Name: Extracción, purificación y perfilado de gangliósidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprenda métodos de extracción y purificación de gangliósidos para estudios de neurociencia y biología celular. Estas técnicas permiten maximizar el rendimiento y realizar análisis cualitativos y semicuantitativos eficientes.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención U01CA241953 del Fondo Común para la Glicociencia de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). MJP fue apoyado por el Programa de Interfaz Química-Biología en Johns Hopkins (T32GM080189).

La recolección de tejidos se realizó en condiciones autorizadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins.
1. Extracción de gangliósidos a pequeña escala y purificación parcial
PRECAUCIÓN: Use ventilación adecuada cuando trabaje con solventes volátiles y tóxicos. Evite el plástico en todas partes; los disolventes extraerán componentes químicos de muchos plásticos que interfieren con los análisis posteriores. El politetrafluoroetileno (PTFE) es una excepción; Se deben usar cierres revestidos de PTFE para tapar los viales de almacenamiento de vidrio.
<ol><li>Extracción<ol>
<li>Pesar un solo cerebro de ratón fresco o descongelado (o medio cerebro sagital, ~ 0.2-0.5 g) y colocarlo en un homogeneizador Potter-Elvehjem prechillado en un cubo de hielo. NOTA: Los cerebros previamente congelados se pueden usar después de la descongelación a 0-4 ° C.</li>
		<li>Añadir 4,1 mL por g de peso de agua húmeda de tejido y homogeneizar con 10 golpes. NOTA: Las proporciones precisas de disolventes son clave para una extracción y partición óptimas, el objetivo es cloroformo-metanol-acuoso (4: 8: 3) asumiendo que el tejido cerebral es 80% acuoso.</li>
		<li>Añadir 13 ml por g de peso húmedo tisular de metanol, cambiar a temperatura ambiente (22 °C) y mezclar. NOTA: La solución aparecerá nublada. La adición de metanol en este paso, sin cloroformo, optimiza la precipitación de proteínas. Todos los pasos posteriores son a temperatura ambiente (22 °C).</li>
		<li>Transfiera a un tubo de vidrio de paredes gruesas con tapón de rosca con una tapa de rosca forrada de PTFE a temperatura ambiente (22 ° C) y mezcle bien. Agregue 6.5 ml por g de peso húmedo tisular de cloroformo, tapa y mezcle bien. Centrifugadora a 450 x g durante 15 min. Transfiera el sobrenadante transparente a un tubo fresco con tapa de rosca y mida el volumen, "volumen de extracto recuperado".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Partición<ol>
<li>Agregue 0.173x "volumen de extracto recuperado" de agua al sobrenadante transparente, la tapa, el vórtice y la centrífuga como se describe en el paso 1.1.4. NOTA: El objetivo es tener cloroformo-metanol-acuoso en la proporción 4:8:5.6. La mezcla estará turbia y se resolverá en dos fases: una fase superior rica en acuoso y una fase inferior rica en cloroformo en una proporción de ~ 4: 1. Espere 60 minutos o centrífuga a 450 x g durante 15 minutos para una separación de fase completa.</li>
		<li>Transfiera la fase superior, que contiene los gangliósidos, a un tubo de vidrio fresco con una tapa de rosca forrada de PTFE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cromatografía de cartucho de fase inversa<ol>
<li>Con una jeringa de vidrio de 5 ml, lave un cartucho de extracción en fase sólida tC18 (400 mg) con 3 ml de metanol, luego 3 ml de cloroformo-metanol-agua (2:43:55). Cargue la fase superior del paso 1.2.2 en el cartucho tC18 con la misma jeringa de vidrio, recoja el flujo y vuelva a cargarlo en la columna para optimizar la adsorción.</li>
		<li>Con la jeringa de vidrio, lave el cartucho con 3 ml de cloroformo-metanol-agua (2:43:55) y luego 3 ml de metanol-agua (1:1).</li>
		<li>Eluya los gangliósidos con 3 ml de metanol en un tubo fresco con tapa de rosca. Evaporar hasta la sequedad bajo una suave corriente de nitrógeno a ≤ 45 °C. Disolver en metanol a 1 mL por g de peso húmedo del tejido original.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Extracción y purificación de gangliósidos a gran escala
PRECAUCIÓN: Cuando trabaje con disolventes volátiles, use licuadoras resistentes a explosiones. No utilice plásticos excepto PTFE. El tetrahidrofurano, el cloroformo y el éter etílico son compuestos orgánicos volátiles tóxicos. Trabaje en una campana extractora con guantes protectores y gafas de seguridad.
<ol><li>Extracción<ol>
<li>Descongelar el cerebro bovino congelado a 4 °C durante varias horas. Diseccionar la materia gris de las meninges y la materia blanca. NOTA: El siguiente procedimiento se describe para 100 ± 20 g de materia gris cerebral aislada y es escalable.</li>
