Un modelo quirúrgico modificado de isquemia de la extremidad posterior en ApoE-/- Ratones que usan una incisión en miniatura
13 de mayo de 2021
Este artículo demuestra un enfoque quirúrgico eficiente para establecer la isquemia aguda en ratones con una pequeña incisión. Este enfoque puede ser aplicado por la mayoría de los grupos de investigación sin ninguna actualización de laboratorio.
Lo que presentamos hoy es un método simplificado modificado y quirúrgicamente eficiente, para establecer la isquemia de las extremidades posteriores en ratones ApoE. Este método se puede implementar en cualquier instalación de animales. La principal ventaja del método sinovial es una baja invasividad, utilizando una incisión de menos de cinco milímetros.
El método tiene un hof de aprendizaje. Por lo tanto, aconsejamos practicar en modelos microquirúrgicos antes de trabajar en los animales, que se incluirán en el análisis final. El método será demostrado por Kaixuan Yan, un doctor en medicina y el estudiante de mi laboratorio.
Comience por preparar el equipo y las herramientas necesarias para la cirugía. Después de administrar la anestesia al ratón, aplique ese ungüento en los ojos para prevenir la sequedad. Luego coloque el mouse en una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal central a aproximadamente 37 grados centígrados.
Usando un hisopo de algodón y una crema depilatoria, elimine cuidadosamente el vello de la piel de la extremidad posterior en el lado derecho. Coloque el ratón en posición supina sobre la almohadilla térmica bajo un microscopio de disección. Use alcohol para desinfectar la piel y limpie con el algodón lejos del lado de la planta de la incisión.
Usando las pinzas puntiagudas y las tijeras quirúrgicas se realiza una incisión de aproximadamente tres a cuatro milímetros en el centro de la región inguinal. Retire cuidadosamente el tejido graso subcutáneo con la ayuda de fórceps puntiagudos finos para exponer el haz neurovascular femoral proximal. Usando un hisopo de algodón humedecido con solución salina, mueva cuidadosamente la arteria femoral lejos del nervio femoral y la vena femoral.
Luego, usando la punta de una sutura 7.0, perfore cuidadosamente la membrana de la vaina femoral. Luego pase a 7-0 suturas absorbibles a través de la arteria femoral proximal y haga nudos dobles usando las tijeras de resortes. Posteriormente transecta la arteria femoral entre los dos lazos.
Pase la sutura absorbible 6-0 a través del borde inferior de la incisión y arrastre suavemente la incisión a la región del lado derecho de la rodilla de la extremidad posterior para exponer la arteria femoral distal. Mueva con cuidado el tejido subcutáneo a un lado para exponer el haz neurovascular. Diseccionar la arteria femoral de la vena femoral y el nervio femoral, y usar algodón para proteger el nervio.
Luego, usando la punta de una sutura 7.0, perfore la membrana de la vaina femoral. Pase dos suturas absorbibles 7-0 a través de la arteria femoral distal y haga nudos dobles usando las tijeras de resorte para transectar la arteria femoral entre dos lazos. Después, sutura la incisión con las suturas absorbibles 6-0.
Coloque el ratón en una almohadilla térmica en una jaula limpia y continúe monitoreando sus parámetros vitales hasta la recuperación. Determinar el éxito de la doble ligadura de la arteria femoral o DLFA al día siguiente a través de una resonancia magnética. Antes del procedimiento DLFA, los pesos de los ratones oscilaban entre 29,6 y 38,0 gramos.
Siete días después de la cirugía DLFA, los pesos variaron de 26.5 a 34.1 gramos, significativamente más bajos que los pesos pre-DLFA. Las regiones proximal y distal de la AF derecha no mostraron perfusión. Los resultados de la escala de Tarlov disminuyeron significativamente un día después de la cirugía.
Aunque aumentaron lentamente durante los días siguientes, todavía fueron más bajos que la línea de base hasta el día siete. Las patas de las extremidades posteriores isquémicas en siete ratones no pudieron estirarse naturalmente en comparación con el lado contralateral. Además, cuatro de los ratones exhibieron una ligera decoloración de las patas en comparación con el lado contralateral.
La tinción H&E del músculo GM derecho reveló miofibras que exhibían necrosis isquémica irregular, donde las células satélite proliferantes habían reemplazado a las miofibras necróticas y se distribuían en una masa o con una dispersión regular. Las miofiberes que exhibían infiltración inflamatoria por macrófagos multinucleados habían perdido sus características morfológicas normales, con muy pocas miofibras regeneradas presentes. Las secciones transversales de estos miofibras regeneradas eran redondas.
El citoplasma se tiñó de rojo y un núcleo pequeño o múltiples núcleos se localizaron en el centro. Sin embargo, este tipo de patrón inflamatorio no se observó en el GM izquierdo. La tinción de anticuerpos CD31 realizada para observar la densidad microvascular, indicó que las extremidades posteriores isquémicas exhibieron significativamente más densidad microvascular que el lado no isquémico. Lo más importante es la disección de la arteria femoral.
