Protocolo de disección automatizado para el enriquecimiento tumoral en tejidos de bajo contenido tumoral
March 29th, 2021
La anotación digital con disección automatizada de tejidos proporciona un enfoque innovador para enriquecer el tumor en casos de bajo contenido tumoral y es adaptable tanto a la parafina como a los tipos de tejido congelado. El flujo de trabajo descrito mejora la precisión, la reproducibilidad y el rendimiento y podría aplicarse tanto a la investigación como a los entornos clínicos.
El aislamiento o enriquecimiento de pequeñas regiones dispersas de interés a partir de FFPE, o material fresco congelado, se puede lograr con disección automatizada de manera más rápida y eficiente que con los métodos tradicionales. La extracción de material genómico de FFPE, o tejido fresco congelado, es un requisito para muchos laboratorios de investigación clínica y traslacional. La disección automatizada llena un vacío significativo entre la macrodisección y la microdisección de captura láser.
Para comenzar, anote las imágenes de diapositivas escaneadas para las regiones tumorales de interés, utilizando una plataforma de visualización proporcionada por el proveedor o un visor de código abierto. Coloque el portaobjetos de tejido de muestra no teñido en el escenario en la primera a la cuarta posición de la diapositiva cuando utilice una referencia de diapositiva digital. Cree un trabajo de fresado utilizando el software de disección automatizada de tejidos abriendo la lista de trabajos, luego seleccione Crear nuevo trabajo e ingrese el ID de caso y el nombre para ingresar el nombre del trabajo.
Vaya a Grosor y seleccione grosor de sección con la pestaña de flecha hacia arriba o hacia abajo. Luego, vaya a Preparación de tejidos y seleccione Parafinado o Desparafinado. Seleccione Imagen de referencia"Desde archivo e Importar imagen.
A continuación, seleccione el archivo que desea importar desde el menú desplegable como referencia digital. Escanee el escenario seleccionando el botón "Etapa de escaneo" en la esquina inferior derecha para capturar cada diapositiva de tejido de muestra en la primera a la cuarta posición. Para la referencia en el escenario, arrastre el cuadro para crear un área rectangular sobre el tejido y seleccione la burbuja circular debajo del área rectangular para capturar la imagen de referencia del escenario.
Copie este campo rectangular en las diapositivas de tejido de muestra restantes en las posiciones de la segunda a la cuarta diapositiva seleccionando la opción de copia en la esquina superior derecha de la imagen de referencia. Luego, alinee y cambie el tamaño según sea necesario. Para la imagen de referencia digital, superponga la imagen en el área rectangular seleccionada.
Luego, cambie el tamaño y alinee la referencia digital bruscamente, en curso, haga zoom, para que coincida mejor con el tamaño y la posición sobre el tejido de la muestra. Copie este campo rectangular en las diapositivas de tejido de muestra restantes en las posiciones de la segunda a la cuarta diapositiva seleccionando la opción de copia en la esquina superior derecha de la imagen de referencia. Luego, alinee y cambie el tamaño según sea necesario.
Seleccione el botón "Etapa de escaneo" en la esquina inferior derecha para pasar al paso de ajuste fino. Seleccione la posición de la primera etapa y el icono de la herramienta Transformar en la barra de herramientas de la derecha para realizar ajustes finos de alineación y zoom de la referencia para que coincida mejor con la superposición de diapositivas de muestra. Utilice la referencia a la barra deslizante de muestra en la parte inferior de la pantalla, alternando entre la referencia y las imágenes de muestra.
Y la función de acercar y alejar para ajustar y lograr la alineación de cada posición de la diapositiva. Una vez que se logre la superposición de muestra óptima, dibuje las designaciones de la ruta de fresado en la parte coloreada de la imagen de referencia enmascarada seleccionando el icono de la herramienta selector de color en la barra de herramientas de la derecha. Dibuje los trazados de fresado en las diapositivas de muestra seleccionando el botón Obtener anotaciones en la esquina inferior derecha de la pantalla.
Capture y recoja la región anotada de interés con cuatro o menos puntas de fresado cuando se calcule la trayectoria de fresado. El uso de la punta de fresado en la esquina superior izquierda se calcula en función del área cubierta y el tamaño de la punta seleccionada. El tamaño de la punta se puede cambiar debajo de la flecha de la punta de fresado, y el uso de la punta se volverá a calcular.
Cuando se selecciona el trazado de fresado en la primera posición de diapositiva, se copiará en las posiciones de deslizamiento restantes. Seleccione el botón "Etapa de configuración" en la esquina inferior derecha de la pantalla para cargar rápidamente las puntas de fresado de los tubos de recolección en su designación adecuada en el escenario. Llene el depósito con tres mililitros de tampón de disección apropiado para el tipo de tejido y para la extracción de ácido nucleico aguas abajo.
Luego, seleccione el botón Diseccionar en la esquina inferior derecha de la pantalla. Después de la disección automatizada, retire los tubos de recolección y las diapositivas de muestra diseccionadas del escenario. Coloque los tubos de recogida en el bastidor de tubos y las correderas en el bastidor de diapositivas.