		<li>Coloque 100 g de materia gris cerebral en una licuadora y agregue 1 ml por g de peso húmedo cerebral de 10 mM de tampón de fosfato de potasio refrigerado pH 6.8. Homogeneizar en bajo durante 20 s. Añadir 8 mL de tetrahidrofurano por g de peso húmedo cerebral y homogeneizar en bajo durante 10 s. Decantar en botellas centrífugas de vidrio y centrifugar a 5.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente (22 °C).</li>
		<li>Recoja el sobrenadante, mida su volumen y transfiéralo a un embudo separador de vidrio. Añadir 0,3 ml de éter etílico por ml del sobrenadante. Agite vigorosamente, luego deje reposar sin ser molestado durante 30 minutos durante los cuales se separan dos fases, una fase superior de éter y una fase acuosa inferior. Recoja la fase inferior, que contiene los gangliósidos, en una botella de vidrio con una tapa forrada de PTFE.</li>
		<li>A la fase superior (éter) que queda en el embudo separador, agregue 0,1 ml de agua por ml de sobrenadante original (paso 2.1.3). Agitar vigorosamente, dejar que las fases se separen, recoger la fase inferior (acuosa) y combinar con la fase inferior anterior. Evaporar las fases inferiores combinadas a un polvo seco y pesar.</li>
	</ol></li>
	<li>Saponificación<ol>
<li>Añadir 10 mL de NaOH acuoso de 100 mM por g de polvo en un tubo sellado. Mezclar e incubar a 37 °C durante 3 h. Deje enfriar y ajustar a pH 4.5 mediante la adición en gota de HCl acuoso de 100 mM. Mida el volumen y transfiéralo a un embudo separador de vidrio. NOTA: Los ácidos siálicos son ácido lábil; evitar la acidificación por debajo de pH 4.5.</li>
		<li>Sobre la base del volumen acuoso, agregue 2.67 volúmenes de metanol, mezcle suavemente, luego agregue 1.33 volúmenes de cloroformo para crear una solución monofásica de cloroformo-metanol-acuoso (4: 8: 3). Mezclar bien.</li>
		<li>Sobre la base del volumen acuoso original, agregue 2.6 volúmenes de agua para llevar la mezcla a cloroformo-metanol-acuoso a una proporción de 4: 8: 5.6. Agite vigorosamente, luego deje reposar sin ser molestado para separar dos fases, una fase superior polar que contiene los gangliósidos y una fase inferior no polar. Recoge la fase superior en una botella de vidrio con una tapa forrada de PTFE. NOTA: Los lípidos no sialados no aparecerán en las placas de cromatografía de capa delgada (TLC) teñidas con resorcinol, pero aparecerán cuando se use una tinción de p-anisaldehído. El propósito de esta saponificación es eliminar los compuestos O-acetilados como los fosfolípidos.</li>
	</ol></li>
	<li>Cromatografía en fase inversa<ol>
<li>Prelavado de un cartucho de extracción en fase sólida tC18 a gran escala (10 g) pasando 50 ml de cada uno de los siguientes tres disolventes a través de la columna utilizando vacío o presión (&lt;1 min cada lavado): metanol, metanol-agua (1:1), luego cloroformo-metanol-agua (2:43:55). Cargue la fase superior del paso 2.2.3 en la columna por vacío o presión, recoja el flujo, recargue y recoja el flujo a través.</li>
		<li>Lave la columna con 30 ml de cloroformo-metanol-agua (2:43:55), luego 30 ml de metanol-agua (1:1), luego eluya los gangliósidos con 50 ml de metanol, y nuevamente con 10 ml de metanol, recogiendo cada lavado y cada elución por separado. Usando TLC (abajo) confirme que el gangliósido está ausente del flujo a través y se lava y eluye en la primera elución (50 ml de metanol). Evaporar los gangliósidos eluidos a un polvo seco y pesar. NOTA: El propósito de la cromatografía tC18 es separar los gangliósidos de menos y más contaminantes polares. El rendimiento mixto de gangliósidos cerebrales después de la saponificación es de ~ 120 mg por g de extracto de cerebro seco (paso 2.1.4). La aparición de gangliósidos por TLC en el flujo a través o lavados indica que la columna de extracción en fase sólida estaba saturada. Después de la elución del metanol, la columna puede ser eluida con cloroformo-metanol (1:1) para capturar menos lípidos polares.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación por HPLC de gangliósidos individuales<ol>
<li>Preparar el disolvente HPLC A: tampón de fosfato de sodio acuoso de acetonitrilo-5 mM pH 5.6 (83:17) y el disolvente B: tampón de fosfato de sodio acetonitrilo-20 mM, pH 5.6 (1:1). Desgasificar ambos disolventes durante 5 min.</li>
		<li>Preequilibre una columna de HPLC (columna de 20 x 250 mm empaquetada con esferas de sílice unidas amina (NH2), diámetro de 5 μm, tamaño de poro de 100 Å) con 100% disolvente A durante 20 min a 5 ml / min. Ajuste un detector de efluentes de columna UV HPLC a 215 nm.</li>