El operador debe tener experiencia en técnicas microquirúrgicas, así como estar familiarizado con la anatomía de las extremidades posteriores del ratón. En principio, este método también podría utilizarse para estudiar la lesión por isquemia-reperfusión en la pierna. Por lo tanto, la arteria se puede ocluir con una abrazadera de vaso blando antes de permitir la reperfusión.
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Descripción general
Este artículo presenta una técnica quirúrgica simplificada y eficiente para inducir isquemia aguda de extremidad inferior en ratones ApoE mediante una incisión mínimamente invasiva. El método está diseñado para ser accesible para la mayoría de los grupos de investigación sin necesidad de mejoras especializadas en el laboratorio.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Cirugía vascular
- Modelado de isquemia
- Modelos de ratón en investigación biomédica
Antecedentes
- La isquemia aguda es una afección crítica para estudiar problemas vasculares.
- Los métodos anteriores solían implicar incisiones más grandes y una mayor invasividad.
- Esta técnica minimiza el trauma y facilita la recuperación.
Métodos Utilizados
- La disección quirúrgica de la arteria femoral
- Los ratones ApoE como modelo biológico
- El uso de suturas absorbibles para la ligadura
Resultados principales
- El modelo presenta una pérdida significativa de peso tras la cirugía y una función alterada de las extremidades.
- El análisis histológico reveló necrosis isquémica y una estructura muscular modificada.
- La densidad microvascular aumentó en las extremidades isquémicas, lo que indica una respuesta a la condición inducida.
Conclusiones
- Este método induce eficazmente isquemia en la extremidad trasera, proporcionando una plataforma para investigaciones posteriores sobre la lesión por isquemia-reperfusión.
- La técnica es relevante para investigadores que estudian la patología vascular y muscular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo quirúrgico modificado permite la inducción eficiente de isquemia en las extremidades posteriores de ratones ApoE-/- mediante una incisión mínimamente invasiva, lo que reduce el trauma quirúrgico y facilita la evaluación de la recuperación funcional. El enfoque posibilita la evaluación preclínica de la patología vascular y los mecanismos de isquemia-reperfusión en un modelo aterosclerótico relevante para la enfermedad. Proporciona una plataforma escalable y reproducible para la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en programas de descubrimiento de fármacos cardiovasculares.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en modelos de isquemia aterosclerótica utilizando ratones ApoE-/-.
- Valor operativo: Apoya la desactivación biológica mediante la inducción estandarizada de oclusión de la arteria femoral con mínima invasividad.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación del compromiso del blanco y la modulación de vías en modelos de isquemia de extremidad inferior.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para el ensayo: Genera resultados funcionales cuantificables mediante la puntuación en la escala de Tarlov y la oclusión arterial confirmada por resonancia magnética.
- Reproducibilidad: El tamaño consistente de la incisión (<5 mm) y la ligadura exitosa en todos los animales respaldan la estandarización del ensayo.
- Utilidad para cribado: Permite la evaluación confiable de compuestos en modelos de isquemia en extremidades posteriores con puntos finales histológicos y funcionales medibles.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Modela la isquemia en ratones ApoE-/-, un sistema clínicamente relevante para la enfermedad vascular aterosclerótica.
- Continuidad traslacional: Permite avanzar desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante métricas histológicas y de recuperación funcional.
- Reducción del riesgo mecanicista: Permite evaluar la respuesta inflamatoria y la remodelación microvascular como biomarcadores de la lesión isquémica.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la validación del blanco hasta las pruebas de eficacia preclínica en modelos de enfermedades vasculares.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en los mecanismos de lesión por isquemia-reperfusión.
- Tamizaje: Proporciona modelos isquémicos listos para ensayos con resultados funcionales y de imagen cuantitativos.
- Análisis: Permite la comparación de condiciones mediante la escala de Tarlov, la perfusión por RM, la pérdida de peso y la puntuación histológica.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica a través de la relevancia del modelo ApoE-/- y puntos finales alineados con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad quirúrgica reutilizable para estudios de patología vascular en diversos equipos de descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos mediante conocimientos mecanicistas sobre la necrosis isquémica y la infiltración inflamatoria.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad posibilitadas por una incisión mínima y pasos del procedimiento consistentes.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o interrupción mediante la reducción de la variabilidad biológica y una mayor fidelidad del modelo en contextos ateroscleróticos.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo mediante puntos finales funcionales e histológicos objetivos que respaldan los criterios de avance.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microcirugía y en la anatomía del miembro trasero del ratón.
- Necesita instrumentos de microcirugía, mantas térmicas, equipos de anestesia y microscopios de disección.
- Exige una estandarización entre los equipos en cuanto al tamaño de la incisión, la técnica de ligadura y los protocolos de monitoreo postoperatorio.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la anatomía vascular específica del modelo y la variabilidad fenotípica de ApoE-/-.
- Las limitaciones prácticas incluyen la dependencia de la habilidad del operador y la necesidad de validación funcional por imágenes en el periodo postoperatorio.
