Pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas de la incorporación de deuterio en una sola bacteria

Este protocolo presenta un ensayo rápido de prueba de susceptibilidad antimicrobiana (AST) dentro de las 2,5 h mediante imágenes de dispersión Raman estimuladas por células individuales del metabolismo de D₂O. Este método se aplica a las bacterias en la orina o en el entorno sanguíneo completo, que es transformador para la AST fenotípica unicelular rápida en la clínica.

Las pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana se pueden obtener dentro de las 2,5 horas en orina y sangre, lo que se considera una reducción tremenda en el tiempo de análisis en comparación con el método convencional de microdilución en caldo. Puede monitorear la actividad metabólica bacteriana en un entorno complejo, como la sangre total. Para comenzar, verifique la concentración bacteriana de las muestras midiendo la densidad óptica con un fotómetro a una longitud de onda de 600 nanómetros.

Para alcanzar una concentración celular final de ocho veces 10 a la quinta unidad formadora de colonias, o UFC, por mililitro, diluya la solución bacteriana utilizando el medio MHB normal sin deuterio. Después de mezclar las células bacterianas por vórtice, retire 300 alícuotas de microlitros de la solución bacteriana en siete microtubos de 1,5 mililitros y una alícuota de 600 microlitros de la solución bacteriana en un microtubo de 1,5 mililitros. Luego agregue 4.8 microlitros de la solución madre de antibióticos en el microtubo que contiene 600 microlitros de la solución bacteriana para lograr la concentración final de antibióticos de ocho microgramos por mililitro.

Agregue 300 microlitros de la solución bacteriana con antibiótico a una alícuota de 300 microlitros de la solución bacteriana sin antibiótico para lograr una solución diluida doble con la concentración final de antibióticos de cuatro microgramos por mililitro. Repita la doble dilución en serie de los antibióticos de prueba hasta que se alcance la concentración más baja de 0,25 microgramos por mililitro. Deseche 300 microlitros de la solución del último microtubo.

Asigne un tubo sin antibióticos al control positivo con tratamiento con deuterio y al control negativo sin deuterio. Incubar la alícuota bacteriana con el medio antibiótico que contiene MHB durante una hora. Mientras tanto, prepare una dilución seriada de antibióticos con medio MHB que contenga 100% de deuterio con los mismos gradientes de concentración descritos anteriormente.

Después de una hora de incubación, agregue 700 microlitros de antibiótico diluido en serie con medio MHB que contiene deuterio al 100% a los 300 microlitros de bacterias pretratadas con antibióticos en la misma concentración de antibiótico. Homogeneiza la mezcla pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Agregue 700 microlitros de medio libre de antibióticos 100% que contenga MHB a 300 microlitros de bacterias libres de antibióticos como control positivo.

Agregue 700 microlitros de medio MHB sin antibióticos al 0% que contiene MBH a 300 microlitros de bacterias libres de antibióticos como control negativo. Incubar todos los microtubos a 37 grados centígrados y 200 rotaciones por minuto durante 30 minutos. Después de la incubación, centrifugar el mililitro de muestra bacteriana tratada con antibiótico y deuterio a 6, 200 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Luego lave el pellet dos veces con agua purificada. Fijar las muestras en solución de formalina al 10% volumen por volumen, y almacenarlas a cuatro grados centígrados. Compruebe la concentración de Escherichia coli de la muestra bacteriana recién preparada midiendo la densidad óptica con un fotómetro a una longitud de onda de 600 nanómetros.

Para imitar las muestras clínicas de infección del tracto urinario, aumente la muestra de Escherichia coli en 10 mililitros de muestras de orina no identificadas para alcanzar una concentración final de 10 a seis UFC por mililitro. Filtrar la orina con púas de Escherichia coli usando un filtro de cinco micras y dividir la solución bacteriana filtrada en alícuotas de 300 microlitros en siete microtubos de 1,5 mililitros y una alícuota de 600 microlitros en un microtubo de 1,5 mililitros. Realizar tratamiento de incorporación de deuterio en presencia de antibióticos como se describió anteriormente.

Para imitar las muestras clínicas de infección del torrente sanguíneo, pinche Pseudomonas aeruginosa en un mililitro de sangre humana no identificada para alcanzar una concentración final de 10 a la sexta UFC por mililitro. Para lisar la sangre, agregue nueve mililitros de agua purificada estéril. Filtre la sangre con púas de Pseudomonas aeruginosa usando un filtro de cinco micras.

Luego recolecte las bacterias de la muestra filtrada a un volumen de un mililitro por centrifugación a 6, 200 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, divida la solución sanguínea con púas de Pseudomonas aeruginosa en alícuotas de 300 microlitros en siete microtubos de 1,5 mililitros y una alícuota de 600 microlitros de la solución bacteriana en un microtubo de 1,5 mililitros, y realice el tratamiento de incorporación de deuterio en presencia de antibióticos como se describió anteriormente. Para la preparación de la muestra, lave un mililitro de solución fija de bacterias con agua purificada y centrifugar la solución de bacterias lavadas a 6, 200 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Retire el sobrenadante y enriquezca la solución bacteriana a unos 20 microlitros con agua esterilizada. Deposite la solución bacteriana en un vidrio de cubierta recubierto de poli-L-lisina, intercale con otro vidrio de cubierta y selle la muestra. En el microscopio SRS, un láser de femtosegundo sintonizable con una tasa de repetición de 80 megahercios proporciona la bomba y los láseres de excitación de Stokes.