		<li>Disolver el polvo gangliósido de la fase inversa eluido en agua a 5 mg/ml. Inyectar 0,5 ml de la mezcla gangliósida sobre el HPLC y ejecutar el gradiente de disolvente (Tabla 1) a 5 ml/min, recogiendo fracciones. Los gangliósidos aparecerán como picos de A215 con tiempos de retención (gangliósidos cerebrales mayores) de 25-70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 min. Reequilibrar 20 min con disolvente A después de cada carrera. Analizar fracciones por cromatografía de capa fina.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tiempo (min)</td>
			<td>%A</td>
			<td>%B</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>63</td>
			<td>37</td>
		</tr>
<tr>
<td>82</td>
			<td>54</td>
			<td>46</td>
		</tr>
<tr>
<td>82.01</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>92</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Gradiente de disolvente para HPLC.
3. Análisis de cromatografía en capa fina (TLC) de gangliósidos
PRECAUCIÓN: El cloroformo es un compuesto orgánico volátil tóxico. Trabaje en una campana extractora con guantes protectores y gafas de seguridad.
<ol><li>Preparación de disolventes y placas TLC<ol>
<li>Prepare un disolvente corriente de cloroformo-metanol-acuoso 0.25% KCl (60:35:8 por volumen). Vierta en una cámara TLC de vidrio de 10 cm x 10 cm con una cubierta de acero inoxidable para que la profundidad del disolvente sea de ~ 0,5 cm. Cubra y deje equilibrar en un área libre de corrientes de aire durante &gt;10 min. NOTA: Para aislar la cámara TLC de las corrientes de aire, se puede construir o comprar una caja acrílica de 5 lados (Figura 2). No utilice papel de filtro saturado de disolvente dentro de la cámara.</li>
		<li>Coloque una placa TLC de alto rendimiento con respaldo de vidrio recubierta de gel de sílice de 10 cm x 10 cm o 5 cm x 10 cm en un horno de secado a 125 °C durante 10 min. Dejar enfriar. Use un lápiz #2 opaco para dibujar líneas de manchado de 5 mm con separaciones de 2 mm a lo largo de una línea 1 cm por encima de la parte inferior de la placa y al menos 1 cm desde cada lado (Figura 3). Evite perturbar la capa de sílice mientras marca.</li>
		<li>Preparar una mezcla estándar de gangliósidos puros en metanol que contenga 100 μM GM1, 50 μM cada uno de GD1a y GD1b y 33 μM de GT1b. NOTA: Esta mezcla contiene 100 pmol de ácido siálico gangliósido por μL para cada uno de los cuatro gangliósidos, una cantidad que proporciona una fuerte señal colorimétrica por tinción de resorcinol, que depende del ácido siálico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resolución gangliosa<ol>
<li>Lave una jeringa Hamilton de 10 μL con una aguja biselada con metanol. Extraiga 1 μL de metanol en una jeringa de vidrio para llenar el volumen muerto de la aguja y luego 1 μL de muestra o estándar. Coloque la muestra uniformemente en las líneas premarcadas de 5 mm hasta que quede &lt;1 μL de disolvente (metanol) en la jeringa. Deje que la placa se seque a temperatura ambiente (22 °C) después de que se detecten todas las muestras. NOTA: Lave la jeringa con metanol entre la carga de la muestra. Se puede usar un soplador de aire sin calefacción a baja altura para acelerar el secado.</li>
		<li>Coloque la placa manchada y seca en la cámara TLC preequilibrada con el borde inferior sumergido en el disolvente en funcionamiento y cubra y proteja de las corrientes de aire (Figura 2). Permita que el disolvente en funcionamiento avance hacia arriba de la placa por acción capilar hasta que el frente del disolvente alcance dentro de 1 cm de la parte superior de la placa. Retire y marque el frente del disolvente en el borde de la placa con un lápiz. Permita que los disolventes se evaporen completamente, ya sea sin perturbaciones o bajo un flujo de aire suave.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig02.jpg"> Figura 2: Equipo y configuración de Ganglioside TLC. Una cámara de doble canal se llena para ≈ 0,5 cm en ambos lados con disolvente de funcionamiento. La placa se coloca contra un lado con el extremo de origen sumergido en el búfer de funcionamiento. La cámara está cubierta con una caja de acrílico para evitar corrientes de aire. Panel A, vista lateral antes de la inserción de la placa. El nivel de disolvente es visible unos pocos mm por encima del fondo de la cámara; Panel B, vista frontal durante el desarrollo. El frente del disolvente es visible en aproximadamente el 40% del camino hacia arriba de la placa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="3"><li>Tinción gangliosa PRECAUCIÓN: Las manchas de reactivo son tóxicas. El ácido clorhídrico es corrosivo y tóxico. Prepare y rocíe los reactivos en una campana extractora con guantes protectores y gafas de seguridad. NOTA: La placa se puede obtener una imagen para un análisis cualitativo de la imagen o almacenarse quitando las abrazaderas y asegurando la placa de la cubierta en su lugar con cinta transparente. El análisis cuantitativo se puede realizar midiendo la densitometría de los estándares gangliósidos detectados en carriles adyacentes.<ol>