La formalina teñida de H&E, la parafina fija incrustada y las secciones de hígado de ratón frescas congeladas que contienen cáncer colorrectal metastásico en xenoinjertos se escanearon en una imagen de diapositiva completa con un aumento de 20x, y se utilizaron como diapositivas de referencia. Las diapositivas de referencia teñidas de H&E fueron anotadas y enmascaradas digitalmente para las regiones tumorales para la disección y la extracción de ácido nucleico. Las diapositivas de muestra post-diseccionadas fueron teñidas por H&E para confirmar las áreas de disección en diapositivas de 10 micrómetros y 20 micrómetros.
Las métricas capturadas demostraron el éxito de la disección automatizada y la extracción de ácidos nucleicos. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que lograr una superposición relativamente precisa de anotaciones en las diapositivas no manchadas es importante para aislar las áreas de interés.
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Visión general
Este artículo presenta un método para la anotación digital combinada con disección automatizada de tejidos para mejorar el enriquecimiento tumoral en muestras con bajo contenido tumoral. Este flujo de trabajo innovador es adaptable tanto para tipos de tejidos parafinados como congelados, mejorando la precisión y el rendimiento para aplicaciones de investigación y clínicas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Patología
- Investigación clínica
Antecedentes
- El aislamiento de pequeñas regiones de interés de muestras de tejido es crucial para el análisis genómico.
- Los métodos de disección tradicionales suelen ser lentos y menos eficientes.
- La disección automatizada cierra la brecha entre la disección macro y la disección micro de captura láser.
- La anotación digital permite una selección precisa de las regiones tumorales.
Propósito del estudio
- Mejorar la eficiencia del enriquecimiento tumoral a partir de muestras de tejido.
- Proporcionar un método reproducible aplicable en diversos entornos.
- Facilitar la extracción de material genómico para fines de investigación y clínicos.
Métodos utilizados
- Anotación digital de imágenes de diapositivas escaneadas para regiones tumorales.
- Software de disección automatizada de tejido para crear trabajos de fresado.
- Utilización de diapositivas de tejido muestra sin teñir para la disección.
- Implementación de una plataforma de visualización proporcionada por el proveedor o de código abierto.
Principales resultados
- La disección automatizada reduce significativamente el tiempo en comparación con los métodos tradicionales.
- El flujo de trabajo mejora la precisión de la identificación de regiones tumorales.
- Es adaptable tanto a tejidos FFPE como a tejidos frescos congelados.
- El método muestra potencial tanto para aplicaciones clínicas como de investigación.
Conclusiones
- La anotación digital con disección automatizada es un enfoque prometedor para el enriquecimiento tumoral.
- Este método mejora la eficiencia general y la reproducibilidad del análisis de tejidos.
- Tiene una amplia aplicabilidad en entornos de investigación clínica y traslacional.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Automated dissection for tumor enrichment in low tumor content tissues addresses a critical bottleneck in generating high-quality nucleic acid for downstream genomic assays. By reducing user-dependent variability and increasing throughput, this protocol enhances predictive confidence and reproducibility at the interface of discovery and translational research. Its integration supports risk-adjusted decision-making and portfolio advancement in oncology-focused R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise isolation of tumor regions, supporting robust target validation in heterogeneous tissue samples.
- Reduces biological ambiguity by improving the purity of input material for molecular analyses.
- Facilitates confident hypothesis testing by minimizing contamination from non-tumor tissue.
Screening & Assay Development
- Prepares enriched samples suitable for standardized downstream assays such as next generation sequencing.
- Improves assay reproducibility by automating tissue selection and dissection steps.
- Supports scalable workflows by increasing throughput and reducing slide usage.
Translational & Preclinical Research
- Aligns sample preparation with requirements for translational biomarker discovery and validation.
- Ensures continuity from tissue acquisition to genomic data generation in preclinical models.
- De-risks translational studies by providing high-quality, tumor-enriched nucleic acid inputs.
Pipeline & Workflow Integration
This automated dissection protocol fits between tissue acquisition and nucleic acid extraction, enabling reliable sample preparation for sequencing and molecular profiling in both discovery and translational workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven studies by enabling accurate region-of-interest isolation from complex tissues.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative enrichment suitable for high-throughput sequencing assays.
- Analytics: Provides collection metrics and post-harvest confirmation to validate sample quality and enrichment success.
- Translational Research: Bridges preclinical and clinical sample processing with standardized, scalable enrichment methods.
- Enterprise Reuse: Offers a platform-agnostic capability adaptable to various tissue types and research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in molecular analyses.
- Operational Value: Standardizes tissue enrichment, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions by ensuring high-quality input for downstream assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by reducing sample-related variability in genomic studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in digital pathology annotation and automated dissection software operation.
- Needs access to compatible imaging, annotation, and milling instrumentation.
- Demands cross-team standardization of annotation and dissection parameters for reproducibility.
- Adaptable to both FFPE and fresh frozen tissues from animal or human sources.
- Dependent on accurate overlay and alignment of digital annotations for optimal enrichment.