El haz de Stokes es modulado por un modulador acústico-óptico a 2,4 megahercios. Los dos haces se combinan colicasi a través de un espejo dicroico. Luego, la bomba y los haces de Stokes se dirigen a un microscopio de escaneo láser construido en laboratorio con un espejo Galvo 2D para escaneo láser.

Un objetivo de agua 60x enfoca los láseres a la muestra y un condensador de aceite recoge la señal de la muestra. Se utilizan dos filtros para filtrar el haz de Stokes, mientras que el haz de la bomba es detectado por un fotodiodo, después de lo cual la señal Raman estimulada es extraída por un amplificador de bloqueo. Usando el software de control, ingrese y ajuste la longitud de onda de la bomba a 852 nanómetros.

Ajuste la frecuencia vibratoria de C a D a 2, 168 número de onda para obtener imágenes de bacterias usando un microscopio SRS. Mida la potencia del láser con un medidor de potencia. Ajuste la potencia del láser de la bomba en la muestra a ocho milivatios, y la potencia del láser Stokes en la muestra a 50 milivatios ajustando la placa de media onda delante de la salida del láser.

Coloque la muestra estándar DMSO d6 en la etapa de muestra y use un objetivo de inmersión en agua 60x para enfocar la bomba y los láseres Stokes en la muestra. Ajustando los tornillos de los espejos de reflexión, alinee espacialmente la bomba y los haces de Stokes y dirija los dos haces a un microscopio vertical equipado con un sistema de espejo Galvo 2D para escaneo láser. En el panel de control del software, configure cada imagen SRS para que contenga 200 por 200 píxeles y el tiempo de permanencia de píxeles en 30 microsegundos.

El tiempo total de adquisición de una imagen es de alrededor de 1,2 segundos. Establezca el tamaño del paso en 150 nanómetros, por lo que el tamaño de la imagen es de aproximadamente 30 por 30 micrómetros cuadrados. Después de optimizar el sistema, saque la muestra estándar y coloque la muestra bacteriana en la etapa de muestra bajo el objetivo de inmersión en agua 60x.

Inicie la obtención de imágenes SRS de muestras bacterianas. Imagine al menos tres campos de visión para cada muestra. El efecto del tiempo de incubación en la incorporación de deuterio se mide mediante microespectroscopia Raman espontánea en las regiones CD y CH.

La gráfica de la relación de intensidad de CD sobre CH sobre el tiempo de incubación de deuterio para bacterias individuales mostró un aumento de la intensidad de CD sobre CH durante el tiempo de incubación de cero a 180 minutos. Las imágenes de SRS de Pseudomonas aeruginosa se realizaron tras la incubación con gentamicina y deuterio al 70%. El análisis estadístico cuantitativo adicional mostró que las señales de EC de las bacterias eran significativamente más bajas a dos microgramos por mililitro, o una concentración de gentamicina más alta que sin tratamiento con gentamicina.

El umbral de intensidad de corte en 0,60 concluyó que Pseudomonas aeruginosa se inhibió metabólicamente a dos microgramos por mililitro y concentraciones más altas de gentamicina. Se determinó que la CMI SC para Pseudomonas aeruginosa contra gentamicina en un medio MHB normal era de dos microgramos por mililitro, que estaba dentro del rango de diferencia de un pliegue con CMI de cuatro microgramos por mililitro determinado por el método de microdilución en caldo. Las pruebas rápidas de susceptibilidad antimicrobiana, o AST, de muestras de orina con púas de Escherichia coli se llevaron a cabo mediante imágenes de SRS.

Se determinó que la SC-MIC para la muestra de orina con púas de Escherichia coli contra amoxicilina era de cuatro microgramos por mililitro, que tiene la misma lectura de susceptibilidad que la CMI de ocho microgramos por mililitro mediante el método convencional de dilución en caldo para Escherichia coli pura en medio MHB normal. La aplicabilidad de AST rápida de Pseudomonas aeruginosa pinchada en sangre humana se investigó mediante imágenes SRS. La intensidad de CD de la imagen SRS a 2,168 por ciento estuvo dominada por señales bacterianas originadas por la incorporación metabólica de deuterio de bacterias vivas.

Se determinó que la CMI SC para Pseudomonas aeruginosa en sangre era de dos microgramos por mililitro, lo que concuerda bien con el resultado de la CMI estándar convencional para Pseudomonas aeruginosa en el medio de crecimiento normal. El número de células bacterianas utilizadas para las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana se mantiene en aproximadamente cinco veces 10 a la quinta unidad formadora de colonias por mililitro, según lo recomendado por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio. Una mayor concentración de bacterias puede conducir a un aumento en la concentración inhibitoria mínima.

La combinación de la identificación in situ de patógenos y el diagnóstico rápido de pruebas de susceptibilidad antimicrobiana podría ser de gran potencial para su traducción a una clínica que permita la identificación a tiempo de los agentes antimicrobianos apropiados para un tratamiento preciso.