<li>Preparar reactivo en spray de resorcinol para la detección de gangliósidos en función de sus ácidos siálicos. Disolver 6 g de resorcinol en 100 ml de agua para obtener un stock de resorcinol al 6%. Disolver 1 g de CuSO4 en 100 ml de agua para hacer un stock del 1%. A 64.7 ml de agua, agregue 5 ml del stock de resorcinol al 6%, 0.31 ml del stock de CuSO4 al 1%, luego agregue lentamente 30 ml de HCl concentrado y revuelva suavemente. Puede almacenarse a 4 °C durante un mes.</li>
		<li>En una campana de humos químicos, coloque la placa TLC con gangliósidos resueltos, origen final, en una caja de cartón cortada para proteger las paredes de la campana del aerosol ácido. Coloque el reactivo de pulverización de resorcinol en un pulverizador TLC de vidrio, conéctelo a una fuente de nitrógeno presurizado y rocíe ligeramente la placa en diagonal en las direcciones vertical y horizontal. Rocíe la superficie del sorbente TLC de manera uniforme, pero ligera.</li>
		<li>Cubra inmediatamente la placa con una placa de cubierta de vidrio seco limpio de las mismas dimensiones y asegure la placa de cubierta en su lugar con clips aglutinantes (Figura 3). Calentar la placa cubierta a 125 °C durante 20 min. Los gangliósidos aparecerán de color púrpura oscuro sobre un fondo blanco. NOTA: La placa no debe aparecer húmeda cuando se complete la pulverización. Las placas de cubierta se pueden moldear raspando el sorbente de las placas TLC utilizadas anteriormente utilizando una cuchilla de afeitar de un solo filo. PRECAUCIÓN: El polvo de sílice es tóxico para los pulmones. Use una máscara y deseche la sílice en un recipiente sellado.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig03.jpg"> Figura 3: Placa TLC de gangliósido mixto resuelto. Placa TLC de estándares gangliósidos mixtos resueltos (carril izquierdo) y gangliósidos de materia gris bovina mixta purificada (carril derecho) después de la tinción y calentamiento de resorcinol con placa de cubierta de vidrio recortada en su lugar. Los gangliósidos estándar (de arriba a abajo) son GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b y GQ1b. Después del enfriamiento, la placa se puede tomar imágenes y / o la placa de cubierta se puede pegar con cinta adhesiva en su lugar para su almacenamiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="4"><li>Tinción general de lípidos para gangliósidos y fosfolípidos. PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico es tóxico y corrosivo. La adición de ácido concentrado al etanol es exotérmica y debe hacerse lentamente. Prepare el reactivo de tinción en una campana extractora con guantes protectores y gafas de seguridad.<ol>
<li>Prepare la tinción de p-anisaldehído agregando lentamente 15 ml de ácido sulfúrico concentrado a 500 ml de etanol. Revuelva durante 30 minutos para permitir que la solución se enfríe antes de continuar. Agregue 15 ml de p-anisaldehído y revuelva suavemente. Esto puede almacenarse a temperatura ambiente (22 °C) hasta seis meses.</li>
		<li>En una campana de humos químicos, sumerja la placa TLC con gangliósidos resueltos, extremo de origen hacia abajo, en un vaso de precipitados que contenga la mancha de p-anisaldehído. Sumergirse en el frente de carrera durante ≥ 2 s. Retire el TLC de la mancha y deje que drene. Calentar la placa TLC en una placa caliente a baja temperatura para que se desarrolle. NOTA: Los lípidos aparecerán oscuros sobre un fondo púrpura. La solución de tinción se puede recuperar para su uso repetido.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Gangliosides%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Carbohydrate+Chemistry+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li>
<li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li>
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<li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li>
<li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gangliosides%3A+structure%2C+isolation%2C+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li>
<li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li>
</ol>

