Disección de las propiedades mecanoenzimáticas de miosinas procesivas con espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza

La espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza es una técnica de molécula única basada en pinzas láser que permite investigar la quimiomecánica de motores de miosinas bajo carga con la más alta resolución de tiempo. Esta técnica permite sondear eventos muy rápidos en la producción de fuerza manteniendo la fuerza constante durante cada fase de la interacción motora con un control total de la direccionalidad de la fuerza. Al hacer los ajustes apropiados, este protocolo podría aplicarse fácilmente a otros tipos de motores de proceso, incluidas las quinesinas y las dineínas, para descubrir la regulación por la fuerza.

Después de montar un conjunto de deflectores acústico-ópticos en un traductor lineal, tome un iris y ajuste su apertura para que se ajuste al tamaño de la apertura posterior del objetivo. Reemplace el objetivo con el iris centrado en la carcasa del objetivo roscada. Mueva el traductor hacia el rayo láser hasta que la parte del haz bloqueada por el cristal piezoeléctrico sea visible después del iris, y gire el traductor ligeramente hacia atrás hasta que el haz llene completamente la abertura del iris.

Para preparar perlas de sílice en acetato de pentilo, primero diluya 20 microlitros de perlas de sílice sólida al 10% de 1.2 micras en 1-1.5 mililitros de acetona con vórtice y 30 segundos de sonicación. Después de la sonicación, recoja las perlas por centrifugación y vuelva a suspender el pellet de perla en 1 mililitro de acetona fresca para un segundo lavado. Después del segundo lavado de acetona, lavar las perlas tres veces en 1 mililitro de acetato de pentilo fresco por lavado en las mismas condiciones de centrifugación, y resuspender el pellet en 100 microlitros de 1% de nitrocelulosa y 900 microlitros de acetato de pentilo.

A continuación, use un pedazo de tejido de laboratorio empapado en etanol puro para limpiar cuidadosamente un cubreobjetos de vidrio de 24 x 24 milímetros antes de usar pinzas limpias para enjuagar el vidrio directamente en el etanol y permitir que el cubreobjetos se seque bajo un suave flujo de nitrógeno. Vortex y sonicar el stock de perlas de sílice preparado durante 30 segundos y usar un cubreobjetos de 24 x 60 milímetros limpiado con etanol para untar 2 microlitros de solución de perlas de sílice en la superficie del cubreobjetos más pequeño. Mientras las perlas se secan, limpie un portaobjetos de 26 x 76 milímetros como se demuestra, y coloque dos líneas de 60-100 micras de espesor de 3 milímetros de doble cara pegadas con cinta adhesiva en los bordes largos de la diapositiva.

Con unas pinzas limpias, coloque el cubrecubierto recubierto de cuentas sobre la cinta con las perlas orientadas hacia el interior de la cámara de deslizamiento y llene la cámara con tampón de fosfato de 15 milimolares y una solución flotante de perlas de poliestireno. Luego, selle la cámara con grasa de silicona. Para calibrar la relación píxel-nanómetro de la cámara de campo claro, adquiera una primera imagen de una cuenta de sílice en la superficie del cubreobjetos aproximadamente a 5 micras del centro del campo de visión.

Mueva el escenario para desplazar la cuenta 10 micras hacia el centro del campo de visión y tome una segunda imagen. Calcule la constante de calibración de la cámara midiendo la distancia de píxeles entre dos posiciones del talón. Para calibrar la posición de la trampa, atrape una sola partícula flotante en una trampa y mueva los deflectores acústico-ópticos en pasos de 0,2 megahercios, adquiriendo una imagen de la partícula y la frecuencia correspondiente de los deflectores para cada paso.

Luego, repita la calibración de la segunda trampa de la misma manera. Para calibrar la potencia y la rigidez de la trampa, atrape una sola partícula en cada trampa y desplace ambas trampas utilizando los deflectores acústico-ópticos en pasos de 0,2 megahercios, registrando un movimiento browniano de la partícula en ambas trampas con detectores de fotodiodos de cuadrante y la frecuencia correspondiente de los deflectores acústico-ópticos. Obtenga constantes de calibración ajustando una función lorentziana a un espectro de potencia del movimiento browniano registrado.

