en el video asociado y las instantáneas de los pasos clave de esta disección y apertura del saco endolinfático se presentan en la Figura 1 y la Figura 2. 
Los resultados representativos de las disecciones del saco endolinfático con fluorescencia de tdTomato en el día embrionario 16.5 (E16.5), P5 y P30, siguiendo este protocolo, se presentan en la Figura 3 y en la Figura Suplementaria 1 y la Figura Suplementaria 2. Utilizando un microscopio de disección con fluorescencia, el saco endolinfático se puede visualizar fácilmente en el cráneo después de la extracción del cerebro en ratones portadores del transgén Tg(ATP6V1B1-Cre) en presencia del reportero de la expresión de Cre: Ai9 (LSL-RCL-tdT) (ver Figura 3A-B, y Figura 1 Suplementaria para imágenes capturadas en luz incidente y fluorescencia tdTomato del saco endolinfático en diferentes etapas de la disección). En estos ratones, Cre se expresa como un mosaico en las células a lo largo del saco y el conducto endolinfático (Figura 3, véase también la Figura 2 suplementaria para la visualización del saco endolinfático con frente a sin reportero fluorescente). Aunque la expresión de este reportero no es específica para la expresión endógena de Atp6v1b1, que está restringida a las células ricas en mitocondrias del saco endolinfático16, uno de los dos tipos celulares de este epitelio (Figura 5E), es una ayuda útil para identificar y diseccionar el saco endolinfático.
En la Figura 4 se presentan los oídos internos disecados de un modelo de ratón para el agrandamiento del acueducto vestibular. En comparación con los compañeros de camada de control, los sacos endolinfáticos y los conductos de los ratones deficientes para SLC26A4 (pendrín) están agrandados.
En la Figura 5 se muestran imágenes representativas de la inmunohistoquímica del saco endolinfático intacto con y sin tejido conjuntivo. También se presentan los resultados de la inmunohistoquímica del saco endolinfático abierto de un ratón P5 de tipo salvaje (Figura 5F-G). El saco endolinfático está compuesto por una sola capa de epitelio plegada en una estructura en forma de bolsa, que contiene en su luz endolinfa. Este epitelio consta de dos tipos de células, células ricas en mitocondrias y células ricas en ribosomas (Figura 5E). Un saco endolinfático de toda la montura se aplanará porque la endolinfa ya no está presente. El saco aparecerá como dos capas entrelazadas de epitelio, lo que dificulta la determinación de la localización subcelular de las proteínas expresadas en este epitelio. Al abrir el saco endolinfático, se puede visualizar fácilmente el epitelio de una sola capa y se puede determinar de manera más definitiva la distribución relativa de las proteínas de interés, con respecto a la luz del saco endolinfático. Se puede determinar con mayor precisión un posible enriquecimiento apical (luminal, donde estaría la endolinfada) frente al basal de estas proteínas. A modo de ejemplo, SLC26A4 está enriquecido en el lado apical de las células ricas en mitocondrias (Figura 5F).
<img alt="Diagramas de disección del oído interno, mapeo detallado de cócleas y nervios, configuración de estudio anatómico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1. Disección del saco endolinfático de un ratón de tipo salvaje en el día 5 postnatal (P5). (A) Esquema del laberinto membranoso del oído interno de un ratón desarrollado (derecha). Se indica la ubicación del saco endolinfático, la cóclea y las estructuras vestibulares. Esta cifra ha sido modificada a partir de Honda et al.16. (B) Sección sagital media que muestra el hemicráneo izquierdo. Se indica la ubicación del saco endolinfático (flecha). (O, occipital; F, frontal) (C) Cápsula ótica junto con la parte escamosa del hueso temporal. (D) Puntos de referencia importantes superpuestos en el cuadro punteado en el panel C. (ES, saco endolinfático; DE: conducto endolinfático; VA: acueducto vestibular; ASC: canal semicircular anterior; PSC: canal semicircular posterior; CC, crus comunes; SS: seno sigmoideo) (E) Ilustración esquemática de la sección transversal junto con la línea blanca continua en el panel D a través del saco endolinfático. El lado proximal del saco endolinfático está cubierto por un canal óseo llamado acueducto vestibular, junto con el conducto endolinfático. En el lado distal, el saco endolinfático, rodeado de tejido