Los autores no alegan intereses contrapuestos.

Los métodos para la extracción y el aislamiento de gangliósidos a pequeña y gran escala reportados aquí no son únicos: existen muchos enfoques diferentes de extracción y purificación con solventes que proporcionan excelentes resultados12. Los métodos reportados aquí para la purificación a pequeña escala del cerebro, de Fredman y Svennerholm13, demostraron optimizar la recuperación y han demostrado ser robustos y sencillos durante muchos años en nuestro laboratorio. El aisla...

Los gangliósidos se definen como glicoesfingolípidos que contienen uno o más residuos de ácido siálico1. Se expresan principalmente en la superficie celular con su fracción lipídica de ceramida hidrofóbica incrustada en la valva externa de la membrana plasmática y sus glicanos hidrófilos que se extienden hacia el espacio extracelular2. Aunque se distribuyen ampliamente en las células y tejidos de los vertebrados, son particularmente abundantes en el cerebro de los vertebrados3, donde fueron descubiertos y nombrados por primera vez4.
Las estructuras de los glicanos gangliósidos varían y son la base de su nomenclatura (Figura 1). Los glicanos gangliósidos se componen de un núcleo de azúcar neutro que contiene diferentes números y distribuciones de ácidos siálicos. El gangliósido más pequeño, GM4, tiene sólo dos azúcares (ácido siálico unido a la galactosa)5. Los gangliósidos naturales más grandes pueden contener más de una docena de azúcares totales6 o hasta siete ácidos siálicos en un solo núcleo neutro7. Sus fracciones lipídicas de ceramida también varían, teniendo diferentes longitudes de esfingosina y una variedad de amidas de ácidos grasos. En el cerebro de los vertebrados predominan cuatro especies de gangliósidos, GM1, GD1a, GD1b y GT1b. La expresión gangliósida está regulada por el desarrollo, específica del tejido y específica del tipo de célula.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> Figura 1: Principales gangliósidos cerebrales y sus precursores biosintéticos. Las estructuras se muestran utilizando la nomenclatura de símbolos para glicanos11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los gangliósidos funcionan a nivel molecular al involucrar y modular proteínas en sus propias membranas (regulación cis) o al involucrar proteínas de unión a glicanos en el medio extracelular, incluidas las toxinas bacterianas y las lectinas en otras células (reconocimiento trans)3. La unión específica de gangliósidos a proteínas reguladoras y/o la autoasociación con otras moléculas en balsas lipídicas da como resultado cambios en el comportamiento celular que afectan la estructura y función del sistema nervioso, la progresión del cáncer, el metabolismo, la inflamación, las proteinopatías neuronales y las enfermedades infecciosas8. Debido a sus diversas funciones celulares, los métodos para su aislamiento y análisis pueden proporcionar una mayor comprensión de la regulación de los procesos fisiológicos y patológicos. Aquí, se proporcionan métodos validados para la extracción y el análisis rápidos a pequeña escala, y el aislamiento a escala preparativa de gangliósidos del cerebro. Se discuten las oportunidades y desafíos para la aplicación a otros tejidos.

<table><tbody><tr><td>Cerebro bovino,</td><td>pelado PelFreez</td><td>57105-1</td><td></td></tr><tr><td>Ganglioside standards</td><td>Matreya</td><td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de vidrio con tapón revestido de PTFE</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-911-739</td><td></td></tr><tr><td>Botella centrífuga de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-586B</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de vidrio, 16 x 125 mm</td><td>VWR</td><td>60825-430</td><td>para la recogida de fracciones de HPLC</td></tr><tr><td>Embudo separador de vidrio (2 L)</td><td>Pyrex</td><td>6400-2L</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de inyección - Hamilton 1750 estanco al gas 500 y micro; l</td><td>Hamilton</td><td>81265</td><td></td></tr><tr><td>p-Anisaldehído, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A88107</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvhjem Homogeneizador</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td>Elija la opción de volumen adecuada</td></tr><tr><td>Reprosil 100 NH2 10&micro; m Columnas de protección de 5x4mm</td><td>Analytics-Shop</td><td>AAVRS1N-100540-5</td><td></td></tr><tr><td>Reprospher 100 NH2, 5 &mu; m, 250 mm x 20 mm Columna de HPLC</td><td>Analytics-Shop</td><td>Empaquetado a medida</td><td>otros tamaños disponibles</td></tr><tr><td>Resorcinol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30752-1</td><td></td></tr><tr><td>Evaporador rotativo</td><td>Buchi</td><td>R-300</td><td></td></tr><tr><td>Bucle de muestra para inyector modelo 7725 (5 ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57632</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td><td>Aguas</td><td>WAT043350</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 Plus Cartucho Corto, 400 mg</td><td></td><td>Jeringa Waters</td> WAT036810 <td></td></tr><tr><td>Spotting - Hamilton 701N 10 &micro; l</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensayo de paredes gruesas de 13 mm de diámetro con tapas revestidas de PFTE</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-933A</td><td></td></tr><tr><td>Viales roscados de 2 ml con tapas revestidas de PFTE</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-323 Para placas TLC</td> de <td>almacenamiento de gangliósidos</td></tr><tr><td>, HPTLC Gel de sílice 60 F254 Multiformato</td><td>Fisher Scientific</td><td>M1056350001</td><td>La impregnación de fluorescencia (F254) estabiliza el sorbente pulverizador</td></tr> de <tr><td>reactivos TLC</td> de superficie <td>Fisher Scientific</td><td>05-723-26A</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de funcionamiento TLC para placas de 10 x 10 cm</td><td>Camag</td><td>22.5155</td><td></td></tr><tr><td>Waring 1 litro Acero inoxidable resistente a explosiones batidora</td><td>Waring</td><td>E8520</td><td></td></tr></tbody></table>

extracción, purificación y perfilado de gangliósidos

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen uno o más residuos de ácido siálico. Se encuentran en todas las células y tejidos de vertebrados, pero son especialmente abundantes en el cerebro. Expresados principalmente en la valva externa de las membranas plasmáticas de las células, modulan las actividades de las proteínas de la superficie celular a través de la asociación lateral, actúan como receptores en las interacciones célula-célula y son objetivos para patógenos y toxinas. La desregulación genética de la biosíntesis de gangliósidos en humanos da como resultado trastornos congénitos graves del sistema nervioso. Debido a su naturaleza anfipática, la extracción, purificación y análisis de gangliósidos requieren técnicas que han sido optimizadas por muchos investigadores en los 80 años transcurridos desde su descubrimiento. Aquí, describimos métodos a nivel de banco para la extracción, purificación y análisis cualitativos y cuantitativos preliminares de los principales gangliósidos de tejidos y células que se pueden completar en unas pocas horas. También describimos métodos para el aislamiento y purificación a mayor escala de las principales especies de gangliósidos del cerebro. Juntos, estos métodos proporcionan acceso a escala analítica y preparativa a esta clase de moléculas bioactivas.