Para ensamblar una muestra para la medición, agregue 1 miligramo por mililitro de BSA biotinilada a una nueva cámara con perlas de sílice en la superficie del cubreobjetos. Después de 5 minutos, lave la cámara con tampón AB y agregue 1 miligramo por mililitro de estreptavidina a la cámara. Después de 5 minutos, lavar la cámara como se demostró y agregar 3 meromiosina pesada biotinilada nanomolar Myosin-5B en tampón M5B suplementado con 2 calmodulina micromolar.

Después de 5 minutos, lavar la cámara tres veces con 1 miligramo por mililitro de BSA biotinilada suplementada con 2 micromolares de Calmodulina en tampón AB y esperar 3 minutos después del lavado final. Fluya la mezcla de reacción y selle la cámara con grasa de silicona. Para medir la muestra, coloque la cámara en la etapa del microscopio y mueva el objetivo hasta que las perlas flotantes de alfa-actinina estén enfocadas.

Encienda una trampa y atrape una cuenta. Una vez que la primera trampa esté ocupada, mueva el traductor para colocar la cuenta atrapada cerca de la superficie del cubreobjetos para evitar atrapar varias cuentas, y atrape una cuenta en la segunda trampa. Desplazar la muestra a través de los traductores de largo alcance para localizar filamentos de actina de al menos 5 micras de longitud dentro de la solución.

Cuando se haya detectado un filamento, mueva la muestra para permitir que una cuenta atrapada se acerque a un extremo del filamento. Una vez que se haya unido el filamento, ajuste la distancia del talón a la longitud aproximada del filamento y mueva la plataforma para crear un flujo en la dirección del talón no unido. El filamento se estirará por el flujo y eventualmente se unirá a la segunda cuenta.

El complejo resultante se llama mancuerna"Para establecer el contacto actina-miosina, separe suavemente las dos trampas y ajuste el filamento a niveles de pretensión de hasta aproximadamente 3 piconewtons. Para sondear la rigidez de la mancuerna, haga que una trampa oscile en una onda triangular cambiando la frecuencia de un deflector acústico-óptico y verificando la consiguiente transmisión del movimiento a la cuenta de arrastre a través de su señal de posición. Mueva el escenario para colocar la mancuerna en la proximidad de una cuenta de sílice de pedestal y ajuste la altura de la mancuerna para que el filamento de actina entre en contacto con la superficie de la perla de sílice.

Como se observa en este registro de posición representativo, cuando el motor de miosina no está interactuando con el filamento de actina, las perlas atrapadas se mueven a una velocidad constante contra la fuerza de arrastre viscosa de la solución. Una vez que el motor de miosina comienza a interactuar con el filamento, la fuerza transportada por el filamento en movimiento se transfiere muy rápidamente a la proteína, y la velocidad del sistema cae a cero, con los eventos de paso que ocurren bajo fuerza constante hasta el final de la carrera. La fuerza se cambia de la dirección positiva a la negativa por el sistema de retroalimentación, que cambia la dirección de la fuerza cuando el talón alcanza el borde del rango de oscilación establecido por el usuario.

Cuando la miosina se une y desplaza el filamento hacia la dirección positiva, empuja la cuenta hacia el borde superior del rango de oscilación. Si esto sucede bajo fuerza de asistencia, la carrera de la miosina será interrumpida por la inversión de la dirección de la fuerza en el borde de oscilación, limitando la duración de la carrera a la amplitud de la oscilación de la mancuerna. La alineación precisa del sistema óptico es necesaria para lograr la resolución espacial y temporal óptima, mientras que una calibración precisa es necesaria para determinar con precisión los valores de las fuerzas aplicadas.

Esta técnica se ha adaptado para estudiar la búsqueda deslizante y dirigida de factores de transcripción en el ADN, así como las interacciones dinámicas entre proteínas de mecanotransducción que inducen sobre filamentos de microtúbulos.