conjuntivo (TC), se extiende y sobresale hacia el exterior del laberinto óseo y se intercala entre la duramadre (DM) y el seno sigmoideo con la parte escamosa del hueso temporal (TB). (F) Se utiliza una aguja fina para cortar alrededor del saco endolinfático (siguiendo las líneas amarillas punteadas en el panel D). (G) La preparación se retira cuidadosamente del hueso temporal sosteniendo el tejido en la posición indicada por el asterisco (*, también mostrado en el panel E) y despegándolo. (H) Un saco endolinfático completo aislado con los tejidos circundantes. (I) Versión esquemática de este saco endolinfático aislado con los tejidos circundantes. (J) Saco endolinfático aislado sin tejidos circundantes. Barras de escala: 2 mm (B), 1 mm (J). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Series de disección, exposición del esófago, diagramas anatómicos, muestras de tejido, herramientas quirúrgicas utilizadas." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2. Disección del saco endolinfático abierto de un ratón P5 de tipo salvaje. (A) En el paso 2.4, la línea de incisión en el acueducto vestibular se coloca ligeramente anterior (línea punteada roja) para hacer una incisión en la luz del saco endolinfático. (B) Sostenga la parte del tallo de la preparación, inserte una aguja de calibre 27 en el lumen y muévala para cortar el saco endolinfático en dos hojas. (C) Ilustración esquemática del panel B. (D) Sujete el borde de cada hoja con pinzas y sepárelas unas de otras. (E) Ilustración esquemática del panel D. (F) El saco endolinfático se separa en dos láminas, incluyendo el epitelio y los tejidos circundantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Desarrollo del cerebro del ratón, microscopía de fluorescencia, etapas E16.5 a P30, imágenes del tejido neural." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3. Disección de R26LSL-RCL-tdT/+; Saco endolinfático de ratón Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn en E16.5, P5 y P30. Todas las imágenes presentadas muestran la fluorescencia de tdTomato obtenida utilizando un microscopio estereoscópico con un objetivo 1 x equipado para la detección de la fluorescencia de tdTomato. (A, B) Sección sagital media del cráneo de un E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Ratón Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn antes de (A) y después de (B) extracción de la mitad del cerebro. La fluorescencia de tdTomato delinea la posición del oído interno. El saco endolinfático es fácilmente visible incluso sin disección (punta de flecha). (C, E, G) Oídos internos aislados de ratones E16.5, P5 y P30, respectivamente. (D, F y H) Imágenes de mayor aumento de los correspondientes sacos y conductos endolinfáticos microdisecados. En P30, el conducto endolinfático está encapsulado en el hueso, lo que hace que sea particularmente difícil de aislar. Barras de escala: 2 mm (A, B, C, E, G), 500 μm (D, F, H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Dos secciones del oído interno, Slc26a4+/− y Slc26a4−/−, se muestran en una imagen de microscopio para su estudio genético." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4. Anatomía macroscópica de la cápsula ótica con un saco endolinfático agrandado. Oídos internos de los ratones Slc26a4+/- (izquierda) y Slc26a4-/- (derecha) en P105. El acueducto vestibular y el saco y conducto endolinfático (líneas punteadas negras) están agrandados en el ratón Slc26a4-/- en comparación con los de un ratón Slc26a4+/- . Barra de escala: 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Ensayo de inmunofluorescencia, proteínas SLC26A4 y ACTB, diagrama de células epiteliales, resultados de microscopía." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5. SLC26A4 expresión de células ricas en mitocondrias en el epitelio del saco endolinfático en E16.5 y P5. (A, B) Saco endolinfático aislado de ratón E16.5 marcado con anticuerpo anti-SLC26A4 (verde) y faloidina que marca β-actina (ACTB, rojo). (C) Una imagen de baja ampliación de un saco endolinfático abierto de un ratón P5 marcado con un anticuerpo anti-SLC26A4 (verde). La faloidina (ACTB, rojo) se puede utilizar para resaltar la presencia del saco endolinfático, así como el tejido conjuntivo que lo rodea. (D) Saco endolinfático aislado marcado con un anticuerpo anti-SLC26A4 (verde). (E) Ilustración esquemática