Los métodos descritos en la sección 1 (pequeña escala) proporcionan gangliósidos en cantidad y pureza suficientes para la determinación cualitativa y cuantitativa de los principales gangliósidos cerebrales. La recuperación del cerebro del ratón es de ~ 1 μmol de gangliósido por g de peso húmedo cerebral (1 nmol / μL) cuando se prepara como se describe. La resolución TLC de 1 μL (1 nmol) utilizando la sección 3 proporciona un amplio material para la detección de resorcinol y resuelve todos los principales gangliósidos cer...

Los gangliósidos son glicoesfingolípidos portadores de ácido siálico que son particularmente abundantes en el cerebro. Su naturaleza anfipática requiere técnicas de extracción y purificación orgánicas / acuosas para garantizar una recuperación óptima y análisis precisos. Este artículo proporciona información general sobre la extracción de gangliósidos a escala analítica y preparativa, la purificación y el análisis de cromatografía de capa delgada.

Extracción, purificación y perfilado de gangliósidos

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Los gangliósidos se expresan en todas las superficies celulares de los vertebrados y son especialmente abundantes en las células nerviosas. Regulan la señalización celular y el reconocimiento célula-célula. Este protocolo introduce el aislamiento y análisis de gangliósidos.Las técnicas se seleccionaron para maximizar los rendimientos de gangliósidos a grandes y pequeñas escalas al tiempo que se racionalizaba la purificación. También se describen métodos para realizar con relativa rapidez análisis de gangliósidos cualitativos y semicuantitativos. El estudio de lípidos, especialmente lípidos polares como los gangliósidos, requiere herramientas y técnicas diferentes a las de trabajar con proteínas o ácidos nucleicos.Este video lo familiariza con cómo trabajar con estas moléculas. Debido a que los solventes como el cloroformo y el tetrahidrofurano disuelven los plásticos comunes, utilizamos botellas y viales de vidrio con tapas forradas de teflón, pipetas de vidrio, vidrio, microjeringes de acero inoxidable y homogeneizadores de vidrio de teflón a lo largo de estos procedimientos. De lo contrario, se producen polímeros plásticos en los productos que pueden interferir con los análisis.Para empezar, añade 4,1 mililitros de agua por gramo de peso húmedo de tejido, y homogeneiza con 10 golpes. Añadir 13 mililitros de metanol por gramo de tejido. Transfiéralo a una temperatura ambiente de 22 grados centígrados y mezcle.Transfiera el tejido a un tubo de paredes gruesas, de vidrio y tapón de rosca con una tapa de rosca forrada de PTFE y mezcle bien. Agregue 6.5 mililitros de cloroformo por gramo de tejido, cúbralo y mezcle bien. Centrifugar a 450 veces g durante 15 minutos.Luego transfiera el sobrenadante transparente a un tubo fresco con tapa de rosca y mida el volumen como volumen de extracto recuperado. Para la partición, agregue 0.173 veces el volumen de agua de extracto recuperado al sobrenadante claro. Luego cúbrelo.Vórtice vigorosamente. Centrifugar a 450 veces g durante 15 minutos. Transfiera la fase superior, que contiene los gangliósidos, a un tubo de vidrio fresco con una tapa de rosca forrada de PTFE.Para realizar cromatografía de cartucho de fase inversa, use una jeringa de vidrio de cinco mililitros para lavar un cartucho de extracción de fase sólida tC18 con tres mililitros de metanol. Luego agregue tres mililitros de cloroformo-metanol-agua en una proporción de dos a 43 a 55. Cargue la fase superior del paso anterior en el cartucho tC18 a través de la misma jeringa de vidrio.Recopile el flujo y vuelva a cargarlo en la columna para optimizar la adsorción. Lave el cartucho con tres mililitros de cloroformo-metanol-agua y luego con tres mililitros de metanol-agua. Eluya los gangliósidos con tres mililitros de metanol en un tubo fresco con tapa de rosca.Evaporar a sequedad bajo una corriente suave de nitrógeno a una temperatura menor o igual a 45 grados centígrados. Disolver en metanol a un mililitro por gramo de peso húmedo del tejido original. Coloque 100 gramos de materia gris cerebral en una licuadora y agregue un mililitro por gramo de peso húmedo cerebral de tampón de fosfato de potasio 10 milimolar refrigerado de pH 6.8.Luego homogeneizar en baja durante 20 segundos. Agregue ocho mililitros de tetrahidrofurano por gramo de peso húmedo cerebral y homogeneice a baja temperatura durante 10 segundos. Decantar en botellas de centrífuga de vidrio, y centrifugar a 5. 000 veces g durante 15 minutos.Recoja el sobrenadante, mida su volumen y luego transfiéralo a un embudo separador de vidrio. Añadir 0,3 mililitros de éter etílico por mililitro del sobrenadante. Agitar vigorosamente.Luego deje que se asiente sin ser molestado durante 30 minutos, durante los cuales se separan dos fases, una fase superior del éter y una fase acuosa inferior. Recoja la fase inferior, que contiene los gangliósidos, en una botella de vidrio con una tapa forrada de PTFE. A la fase superior de éter que queda en el embudo separador, agregue 0,1 mililitros de agua por mililitro de sobrenadante original del paso anterior.Agitar vigorosamente. Permita que las fases se separen. Luego recoja la fase acuosa inferior y combínela con la fase inferior previamente recolectada.Evaporar las fases inferiores combinadas a un polvo seco y pesarlo. Para realizar cromatografía de fase inversa, prelavado de un cartucho de extracción en fase sólida tC18 a gran escala pasando 50 mililitros de disolventes a través de la columna utilizando vacío o presión durante menos de un minuto por lavado. Cargue la fase superior desde la separación de la fase posterior a la saponificación en la columna por vacío o presión.A continuación, recoja el flujo a través, vuelva a cargarlo y vuelva a recoger el flujo para su posterior análisis. Lave la columna con 30 mililitros cada uno de cloroformo-metanol-agua, seguido de metanol-agua. Luego eluya los gangliósidos con 50 mililitros de metanol y luego nuevamente con 10 mililitros de metanol.Recoge cada lavado y elución por separado. Use cromatografía de capa delgada, o TLC, para confirmar que los gangliósidos están ausentes del flujo y lavados y eluidos en la primera elución de metanol. Evaporar los gangliósidos eluidos a un polvo seco y pesarlos.Para realizar TLC, vierta el disolvente corriente en una cámara TLC de vidrio de 10 por 10 centímetros con una cubierta de acero inoxidable para que la profundidad del disolvente sea de 0,5 centímetros. Cubra la cámara y deje que se equilibre durante unos 10 minutos. Lave una jeringa Hamilton de 10 microlitros con una aguja biselada con metanol.Extraiga un microlitro de metanol en una jeringa de vidrio para llenar el volumen muerto de la aguja y luego un microlitro de muestra o estándar. Coloque la muestra uniformemente en las líneas premarcadas de cinco milímetros hasta que quede menos de un microlitro de disolvente de metanol en la jeringa. Deje que la placa se seque a 22 grados centígrados después de que se detecten todas las muestras.Coloque la placa manchada y seca sobre la cámara TLC preequilibrada con el borde inferior sumergido en el disolvente de funcionamiento. Permita que el disolvente en funcionamiento avance hacia arriba de la placa por acción capilar hasta que el frente del disolvente alcance dentro de un centímetro de la parte superior de la placa. Retire y marque el frente del disolvente en el borde de la placa con un lápiz.Permita que los disolventes se evaporen completamente, ya sea sin perturbaciones o bajo un flujo de aire suave. En una campana de humos químicos, coloque la placa TLC con el extremo de origen de gangliósidos resuelto boca abajo en una caja de cartón cortada para proteger las paredes de la campana del aerosol ácido. Coloque el reactivo de pulverización de resorcinol en un pulverizador TLC de vidrio.Adjúntelo a una fuente de nitrógeno presurizado y rocíe ligeramente la placa en diagonal en las direcciones vertical y horizontal. Cubra inmediatamente la placa con una placa de cubierta de vidrio limpia y seca de las mismas dimensiones, y asegure la placa de cubierta en su lugar con clips de aglutinante. Calentar la placa cubierta a 125 grados centígrados durante 20 minutos.Los gangliósidos aparecerán de color púrpura oscuro sobre un fondo blanco. Para realizar la tinción lipídica, sumerja la placa TLC con el origen de gangliósidos resueltos de lado hacia abajo en un vaso de precipitados que contenga la tinción de anisaldehído. Sumérgete en el frente de carrera durante poco más de dos segundos.Luego deje que drene. Calentar la placa TLC en una placa caliente a baja temperatura para que se desarrolle. Este protocolo proporciona gangliósidos en cantidad y pureza suficientes para la determinación cualitativa y cuantitativa.La resolución TLC de un microlitro proporciona un amplio material para la detección de resorcinol y resuelve todos los principales gangliósidos cerebrales para ratones de tipo salvaje y genéticamente modificados. Aunque los gangliósidos mixtos preparados no están libres de otros lípidos importantes, son de suficiente pureza para la determinación espectrométrica de masas, ya sea como gangliósidos purificados nativos en modo negativo o después de la premetilación en modo positivo. La purificación a gran escala incluye extracción, saponificación y resolución de HPLC para proporcionar gangliósidos cerebrales principales purificados adecuados para experimentos biológicos y para modificaciones químicas y enzimáticas adicionales.Se muestra un perfil de HPLC ejemplar y el posterior análisis de TLC. El tratamiento alcalino, o saponificación, es necesario para hidrolizar y eliminar los fosfolípidos contaminantes, pero también hidrolizará las modificaciones naturales de los gangliósidos, como los ácidos siálicos O-acetilados, que pueden ser importantes en algunos contextos. Las proporciones precisas de disolventes para la extracción, la partición de disolventes y la resolución de TLC son fundamentales para mejorar la recuperación, la pureza y los análisis.Desde el cáncer hasta el metabolismo y la función cerebral, los gangliósidos son modificadores fisiológicos y objetivos terapéuticos. El aislamiento gangliósido, la purificación y los análisis son piedras angulares para el descubrimiento biomédico y el desarrollo terapéutico.