del epitelio del saco endolinfático destacando la presencia de dos tipos de células: las células ricas en mitocondrias, cuya superficie apical está cubierta de microvellosidades, y las células ricas en ribosomas. (De F a G) Imágenes de gran aumento del epitelio del saco endolinfático en P5, después de abrir el saco endolinfático y marcarlo con un anticuerpo anti-SLC26A4 (verde) y faloidina (ACTB, rojo). Una imagen representativa a nivel de la membrana apical se muestra en G, y una sección transversal reconstruida de la pila z al nivel de la línea blanca punteada se muestra en F. El núcleo de las células está marcado con DAPI (azul). Barras de escala: 100 μm (A, B); 200 μm (C, D) ; 20 μm (F, G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig5v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1. Luz incidente e imágenes de fluorescencia tdTomato correspondientes de un P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn oído interno de ratón en tres pasos de la disección. El saco y el conducto endolinfático se pueden visualizar fácilmente mediante la fluorescencia de tdTomato. (A-B) Región del oído interno en la parte posterior de la mitad del cráneo intacto de un P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Ratón Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn. (C-D) La extirpación de la piel y parte del cráneo permite una mejor visualización de la región del saco endolinfático. (E, F) Oído interno aislado con el saco endolinfático todavía asociado con tejido conjuntivo. (A, C, E) Imágenes capturadas con luz incidente. (B, D, F) tdFluorescencia del tomate del tejido correspondiente. Barras de escala: 2 mm (A-B), 1 mm (C-F). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/JoVE_HondaLee_SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2. Comparación de la fluorescencia de sacos endolinfáticos aislados de R26LSL-RCL-tdT/+; Ratones compañeros de camada Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn y R26LSL-RCL-tdT/+ en E16.5 y P5. La fluorescencia del tomate tdTomato facilita enormemente el reconocimiento del saco y el conducto endolinfático. (A-C) Sacos endolinfáticos microdisecados de E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (A) y ratones compañeros de camada R26LSL-RCL-tdT/+ (B, C). (D-F) Sacos endolinfáticos microdisecados de P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (D) y ratones compañeros de camada R26LSL-RCL-tdT/+ (E, F). (A, B, D, E) tdFluorescencia del tomate. (C, F) Imágenes de luz incidente correspondientes a B y E. Barras de escala: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/JoVE_HondaLee_SupplementaryFigure2.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Disección del saco endolinfático de ratones

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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La estría vascular es vital para la generación de potencial endococlear. Aquí, presentamos la disección de la estría vascular del ratón adulto para la secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción.

Disección de estrías vasculares de ratón adulto para secuenciación de un solo núcleo o inmunotinción

En este trabajo describimos una técnica para la extracción de órganos terminales vestibulares humanos en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía y su análisis mediante inmunotinción.

Extracción de órganos terminales vestibulares en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía

Aquí se presenta un protocolo para evaluar los vasos linfáticos meníngeos (MLVs) de ratón, que desempeñan un papel importante en múltiples enfermedades neurológicas. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método integrado que permita tanto la evaluación funcional del drenaje de trazadores como la caracterización morfológica detallada de la red de MLVs dorsales.

Protocolo integrado para la evaluación de linfáticos meníngeos: inyección de cisterna magna, imagen de ganglios linfáticos, disección meníngea y tinción de montaje completo

Aprenda a diseccionar el saco endolinfático de ratones mediante microdissección precisa. Este protocolo permite aislar el tejido para estudios moleculares, inmunohistoquímica y análisis transcriptómico en investigación del oído interno.

Disección del saco endolinfático de ratones

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