ganglioside-extraction-purification-and-profiling

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un método específico y sensible para profundizar en el perfil de expresión de los antígenos de glucoesfingolípidos en órganos y células inmunes se describe. El método se aprovecha de la espectrometría de masas de iones trampa permitiendo paso a paso fragmentación de las moléculas de glucoesfingolípidos para el análisis estructural, en comparación con los estándares de síntesis química.

Análisis espectrométrico de masas de Antígenos glicoesfingolípido

Con el fin de explorar exhaustivamente la diversidad de glicanos ligados a O, se aplica un nuevo procedimiento para la eliminación de β reductor en gel, combinado con permetilación y un método rápido de partición de fase, al análisis de glicanos ligados a O liberados directamente de glicoproteínas resueltas por SDS-PAGE y susceptibles de análisis glicómico posterior por espectrometría de masas.

Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas

Se desarrolló un protocolo de alto rendimiento para la purificación combinada de proteómica y glicómica y la cuantificación de LC-MS/MS en plasma. El análisis de desamidación de los motivos de glicosilación ligados a N fue específico para los sitios desglicosilados. La cuantificación precisa de N-glicanos se logró acoplando la separación de N-glicanos asistida por filtro a la normalización de la individualidad al marcar con la estrategia de etiquetas de hidrazida de glicano.

Un Glicómica cuantitativa y Proteómica estrategia de purificación combinada

Se describe un protocolo de tinción estándar de anticuerpos para su uso en la microscopía para determinar la expresión en la membrana y la localización de los gangliósidos en reposo y células T CD4 + vírgenes humanos activados. También se describen en tiempo real PCR experimentos usando &lt;40.000 células que no requieren kits adicionales bajos de ARN de entrada.

Preparación de CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células T para el Análisis de GD3 y GD2 gangliósidos membrana Expresión mediante microscopía

Este documento describe una metodología para preparar muestras de tejido cardiovascular para el análisis de MS que permite (1) el análisis de composición de proteínas ECM, (2) la identificación de los sitios de glicosilación, y (3) la caracterización de la composición de formas de glicano. Esta metodología se puede aplicar, con modificaciones menores, para el estudio de la ECM en otros tejidos.

Glycoproteomics de la matriz extracelular: Un método para el análisis glucopéptidos Intacto El uso de la espectrometría de masas

Un enfoque modular para la síntesis de N- glicanos para enganchar a un vidrio recubierto de óxido de aluminio slide (diapositiva ACG) como un microarray de glicanos se ha desarrollado y ha demostrado su uso para la elaboración de perfiles de un VIH ampliamente neutralizante del anticuerpo.

Chemo-enzimático síntesis de N- glicanos para el desarrollo de la matriz y el anticuerpo del VIH perfiles

La inmunoglobulina G (IgG) N-glicano se caracteriza mediante cromatografía de interacción hidrófila UPLC. Además, la estructura de IgG N-glicano está claramente separada. Presentado aquí es una introducción a este método experimental para que pueda ser ampliamente utilizado en entornos de investigación.

Inmunoglobulina G Análisis de N-Glycan por Cromatografía Líquida Ultra-Performance

Este protocolo detalla el método de glicoproteómica guiada por glucómicos, una tecnología ómica integrada que ofrece información completa sobre el glicoproteoma heterogéneo en microambientes tumorales complejos necesarios para comprender mejor la glicobiología de los cánceres.

La glicoproteómica guiada por glucómica facilita el perfil completo del glicoproteoma en microambientes tumorales complejos 

En este trabajo se presenta un protocolo detallado para la liberación de O-glicanos de las mucinas, y la posterior desalado, permetilación y análisis mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.

Perfilado de O-glicanos de mucina permetilada mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz

Se desarrolló un protocolo para la preparación de mitocondrias purificadas a partir de células microgliales, el aislamiento de proteínas mitocondriales para la liberación de N-glicanos y la detección rápida de glicanos mitocondriales subcelulares mediante ionización por electrospray de desorción láser asistida por matriz infrarroja acoplada a espectrometría de masas de analizador de masas precisa de alta resolución.

Preparación mitocondrial de la microglía para el análisis de glicanos

Aprenda métodos de extracción y purificación de gangliósidos para estudios de neurociencia y biología celular. Estas técnicas permiten maximizar el rendimiento y realizar análisis cualitativos y semicuantitativos eficientes.

Extracción, purificación y perfilado de gangliósidos

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